CC BY
0
Клеточная иммунология
© Коллектив авторов, 2024
Бриллиантова В.В.1' 2, Котский М.А.1, Муравская М.П.1,
Ткачук Ю.В.1, Соколова О.Н.1, Бондаренко A.B.1, Козлитина О.В.1, 3,
Митин А.Н.4, Дроков М.Ю.5, Варлачев A.B.6, Донецкова А.Д.1, 3, 4 7
Оценка гемопоэтического химеризма у минипигов при индукции иммунной толерантности к васкуляризированному композитному аллотрансплантату
1 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт медицины труда имени академика Н.Ф. Измерова» Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, 105275, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация
3 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени H.H. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация
4 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация
5 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 125167, г. Москва, Российская Федерация
6 Фонд перспективных исследований, 121059, г. Москва, Российская Федерация
7 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский университет дружбы народов имени Патриса Лумумбы» Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, 117198, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Количественное определение химеризма после аллогенной трансплантации костного мозга (аТКМ) - один из основных методов оценки приживления алло-трансплантатов (в том числе при трансплантации васкуляризированных композитных комплексов тканей - BKA) от того же донора. Полный стабильный химеризм коррелирует с длительным приживлением донорских тканей. Многократные исследования химеризма в динамике необходимы для оценки эффективности трансплантации с возможностью последующей отмены иммуносупрессивной терапии.
Цель работы - оценить гемопоэтический химеризм у минипигов после аТКМ при индукции иммунной толерантности к BKA.
Материал и методы. Исследование проводили на минипигах гибридах пород Визенау и Вьетнамской вислобрюхой. Химеризм исследовали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на «0», «+14», «+21» и «+30» дни с использованием набора реагентов COrDIS PIG (ООО «ГОРДИЗ», Россия). Анализ результатов ПЦР проводили методом капиллярного электрофореза с использованием автоматического генетического анализатора (ABI PRISM 3500, Thermo Fisher Scientific, США). Полученные данные анализировали с использованием программного обеспечения GeneMapper (Thermo Fisher Scientific, США). Аллели оценивали по 15 микросателлитным маркерам для каждого образца крови минипига, высчитывали процентное содержание аллелей донора и реципиента при анализе химеризма.
Результаты. Было исследовано 9 пар экспериментальных животных (донор-реципиент). У 5 реципиентов на +30 сутки после аТКМ в аспирате костного мозга определялись только собственные аллели. У 4 реципиентов наблюдался смешанный донорский химеризм. Методика показала чувствительность не менее 5 % в модельном эксперименте. Погрешность определения зависит от количества взятых в анализ локусов и не превышает 10 % при содержании аллелей донора 50 % в исследуемом образце.
Заключение. Определение донорского химеризма у минипигов после аТКМ при индукции иммунной толерантности к BKA продемонстрировало динамику приживления ТКМ и максимальную экспансию донорскими клетками костного мозга реципиента до 80-90 %. Метод определения химеризма с помощью STR-локусов обладает высокой чувствительностью и может быть использован в модельных экспериментах с минипигами.
Для корреспонденции
Бриллиантова Варвара Витальевна -научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-0079-7761
Ключевые слова: аллогенная трансплантация костного мозга; гемопоэтический химеризм; короткие тандем-ные повторы; STR; минипиги
Статья получена 29.05.2024. Принята в печать 01.08.2024.
Для цитирования: Бриллиантова В.В., Котский М.А., Муравская М.П., Козлитина О.В., Ткачук Ю.В., Соколова О.Н., Бондаренко A.B., Варлачев A.B., Дроков М.Ю., Митин А.Н., Донецкова А.Д. Оценка гемопоэтичес-кого химеризма у минипигов при индукции иммунной толерантности к васкуляризированному композитному аллотрансплантату. Иммунология. 2024; 45 (4): 446-455. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-4-446-455
Финансирование. Исследование проведено в рамках работы Целевой поисковой лаборатории трансляционной медицины Фонда перспективных исследований (договор о создании и деятельности ЦПЛ № 6/218/2021-2022цпл). Работа А.Д Донецковой выполнена при поддержке Программы стратегического академического лидерства ФГАОУ ВО РУДН им. П. Лумумбы Минобрнауки России.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Варлачев A.B., Дроков М.Ю., Митин А.Н.; кондиционирование и ведение минипигов, сбор материала - Котский М. А., Муравская М.П., Козлитина О.В., Ткачук Ю.В., Соколова О.Н., Бондаренко A.B.; анализ микросателлитных маркеров - Бриллиантова В.В.; написание и редактирование текста - Бриллиантова В.В., Донецкова А.Д.
Brilliantova V.V.1 2, Kotskiy M.A.1, Muravskaya M.P.1, Tkachuk Yu.V.1, Sokolova O.N.1, Bondarenko A.V.1, Kozlitina O.V.1, 3, Mitin A.N.4, Drokov M.Yu.5, Varlachev A.V.6, Donetskova A.D.1, 3, 4, 7
Assessment of hematopoietic chimerism in minipigs during the induction of immune tolerance
to vascularized composite allograft
1 N.F. Izmerov Research Institute of Occupational Health, Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation, 105275, Moscow, Russian Federation
2 Dmitry Rogachev National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Ministry of Health of the Russian Federation, 117997, Moscow, Russian Federation
3 N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Ministry of Health of the Russian Federation, 117997, Moscow, Russian Federation
4 National Research Center - Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency, 115522, Moscow, Russian Federation
5 National Medical Research Center for Hematology, Ministry of Health of the Russian Federation, 125167, Moscow, Russian Federation
6 Advanced Research Foundation, 121059, Moscow, Russian Federation
7 Peoples' Friendship University of Russia named after Patrice Lumumba, Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation, 117198, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. Quantitative determination of chimerism after allogeneic bone marrow transplantation (aBMT) is one of the main methods for assessing the possibility of engraftment of allografts (including transplantation of vascularized composite tissue complexes - VCA) from the same donor. Complete stable chimerism correlates with long-term engraftment of donor tissues. Dynamic studies of chimerism are necessary to assess the effectiveness of transplantation with further withdrawal of immunosuppressive therapy.
