CC BY
186
Т.М.ЖЕЛТИКОВА, д.б.н., А.М.ГЛУШАКОВА, к.б.н., НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН, Москва (директор ин-та — академик РАМН В.В.Зверев)
Оценка фунгицидной активности различных
СИСТЕМНЫХ АНТИМИКОТИКОВ IN VITRO
Грибы (дрожжи, микромицеты) оказывают многофакторное воздействие на организм человека. Они могут быть причиной токсических и аллергических реакций, а также способствовать формированию микозов. Все это в полной мере относится
и к дрожжам рода Candida.
Ключевые слова: Candida, кандидозы, антимикотики, флуконазол, дифлюкан, дженерики
Различные виды рода Candida, и в первую очередь Candida albicans, могут вызывать поражения кожного покрова, желудочно-кишечного и генитального трактов. Кандидозные вульвовагини-ты являются одной из наиболее частых причин обращения женщин к гинекологу (Анкирская, 2009). По данным разных авторов, C. albicans выделяется у 73— 90% больных кандидозным вульвовагинитом, C. glabrata — у 15—35%, а другие виды дрожжей, в том числе и C. parapsilosis — у 4—19% [2, 3, 5, 10]. Очевидно, что успех лечения генитальных кандидозов зависит от выбора эффективного антимикотика.
Флуконазол — это международное непатентованное наименование (МНН) препарата, утвержденное Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ). Флуконазол — антимикотик для системного применения, и препараты на его основе особенно хорошо зарекомендовали себя при лечении микозов, вызванных дрожжами рода Candida. По биохимической структуре флуконазол является производным триазо-ла и функционально работает как высокоактивный селективный ингибитор синтеза стеролов в клетках грибов. Как и другие препараты группы азолов, флу-коназол угнетает образование эргостерола, основного компонента клеточной мембраны грибов. В низких концентрациях флуконазол нарушает биосинтез клеточной мембраны грибов, что приводит к развитию фунгистатического эффекта (задержке роста). При достижении высоких концентраций вследствие перекисного окисления и других процессов в клетке происходит гибель гриба (фунгицидный эффект). В отличие от других азольных препаратов флуконазол обладает высокой специфичностью по отношению к зависимым от цитохрома Р450 ферментам гриба [6].
Молекула флуконазола была синтезирована и запатентована компанией Pfizer (США). Позднее, после
окончания срока действия патента, на фармакологическом рынке появились дженерики, в состав которых также входит флуконазол. В связи с тем, что пре-параты-дженерики положено сравнивать с оригинальным препаратом по разным параметрам (биоэквивалентности, биодоступности, фармакокинетике и др.), целью нашего исследования было оценить in vitro фунгицидную активность различных антимико-тиков на лабораторных культурах Candida albicans, C. glabrata и С. Рarapsilosis.
И МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Препараты. В работе были использованы оригинальный препарат, содержащий флуконазол — дифлюкан (Pfizer, США) и дженерики флуконазола: диф-лазон (KRKA, Словения); флюкостат («Фармстандарт-Лексредства», Россия); микосист (Gedeon Richter, Венгрия); флуконазол (Hemofarm, Сербия); микомакс (Zentiva, Чехия). В опытах использовано не менее 5 упаковок препарата одного наименования, купленных в разных аптеках Москвы. Препараты исследовали в двух разведениях: 150 мг/мл и 2 мг/мл.
В качестве контроля использовали препарат диф-люкан для внутривенного введения в концентрации 2 мг/мл.
Культуры дрожжей и среды культивирования. Тест-штаммы Candida albicans (ВКПМ Y-3108), Candida glabrata (КБП 3049) и Candida. рarapsilosis (КБП 3050).
1. Среда Сабуро: 40 г — глюкозы, 10 г — пептона, 5 г — дрожжевого экстракта, 20 г — агара, 1000 мл — воды.