Aim - to study hematopoietic chimerism in minipigs after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (aHSCT) during the induction of immunological tolerance to VCA.
Material and methods. The study was performed on minipig hybrids of the Wisenau and Vietnamese pot-bellied pig. The chimerism was detected using the polymerase chain reaction (PCR) on days «0», «+14», «+21» and «+30» using the COrDIS PIG reagent kit (GORDIZ, Russia). PCR results were studied by capillary electrophoresis using an automatic genetic analyzer (ABI PRISM 3500 Thermo Fisher Scientific, USA). The obtained data were analyzed using GeneMapper software (Thermo Fisher Scientific, USA). Alleles were assessed using 15 microsatellite markers for each minipig blood sample, and the percentage of donor and recipient alleles was calculated.
For correspondence
Varvara V. Brilliantova -Researcher of the Molecular Biology Lab. of Dmitry Rogachev NMRC PHOI, MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-0079-7761
Results. 9 pairs of experimental animals (Donor-Recipient) were studied. In 5 recipients, on day +30 after aBMT, only their own alleles were determined in the bone marrow aspirate. Mixed donor chimerism was observed in 4 recipients. Determination of the sensitivity of the technique showed a sensitivity of at least 5 % in a model experiment. The determination error depends on the number of loci taken for analysis and does not exceed 10 % when the content of donor alleles is 50 % in the test sample.
Conclusion. Determination of donor chimerism in minipigs after aBMT during the induction of immunological tolerance to VCA demonstrated the dynamics of bone marrow transplant engraftment and the maximum expansion of the recipient's bone marrow by donor cells up to 80-90 %. The method for determining chimerism using STR loci is highly sensitive and can be used in model experiments with minipigs.
Keywords: allogeneic bone marrow transplantation; hematopoietic chimerism; short tandem repeats; STR; minipigs
Received 29.05.2024. Accepted 01.08.2024.
For citation: Brilliantova V.V., Kotskiy M.A., Muravskaya M.P., Kozlitina O.V., Tkachuk Yu.V., Sokolova O.N., Bondarenko A.V., Varlachev A.V., Drokov M.U., Mitin A.N., Donetskova A.D. Assessment of hematopoietic chime-rism in minipigs during the induction of immune tolerance to vascularized composite allograft. Immunologiya. 2024; 45 (4): 446-55. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-4-446-455 (in Russian)
Funding. The study was performed within the framework of the Translational Medicine Laboratory of the Advanced Research Foundation (Agreement No. 6/218/2021-2022cpl). Donetskova A.D. was supported by the Strategic Academic Leadership Program from RUDN University named after P. Lumumba, MSHE of Russia.
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors' contribution. Concept and design of the study - Varlachev A.V., Drokov M.Yu., Mitin A.N.; conditioning and maintaining minipigs, collection of material - Kotskiy M.A., Muravskaya M.P., Kozlitina O.V., Tkachuk Yu.V., Sokolova O.N., Bondarenko A.V.; analysis of microsatellite markers - Brilliantova V.V.; writing and editing of the article - Brilliantova V.V., Donetskova A.D.
Введение
В настоящее время определение донорского химе-рнзма является важным диагностическим показателем, позволяющим оценить эффективность проведенной аллогенной трансплантации костного мозга (аТКМ) при терапии онкогематологических заболеваний, аплазий кроветворения и врожденных иммунодефицитов [1, 2]. Определение типа кроветворения у больного после аТКМ имеет большое значение для изучения механизмов приживления и отторжения, посттрансплантационной толерантности, реакций «трансплантат против хозяина» (РТПХ) и «трансплантат против лейкоза» (РТПЛ). Важно не только обнаружение гемопоэтических клеток донора, но и оценка их количества по отношению к клеткам реципиента: снижение количества клеток донорского происхождения в периферической крови или костном мозге может свидетельствовать о рецидиве заболевания или отторжении аллотрансплантата.
Для исследования химеризма у пациентов после аТКМ используются цитогенетические методы, флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), определение химеризма по Y-хромосоме, изучение аллотипов иммуноглобулинов, различий по системе AB0 и Rh-фактору [3]. Все эти методы имеют ряд преимуществ и недостатков (например, ограничения при использовании в случаях, когда между донором и реципиентом нет различий по полу или других индивидуальных особенностей хромосом, различий по группе крови и пр.). В последние годы для оценки гемопоэтического химеризма все шире используются молекулярно-генетические методы: тех-
нология рестрикции фрагментов линейного полиморфизма - restriction fragment length polymorphism, RFLP;
использование в качестве мишени генетических последовательностей, отличающихся числом тандемных повторов - мини-сателлитов (variable number tandem repeats, VNTR: повторяющихся последовательностей ДНК размером от 10 до 70 пар нуклеотидов) и микросателлитов (коротких тандемных повторов - short tandem repeats, STR: последовательностей от 2 до 9 пар нуклеотидов); секвенирование нового поколения (next-generation sequencing - NGS); систему полиморфизмов класса Insertion/Deletion (биаллельный полиморфизм, характеризующийся присутствием или отсутствием последовательности длиной в 5-15 пар нуклеотидов) с детекцией методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) [4-7].
Исследование химеризма с помощью VNTR и STR проводится методом ПЦР, при этом определение продукта амплификации может быть выполнено различными путями: с помощью гель-электрофореза (окраска этидиума бромидом), капиллярного электрофореза, обработки серебром, флуоресцентной окраски, авторадиографии.
Одним из наиболее распространенных методов определения химеризма является система STR-ПЦР с детекцией продукта амплификации при помощи капиллярного электрофореза. На основе этой методики существуют коммерческие наборы, зарегистрированные для клинического применения. Метод не требует большого количества исследуемого материала, позволяет оценивать химе-ризм количественно с чувствительностью до 2-5 % [8].
День
I I I I \ I
ТОТ ЛОТ аТКМ+ВКА
I I
-1 -2 0
ДОНОР
Рис. 1. Схема проведения эксперимента
I
I I I
14
30
^ CTLA4-lg (абатацепт) ^ Анти-IL-6R-МкАт (тоцилизумаб) ^ Метилпреднизолон
РЕЦИПИЕНТ
Число трансплантаций васкуляризированных композитных аллотрансплантатов (BKA) в мире имеет тенденцию к росту после первой успешной трансплантации в 1998 г. [9]. Обычно источник BKA - умерший донор, который чаще всего несовместим с реципиентом по генам главного комплекса гистосовместимости (МНС). При таких трансплантациях особенно важно развитие иммунной толерантности к трансплантату, которую можно индуцировать с помощью смешанного или полного гемопо-этического химеризма - состояния, при котором BKA распознается как «свое» и не отторгается [10]. В настоящее время все больше биомедицинских исследований в области трансплантологии связано с попытками увеличить продолжительность и улучшить качество жизни реципиентов в отдаленный период после аллотрансплантации, «уйти» от тяжелой медикаментозной иммуносупрессии с помощью новых альтернативных подходов к созданию трансплантационной толерантности [11].
Разработки, апробированные на экспериментальных моделях крупных животных, служат промежуточным, связующим звеном перед внедрением новых эффективных методов лечения в клинике. В частности, исследования, проводимые на минипигах (экспе-
риментальных животных, близких по своей анатомии и физиологии к человеку), помогают понять иммунологию индукции толерантности при аллотрансплантации с несовпадением по МНС, а также подобрать оптимальные малотоксичные для реципиента протоколы индукции толерантности с минимальным краткосрочным предварительным кондиционированием иммунодепре сс ант ами.
Цель настоящей работы - оценка гемопоэтического химеризма с помощью анализа локусов, содержащих 8ТЯ, у МНС-несовместимых минипигов после алло-генной трансплантации костного мозга при индукции иммунной толерантности к ВКА.
Материал и методы
Модель на лабораторных животных. Исследование проводилось на 18 МНС-несовместимых минипигах гибридах пород Визенау и Вьетнамской вислобрюхой в возрасте 4-8 мес массой до 30 кг, полученных из питомника лабораторных животных ООО «Кролинфо» (Россия). Все процедуры с экспериментальными животными проводили в соответствии с правилами лабораторной практики [12].
Таблица 1. Диапазоны размеров микросаттелитных маркеров
Локус Диапазон длин аллелей Аллели PIG7 Цвет метки
SW24 96-121 118/118 синий
S0101 197-216 212/214 синий
S038 154-174 167/167 синий
S005 205-248 227/251 синий
SW72 100-116 113/119 синий
S0090 244-251 246/246 синий
SW951 121-133 123/123 синий
SW936 80-117 96/108 зеленый
SW857 144-160 150/158 зеленый
S0355 243-277 247/247 зеленый
SW240 96-115 102/102 зеленый
S0228 222-249 226/232 зеленый
SW911 153-177 160/160 зеленый
S0227 231-256 232/232 зеленый
S0155 150-158 152/164 зеленый
~i j J j и i
i a ■ 4 In ■ ■ Sa и IT
"1 1 J± 1. ..J Jkb - m iß J» 'й- Ли ■ш i ; ... 'J Я Ш ш»
Рис. 2. Пример определения аллельных вариантов для каждого маркера с использованием программы ОепеМаррег 5
Кондиционирование минипигов проводили у-облучением согласно схеме из статьи Lellouch A.G. и соавт. [13] с некоторыми изменениями: облучение всего тела (ТОТ, день «-2») и тимуса (ЛОТ, день «-1»), использование блокаторов костимуляции (абатацепт), такролимуса и моноклональных антител к IL-6R (рис. 1). Радиационное облучение животных осуществлялось на базе ФГБУ «НИЦ «Курчатовский институт» на установке ГУТ-200М (Россия).
Сразу после пересадки BKA (фрагмента задней конечности) проводили аТКМ. Количество трансплантированных миелокариоцитов варьировало от 1 • 108 до 1 • 109 на 1 кг массы тела животного, жизнеспособность клеток была выше 98 % при окраске трипановым синим.
Химеризм определяли в образцах периферической крови животных и в аспиратах костного мозга. Забор материала производили в пробирки с ЭДТА до аТКМ и в течение 1 мес после аТКМ (на +14, +21 и +30 сутки).
Исследование химеризма. Выделение ДНК из крови минипигов проводили в соответствии с инструкцией к набору реагентов для выделения ДНК из клинического материала «ДНК-сорб-В» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора). Концентрация полученной ДНК при измерении на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США) составила 25-70 нг/мкл.