2. Пептонно-глюкозо-дрожжевой агар (ПГДА): 2% глюкоза, 1% пептон, 0,5% дрожжевой экстракт.
Дизайн эксперимента. Работа проводилась двойным слепым методом. В работе использовали луноч-но-диффузионный метод, который является модификацией диско-диффузионного метода [7—9]. В чашку
Таблица 1. Диаметр (мм) зон ингибиции роста тест-штамма Candida albicans (ВКПМ Y-3108) под воздействием различных фунгицидов
Препараты
Дифлюкан (в/в)
Дифлюкан
Флуконазол
Дифлазон
Микосист
Микомакс
Флюкостат
Концентрация
150 мг/мл 2 мг/мл
— 46,0 + 1,0
55,5 + 0,7 45,5 + 1,0
46,0+1,0 42,5 + 1,5
47,5+1,0 43,0 + 1,0
53,0+1,5 41,0 + 1,0
50,0+ 1,0 40,5 + 1,5
52,0 + 1,5 42,0 + 1,0
Таблица 2. Диаметр (мм) зон ингибиции
роста тест-штамма Candida parapsilosis (КБП 3050) под воздействием различных фунгицидов
Препараты Концентрация
150 мг/мл 2 мг/мл
Дифлюкан (в/в) — 48,5+1,0
Дифлюкан 52,0 + 1,5 49,0+1,0
Флуконазол 48,0+1,2 46,0+1,5
Дифлазон 48,0+0,7 45,0+1,0
Микосист 49,0+1,0 47,0+1,0
Микомакс 49,0+0,8 45,0+1,0
Флюкостат 50,0+1,0 46,5+1,2
Таблица 3. Диаметр (мм) зон ингибиции
роста тест-штамма Candida glabrata (КБП 3049) под воздействием различных фунгицидов
Препараты Концентрация
150 мг/мл 2 мг/мл
Дифлюкан (в/в) — 41,0+1,5
Дифлюкан 42,0+0,8 37,0+0,5
Флуконазол 39,0+1,0 35,0+0,4
Дифлазон 38,5+1,0 36,0+0,6
Микосист 41,0+0,5 34,0+0,8
Микомакс 37,0+1,0 35,0+1,0
Флюкостат 40,0+1,0 34,0+0,7
зии препаратов, приготовленных на физрастворе. Препарат дифлюкан для внутривенного введения (2 мг/мл) вносили в лунку в том же объеме. Каждый эксперимент проводили в трехкратной повторности. Инкубацию производили при 37°С в течение 24 ч, после чего проводили измерение зоны подавления роста дрожжевых грибов и фотографирование чашек.
Зоны ингибиции роста грибов измеряли в миллиметрах. Чем больше зона ингибиции роста гриба, тем выше фунгицидная активность препарата. Зоной ингибиции роста грибов считали зону полного подавления роста колоний. Однако, как и рекомендовано МУК 4.2.1890-04 [7], не обращали внимания на единичные и очень мелкие колонии грибов. Для контроля зон ингибиции роста проводили микроскопирование фрагментов агара.
Н РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Петри ^=90 мм) вносили 20 мл агаризованной среды. В центре делали лунку на 2/3 толщины слоя агара. После этого газоном засевали штаммы дрожжей (0,1 мл суспензии клеток в концентрации 106 кл/мл), а в лунку вносили препараты. Препараты в капсулах исследовались в суспензии в двух концентрациях: 150 мг/мл и 2 мг/мл. В лунку вносили 0,1 мл суспен-
Все исследованные препараты флуконазола тормозили рост трех видов дрожжей как в концентрации 150 мг/мл (фото 1А-6А), так и в концентрации в 75 раз ниже (2 мг/мл) (фото 1Б—6Б). При этом зоны ингибиции роста дрожжей, образующиеся вследствие воздействия дифлюка-ном, были, как правило, достоверно больше как при концентрации 150 мг/мл, так и при концентрации 2 мг/мл, чем зоны ингибиции при воздействии другими препаратами, содержащими флуконазол (табл. 1— 3; рис. 1—6, фото 1—6). В зоне отсутствия роста дрожжи были представлены редкими единичными клетками и небольшими редкими скоплениями, что допускается МУК 4.2.1890-04.