Химеризм оценивали методом ПЦР с помощью набора реагентов COrDIS PIG (ООО «ГОРДИЗ», Россия) для молекулярно-генетической характеристики свиней с целью анализа родства и ДНК-индивидуализации животных на основе мультиплексного ПЦР-ана-
лиза 15 локусов, содержащих микросателлиты (STR -short tandem repeats, короткие тандемные повторы). 15 анализируемых STR-локусов составляют стандартную панель маркеров, рекомендованную Международным обществом генетики животных (International Society of Animal Genetics - ISAG): S0005, S0090, S0101, S0155, S0227, S0228, S0355, S0386, SW24, SW240, SW72, SW857, SW911, SW936 и SW951.
Характеристика локусов представлена в табл. 1. Все эти локусы представляют собой тандемные динуклео-тидные повторы. Праймеры для ПЦР подобраны с учетом проведения амплификации всех 15 локусов в одной пробирке. Размер всех амплифицируемых ПЦР продуктов < 500 пар нуклеотидов (с учетом всех известных аллелей). Условия амплификации: 94 °С - 3 мин (95 °С -10 с, 57 °С - 30 с, 68 °С - 60 с) - 35 циклов; 68 °С - 6 мин 30 с; 20 °С - хранение.
Результаты ПЦР анализировали методом капиллярного электрофореза с использованием автоматического генетического анализатора с лазер-индуцированной флуоресцентной детекцией (ABI PRISM 3500, Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии с инструкцией, предоставляемой производителем. В наборе COrDIS PIG используется три флуоресцентных красителя, характеризующихся разными длинами волн эмиссии для возможности одновременной детекции в разных каналах флуоресценции. Праймеры мечены двумя флуоресцентными красителями, детектируемыми в каналах Blue, Green. Стандарт длины S550 мечен третьим флуоресцентным красителем и детектируется в отдельном канале Orange одновременно с продуктами ПЦР. Также каждая постановка содержала контрольный образец PIG7 (высокомолекулярная лиофилизированная ДНК свиньи с известным генотипом по всем исследуемым локусам). Для получения полного STR-профиля образца использовали 10 нг ДНК. Полученные данные анализировали с использованием программного обеспечения GeneMapper 5 (Thermo Fisher Scientific, США).
Первый этап определения химеризма - подбор информативных маркеров в паре «донор-реципиент». Для этого анализировали STR-локусы в образце донора и в образце реципиента до аТКМ (табл. 1).
Благодаря стандарту длины S550 и контрольному образцу ДНК PIG7 определяли размеры продуктов амплификации. Программа GeneMapper 5 позволяет определить аллельные варианты для каждого маркера (рис. 2)
Каждому маркеру на электрофореграмме может соответствовать один или два ПЦР-продукта, что соответствует гомо- и гетерозиготному состоянию локуса. Разница в длине аллелей обычно кратна 2, что отражает различия в количестве динуклеотидных повторов. Для корректного определения генотипа необходимо учитывать природу статтеров.
Статтеры - побочные продукты амплификации микро-сателлитных маркеров. Для динуклеотидных маркеров, к которым относятся все локусы набора COrDIS PIG, типичны статтеры размером -2 п.н. по отношению к основному продукту.
Таблица 2. Определение воспроизводимости метода. Среднее значение рассчитанного по трем локусам процента содержания аллелей донора в смеси ДНК. Погрешность определения увеличивается с увеличением процента содержания ДНК донора в смеси
Донор 104b % в смеси Реципиент 103b % в смеси Рассчитанные % Донор 104b, %
Маркер S0101 Маркер S0386 Маркер S0355 среднее арифметическое* погрешность*
5 95 4,7 9,5 2,9 5,7 3,4
10 90 9,1 13,1 5,8 9,3 3,7
15 85 14,7 16,6 8 13,1 4,5
25 75 23,3 21,9 13,8 19,6 5,1
50 50 48,1 38,5 29,8 38,8 9,2
Примечание. * — рассчитывали по трем локусам, приведенным в табл. 2.
После определения профиля аллелей 8ТЯ в паре «донор-реципиент» выбирали те маркеры, в которых у реципиента есть аллель, которого нет у донора (информативные для реципиента), и маркеры, в которых у донора есть аллель, которого нет у реципиента (информативные для донора). В дальнейшем для исследования химеризма в образцах реципиента после трансплантации использовали не менее 2 маркеров, информативных для реципиента, и не менее 2 маркеров, информативных для донора.
Количественно химеризм (соотношение процентного содержания аллелей донора и реципиента в образцах реципиента после аТКМ) рассчитывался по соотношению высоты пиков на капиллярном электрофорезе в программе ОепеМаррег 5. Данные представлены в виде количества аллелей реципиента и аллелей донора в образце, в процентах. Полным донорским химеризмом считали наличие только донорских аллелей в образце после аТКМ при отсутствии определяемых аллелей реципиента (количество аллелей реципиента меньше порога чувствительности метода - 2-5 %). Смешанным химеризмом считали наличие в образце после аТКМ аллелей как донора, так и реципиента.
Результаты
Для оценки применимости метода был проведен эксперимент по определению воспроизводимости метода при определении химеризма. Для эксперимента смешивали образцы ДНК донора (минипиг № 104Ь) и ДНК реципиента (минипиг № 103Ь) для получения 5, 10, 15, 25 и 50 % ДНК донора в ДНК реципиента. Далее в полученных образцах со смешанной ДНК проводили измерение химеризма с помощью вышеописанной методики определения 8ТК-маркеров набором СОгБ18 РЮ (ООО «ГОРДИЗ», Россия) по трем локусам, информативным для донора (табл. 2).
Всего химеризм исследовали у 9 пар экспериментальных животных. Все реципиенты получили трансплантацию васкуляризированного трансплантата и аТКМ от донора, несовместимого по МНС. У 5 реципиентов на +30 сутки после аТКМ в периферической крови и аспирате костного мозга определялись только аллели реципиента, присутствие донорских аллелей не установлено. У 4 реципиентов определялись донорские аллели после аТКМ на +14, +21, +30 сутки (табл. 3).
Таблица 3. Характеристика экспериментальных животных
№ № реци- № до- % донорских аллелей
п/п пиента нора (+30 сутки от аТКМ)
1 14a 10a Не определяются
2 100b 99b Не определяются
3 101b 102b Не определяются
4 151 152 46,1
5 812 804 > 80-90 %
6 7 10 23,2
7 12 3 Не определяются
8 8 14 Не определяются
9 207 246 78,0
% аллелей донора
60 -, 50 -40 -30 -20 -10 -0 -
0 5 10 15 20 25 30
Рис. 3. Динамика химеризма у минипига № 151
Сутки после аТКМ
35
40
У реципиента № 151 удалось проследить динамику изменения донорского химеризма в сроки от +7 до +34 суток от аТКМ. Динамика изменений представлена на рис. 3. К +20 суткам от аТКМ донорский химеризм составлял примерно половину всех аллелей в костном мозге реципиента и сохранялся на этом уровне до 34 сут.
Пример смешанного донорского химеризма представлен на рис. 4, а на рис. 5 показано полностью собственное кроветворение после аТКМ.
Если у донора и реципиента не было одинаковых аллелей в исследуемом локусе (пример: донор гомозиготен по аллелю Ь, реципиент гетерозиготен по аллелям с и !), процент содержания аллелей донора в образце рассчитывали по формуле:
а =
■ х ЮО % ,
(с+Ь+й)
где а - количество донорских аллелей в образце (в %); Ь - высота пика уникального донорского аллеля, кото-
3 а И , i 1 «рШЦ im № tri 1
: Дв-ер« У \ vak «Iti —. лл.п .КЛИПАМПЬ 1 -tk №im Inf Jli: Mril I
\
; |j 1 III III 06mi4u f Et НМЛ* irui|ttl fn*t | m^-i JU
Рис. 4. Смешанный донорский химеризм у реципиента № 151 на +34 сутки после аТКМ. Определяется донорский аллель по всем информативным маркерам
Ё J 111 III iJLJL л. ¡№P«Hl tllfrl J|U*TK4 ■ rtr ,,
Л im p
1 Oat i «fit ¿11 llllllllllll oqfuffulitjt Ш
\ л *Лл11ЛНМк ш—■-— aapujtM »Twii.w i Uill -kCJ't UMw) ' IM
Рис. 5. Донорские аллели в образце реципиента № 100Ь не определяются на +30 сутки после аТКМ
рый отсутствует у реципиента; с - высота пика первого аллеля реципиента; С - высота пика второго аллеля реципиента.
Если у донора и реципиента присутствовал один общий аллель в исследуемом локусе (пример: донор гетерозиготен по аллелям Ь и с, реципиент гетерозиготен по аллелям с и сС), процент содержания аллелей донора в образце рассчитывали по формуле:
где a - это количество донорских аллелей в образце (в %); b - высота пика уникального донорского аллеля, который отсутствует у реципиента; с - высота пика аллеля реципиента, общего с донором; d - высота пика уникального аллеля реципиента, который отстутствует у донора. Когда у донора и реципиента есть общий аллель, значение b в числителе умножается на 2, чтобы учесть вклад в высоту пика общего аллеля примеси донора.
Обсуждение
Оптимальный способ предотвращения реакции отторжения аллотрансплантата - это индукция трансплантат-специфической толерантности реципиента с помощью гемопоэтических и/или мезенхимальных стволовых клеток донора [14, 15]. У человека перспективные протоколы индукции толерантности, основанные на применении гемопоэтических стволовых клеток костного мозга донора, изучаются главным образом при трансплантации почки [11]. Они обеспечивают длительную, чаще пожизненную иммунопривилегированность и функционирование почечного трансплантата без применения поддерживающей иммуносупрессивной терапии. Помимо трансплантации солидных органов, в настоящее время все чаще используется пересадка BKA - трансплантация нескольких типов тканей (кожи, мышц, костей с кровеносными сосудами и нервами), обычно от МНС-несовместимых доноров [16]. Однако реципиенты BKA вынуждены пожизненно принимать токсичные иммунодепрессанты со всеми вытекающими
негативными последствиями искусственного иммунодефицита - онкологическими и инфекционными заболеваниями, органотоксичностью, снижающими качество и продолжительность их жизни.
Иммуносупрессивная терапия продлевает период функционирования трансплантата, однако в большинстве случаев не обеспечивает полной толерантности иммунной системы реципиента к трансплантированному органу. Следовательно, решение проблемы иммунологической несовместимости аллогенных органов и тканей при трансплантации способно качественно улучшить эффективность лечения ряда фатальных и инвалидизирующих заболеваний. Это возможно при развитии донорского химеризма после аТКМ от донора BKA или целевого органа. Показано, что полный стабильный химеризм коррелирует с длительным приживлением донорских тканей [11]. Для формирования донорского химеризма представляется перспективным использование трансплантации гемопоэтических стволовых клеток с блокаторами костимуляции [17].
Таким образом, для понимания динамики приживления стволовых клеток у пациентов после аТКМ большое значение представляет исследование донорского гемопоэтического химеризма. В настоящей работе мы изучали формирование химеризма в ранние сроки после аллогенной трансплантации у МНС-несовместимых минипигов с помощью анализа локусов, содержащих STR. Процесс отторжения BKA в таких случаях может происходить очень быстро, однако исследование уровня химеризма дает возможность принять меры к его предупреждению [11]. Уменьшение иммуносупрессии, назначение инфузии донорских клеток может способствовать переходу смешанного химеризма в полный.
Применение набора COrDIS PIG (ООО «ГОРДИЗ», Россия) для определения химеризма у минипигов в эксперименте было успешным и показало высокую чувствительность определения химеризма (до 5 % примеси ДНК донора в ДНК реципиента). Проведение анализа не менее, чем по трем информативным локусам дает возможность повысить точность количественного опре-
деления химеризма. Применение методики позволило наблюдать процесс формирования смешанного донорского химеризма у экспериментального животного в динамике на примере минипига № 151.
Следовательно, последовательный и многократный анализ химеризма показан при проведении иммуносу-прессивной терапии как важный показатель состояния кроветворения.
Заключение
Количественное определение химеризма после аТКМ - это один из основных методов оценки возможности приживления аллотрансплантатов (в том числе ВКА) от того же донора. Многократные исследования химеризма в динамике необходимы для оценки эффективности трансплантации с возможностью последующей отмены иммуносупрессивной терапии. В настоя-
■ Литература
1. Van Deerlin V.M., Leonard D.G. Bone marrow engraftment analysis after allogeneic bone marrow transplantation. Clinics in laboratory medicine. 2000; 20 (1): 197-225. PMID: 10702903
2. Блау О.В. Химеризм после аллогенной трансплантации гемо-поэтических стволовых клеток. Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. 2013; 6 (1): 34-9. eLIBRARY ID: 22548238
3. Fehse B., Chukhlovin A., Kuhlcke K. et al. Real-time quantitative Y chromosome-specific PCR (QYCS-PCR) for monitoring hematopoietic chimerism after sex-mismatched allogeneic stem cell transplantation. J. Hematother. Stem. Cell Res. 2001; 10 (3): 419-25. DOI: https://doi. org/10.1089/152581601750289028
4. Blazar B., Orr H., Arthur D. et al. Restriction fragment length polymorphisms as markers of engraftment in allogeneic marrow transplantation. Blood 1985; 66: 1436-44. PMID: 2998513
5. Socie G., Lawler M., Gluckman E. et al. Studies on hematopoietic chimerism following allogeneic bone marrow transplantation in the molecular biology era. Leuk. Res. 1995; 19: 497-504. DOI: https://doi. org/10.1016/0145-2126(95)00026-k
6. Thiede F.C., Bornhaeuser M., Oesschlagel U. et al. Sequential monitoring of chimerism and detection of minimal residual disease after allogeneic blood stem cell transplantation (BSCT) using multiplex PCR amplification of short tandem repeat markers. Leukemia 2001; 7: 958-65. DOI: https://doi.org/10.1038/sj.leu.2401953
7. Liacini A., Tripathi G., McCollick A. et al. Chimerism Testing by Next Generation Sequencing for Detection of Engraftment and Early Disease Relapse in Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation and an Overview of NGS Chimerism Studies. Int. J. Mol. Sci. 2023; 24 (14): 11814. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms241411814
8. Abatay-Sel F., Savran-Oguz F., Kalayoglu-Besisik S. et al. Short Tandem Repeate-Polimerase Chain Reaction (STR-PCR) with Quantitative Ral-Time Polimerase Chain Reaction (qRT-PCR) Method using for Chimerism Analisys. Clin Lab. 2019; 65 (9). DOI: https://doi.org/10.7754/ Clin.Lab.2019.190221
■ References
1. Van Deerlin V.M., Leonard D.G. Bone marrow engraftment analysis after allogeneic bone marrow transplantation. Clinics in laboratory medicine. 2000; 20 (1): 197-225. PMID: 10702903
2. Blau O.V. Chimerism following allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Klinicheskaya onkogematologiya. Fundamental'nyye issledovaniya i klinicheskaya praktika. 2013; 6 (1): 34-9. eLIBRARY ID: 22548238 (in Russian)
3. Fehse B., Chukhlovin A., Kuhlcke K., et al. Real-time quantitative Y chromosome-specific PCR (QYCS-PCR) for monitoring hematopoietic chimerism after sex-mismatched allogeneic stem cell transplanta-
щей работе была проведена оценка гемопоэтического химеризма у МНС-несовместимых минипигов после аТКМ при индукции иммунной толерантности к ВКА с помощью анализа STR-локусов методом ПЦР с детекцией микросателлитов (STR) с использованием капиллярного электрофореза.
Показаны высокая чувствительность метода и корреляция количественного значения химеризма с процессом приживления трансплантата костного мозга у реципиентов после аТКМ. Таким образом, изучение формирования химеризма у минипигов с одновременным проведением аТКМ и ВКА может проводиться методом анализа STR-локусов c использованием капиллярного электрофореза. Тем не менее, сама проблема создания иммунной толерантности к аллотрансплантату с помощью пересадки гемопоэтических стволовых клеток требует проведения дальнейших исследований.
9. Dubernard J.M., Owen E., Herzberg G. et al. Human hand allograft: report on first 6 months. Lancet. 1999; 353 (9161): 1315-20. DOI: https:// doi.org/10.1016/S0140-6736(99)02062-0
10. Sachs D.H., Kawai T., Sykes M. Induction of tolerance through mixed chimerism. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2014; 4 (1): a015529. DOI: https://doi.org/10.1101/cshperspect.a015529
11. Yang J.H., Johnson A.C., Colakoglu S., Huang C.A., Mathes D.W. Clinical and preclinical tolerance protocols for vascularized composite allograft transplantation. Arch. Plast. Surg. 2021; 48 (6): 703-13. DOI: https://doi.org/10.5999/aps.2021.00927
12. Европейская конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (ETS N123), приказ Минздравсоцразвития РФ от 23.08.2010 № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики».
13. Lellouch A.G., Andrews A.R., Saviane G. et al. Tolerance of a Vascularized Composite Allograft Achieved in MHC Class-I-mismatch Swine via Mixed Chimerism. Front. Immunol. 2022; 13: 829406. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.829406
14. Kawai T., Sachs D.H., Sykes M., Cosimi A.B. HLA-Mismatched Renal Transplantation without Maintenance Immunosuppression. N. Engl. J. Med. 2013; 368 (19): 1850-2. DOI: https://doi.org/10.1056/ NEJMc1213779
15. Бехало B.A., Горская Ю.Ф., Нестеренко В.Г. Иммунорегуля-торный и иммунотерапевтический потенциал мезенхимальных ство-ловых/стромальных клеток: перспективы и проблемы. Иммунология. 2024; 45 (3): 385-95. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-3-385-395
16. Siemionow M.Z., Kulahci Y., Bozkurt M. Composite tissue allotransplantation. Plast. Reconstr. Surg. 2009; 124 (6 Suppl): e327-39. DOI: https://doi.org/10.1097/PRS.0b013e3181bf8413
17. Гринько E.K., Донецкова А.Д., Варлачев A.B., Митин А.Н. Роль блокаторов костимуляции в трансплантологии: от эксперимента к клинике. Иммунология. 2023; 44 (3): 626-39. DOI: https://doi. org/10.33029/0206-4952-2023-44-3-626-639
tion. J Hematother Stem Cell Res. 2001; 10 (3): 419-25. DOI: https://doi. org/10.1089/152581601750289028
4. Blazar B., Orr H., Arthur D., et al. Restriction fragment length polymorphisms as markers of engraftment in allogeneic marrow transplantation. Blood. 1985; 66: 1436-44. PMID: 2998513
5. Socie G., Lawler M., Gluckman E., et al. Studies on hematopoietic chimerism following allogeneic bone marrow transplantation in the molecular biology era. Leuk. Res. 1995; 19: 497-504. DOI: https://doi. org/10.1016/0145-2126(95)00026-k
6. Thiede F.C., Bornhaeuser M., Oesschlagel U., et al. Sequential monitoring of chimerism and detection of minimal residual disease after allogeneic blood stem cell transplantation (BSCT) using multiplex PCR amplification of short tandem repeat markers. Leukemia. 2001; 7: 958-65. DOI: https://doi.org/10.1038/sj.leu.2401953
7. Liacini A., Tripathi G., McCollick A., et al. Chimerism Testing by Next Generation Sequencing for Detection of Engraftment and Early Disease Relapse in Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation and an Overview of NGS Chimerism Studies. Int J Mol Sci. 2023; 24 (14): 11814. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms241411814
8. Abatay-Sel F., Savran-Oguz F., Kalayoglu-Besisik S., et al. Short Tandem Repeate-Polimerase Chain Reaction (STR-PCR) with Quantitative Ral-Time Polimerase Chain Reaction (qRT-PCR) Method using for Chimerism Analisys. Clin Lab. 2019; 65 (9). DOI: https://doi.org/10.7754/ Clin.Lab.2019.190221
9. Dubernard J.M., Owen E., Herzberg G., et al. Human hand allograft: report on first 6 months. Lancet. 1999; 353 (9161): 1315-20. DOI: https:// doi.org/10.1016/S0140-6736(99)02062-0
10. Sachs D.H., Kawai T., Sykes M. Induction of tolerance through mixed chimerism. Cold Spring Harb Perspect Med. 2014; 4 (1): a015529. DOI: https://doi.org/10.1101/cshperspect.a015529
11. Yang J.H., Johnson A.C., Colakoglu S., Huang C.A., Mathes D.W. Clinical and preclinical tolerance protocols for vascularized composite allograft transplantation. Arch Plast Surg. 2021; 48 (6): 703-13. DOI: https://doi.org/10.5999/aps.2021.00927
Сведения об авторах
Бриллиантова Варвара Витальевна - науч. сотр. лаб. молекулярной биологии ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева», Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-0079-7761
Котский Михаил Андреевич - вед. науч. сотр. ЦПЛ трансляционной медицины ФПИ ФГБНУ «НИИ МТ им. акад. Н.Ф. Измерова» Минобрнауки России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0009-0003-0598-8695
Муравская Маргарита Павловна - науч. сотр. ЦПЛ трансляционной медицины ФПИ ФГБНУ «НИИ МТ им. акад. Н.Ф. Измерова» Минобрнауки России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0009-0001-4342-9451
Ткачук Юлия Валерьевна - науч. сотр. ЦПЛ трансляционной медицины ФПИ ФГБНУ «НИИ МТ им. акад. Н.Ф. Измерова» Минобрнауки России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/ 0009-0005-1083-8813
Соколова Ольга Николаевна - науч. сотр. ЦПЛ трансляционной медицины ФПИ ФГБНУ «НИИ МТ им. академика Н.Ф. Измерова» Минобрнауки России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0009-0001-3149-9786
12. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experiments or Other Scientific Purposes (ETS N123), order of the Ministry of Health and Social Development of the Russian Federation dated August 23, 2010 No. 708n «On approval of the rules of laboratory practice». (in Russian)
13. Lellouch A.G., Andrews A.R., Saviane G., et al. Tolerance of a Vascularized Composite Allograft Achieved in MHC Class-I-mismatch Swine via Mixed Chimerism. Front Immunol. 2022; 13: 829406. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.829406
14. Kawai T., Sachs D.H., Sykes M., Cosimi A.B. HLA-Mis-matched Renal Transplantation without Maintenance Immunosuppres-sion. N Engl J Med. 2013; 368 (19): 1850-2. DOI: https://doi.org/10.1056/ NEJMc1213779
15. Bekhalo V.A., Gorskaya Yu.F., Nesterenko V.G. Immunoreg-ulatory and immunotherapeutic potential of mesenchymal stem/stro-mal cells: prospects and problems. Immunologiya. 2024; 45 (3): 385-95. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-3-385-395 (in Russian)
16. Siemionow M.Z., Kulahci Y., Bozkurt M. Composite tissue allotransplantation. Plast Reconstr Surg. 2009; 124 (6 Suppl): e327-39. DOI: https://doi.org/10.1097/PRS.0b013e3181bf8413
17. Grinko E.K., Donetskova A.D., Varlachev A.V., Mitin A.N. The role of costimulation blockade in transplantology: from experiment to clinic. Immunologiya. 2023; 44 (3): 626-39. DOI: https://doi. org/10.33029/0206-4952-2023-44-3-626-639 (in Russian)
Authors' information
Varvara V. Brilliantova - Researcher of the Molecular Biology Lab. of Dmitry Rogachev NMRC PHOI, MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-0079-7761
Mikhail A. Kotsky - Leader Researcher of Translational Medicine Lab. of ARF, N.F. Izmerov RIOH, MSHE of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0009-0003-0598-8695
Margarita P. Muravskaya - Researcher of Translational Medicine Lab. of ARF, N.F. Izmerov RIOH, MSHE of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0009-0001-4342-9451
Yulia V. Tkachuk - Researcher of Translational Medicine Lab. of ARF, N.F. Izmerov RIOH, MSHE of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0009-0005-1083-8813
Olga N. Sokolova - Researcher of Translational Medicine Lab. of ARF, N.F. Izmerov RIOH, MSHE of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0009-0001-3149-9786
Бондаренко Анатолий Викторович - науч. сотр. ЦПЛ трансляционной медицины ФПИ ФГБНУ «НИИ МТ им. акад. Н.Ф. Измерова» Минобрнауки России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0009-0008-7362-0493
Козлитина Ольга Владимировна - науч. сотр. ЦПЛ трансляционной медицины ФПИ ФГБНУ «НИИ МТ им. акад. Н.Ф. Измерова» Минобрнауки России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0009-0005-8421-3111
Митин Александр Николаевич - канд. мед. наук, зав. ЦПЛ иммунологии ФПИ; зав. лаб. дифференцировки лимфоцитов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1333-0757
Дроков Михаил Юрьевич - канд. мед. наук, руководитель сектора научных исследований химиотерапии гемобластозов, депрессий кроветворения и трансплантации костного мозга ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-9431-8316
Варлачев Александр Валерьевич - д-р биол. наук, руководитель проектной группы ЦПЛ иммунологии ФПИ, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected]
Донецкова Альмира Дмитриевна - д-р мед. наук, зав. ЦПЛ трансляционной медицины ФПИ ФГБНУ «НИИ МТ им. акад. Н.Ф. Измерова» Минобрнауки России; вед. науч. сотр. лаб. дифференцировки лимфоцитов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; проф. каф. иммунологии МБФ ФГАОУ ВО РНИМУ им. НИ. Пирогова Минздрава России; проф. каф. иммунологии Мединститута ФГАОУ ВО РУДН им. П. Лумумбы Минобрнауки России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-2465-2444
Anatoly V. Bondarenko - Researcher of Translational Medicine Lab. of ARF, N.F. Izmerov RIOH, MSHE of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0009-0008-7362-0493
Olga V. Kozlitina - Researcher of Translational Medicine Lab. of ARF, N.F. Izmerov RIOH, MSHE of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0009-0005-8421-3111
Alexander N. Mitin - PhD, Head of Immunology Lab. of ARF; Head of Lymphocytes Differentiation Lab. of NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1333-0757
Mikhail Yu. Drokov - PhD, Head of Chemotherapy of Hemoblastoses, Depressions of Hematopoiesis and Bone Marrow Transplantation Dept., NMRC for Hematology, MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-9431-8316
Alexander V. Varlachev - MD, PhD, Project Team Leader of Lab. of Immunology of ARF, Moscow, Russian Federation
E-mail: [email protected]
Almira D. Donetskova - MD, PhD, Head of Translational Medicine Lab. of ARF, N.F. Izmerov RIOH, MSHE of Russia; Leader Researcher of Lymphocyte Differentiation Lab. of NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Prof. of Immunology Chair, MBF, N.I. Pirogov RNRMU of the MOH of Russia; Prof. of Immunology Chair of the Medical Institute of RUDN named after P. Lumumba of the MSHE of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-2465-2444