Во всех экспериментах с C. albicans зоны торможения роста достоверно больше при воздействии диф-люкана по сравнению с другими препаратами (табл. 1; рис. 1,2; фото 1—6).
В экспериментах с C. parapsilosis, где концентрация препаратов была 150 мг/мл, зоны торможения роста дрожжей статистически достоверно больше при воздействии дифлюканом по сравнению с другими препаратами (табл. 2; рис. 4). В экспериментах с
Рисунок 1. Фунгицидное действие различных системных антимикотиков в концентрации 2 мг/мл на тест-штаммы Candida albicans (ВКПМ Y-3108)
Рисунок 2. Фунгицидное действие различных системных антимикотиков в концентрации 150 мг/мл на тест-штаммы Candida albicans (ВКПМ Y-3108)
Рисунок 3. Фунгицидное действие различных системных антимикотиков в концентрации 2 мг/мл на тест-штаммы Candida parapsilosis (КБП 3050)
C. parapsilosis, где концентрация препаратов была 2 мг/мл, зоны ее торможения роста достоверно больше при воздействии дифлюка-ном по сравнению с флуконазолом, дифла-зоном, микомаксом и флюкостатом. Тогда как в некоторых экспериментах, где концентрация препаратов была 2 мг/мл, зоны ингибиции роста C. parapsilosis ди-флюканом (для внутривенного введения) и микосистом статистически достоверно не различались (табл. 2; рис. 3, фото).
В экспериментах с C. glabrata, где концентрация препаратов была высокой (150 мг/мл), зоны торможения роста дрожжей, как и в случае с C. albicans и C. parapsilosis, достоверно статистически значимо больше при воздействии дифлюканом по сравнению с другими препаратами (табл. 3; рис. 6). В экспериментах с C. glabrata, где концентрация препаратов была низкой (2 мг/мл), зоны ее торможения роста статистически достоверно больше при воздействии ди-флюканом по сравнению с флуконазолом, микосистом, микомак-сом и флюкостатом. Тогда как в некоторых экспериментах с этой же концентрацией препаратов зоны ингиби-ции роста C. parapsilosis дифлюканом (в капсулах) и дифлазоном различалась статистически недостоверно (табл. 3; рис. 5).
При сравнительном изучении фунгицид-ной активности диф-люкана на различные виды дрожжей наиболее чувствительными оказались C. albicans (ВКПМ Y-3108) и C. parapsilosis (КБП 3050) (рис. 7).
Проблема взаимозаменяемости оригинального препарата дженериками является одной из наиболее конфликтных и спорных. На российском фармакологическом рынке на долю джене-риков приходится от 78 до 95% [11]. Как правило, препараты-дже-нерики должны быть эквивалентны оригинальному препарату по действующему веществу, фармакологическим показателям и терапевтической эффективности. Однако они могут отличаться по составу дополнительных веществ, способу синтеза действующего вещества и т.д. [11]. К сожалению, для практикующих врачей не всегда бывает доступна сравнительная информация о препаратах-дже-нериках.
При изучении in vitro только одного показателя — фунгицид-ной активности — препарата дифлюкан и его различных дженериков нами было показано, что этим свойством обладают все исследуемые препараты. Однако эта активность проявляется в различной степени. Сравнительный анализ зон инги-биции роста трех ви-
Фото 1. Зоны ингибиции роста C. albicans при воздействии дифлюканом: А — 150 мг/мл, Б — 2 мг/мл
Z^Jtthkb- / .. •
щ
5 I '■■■ , "К
1 9 iff , т
\ г- *
й - J?
.
■ -¿tEL*1
■HP "
Фото 2. Зоны ингибиции роста C. albicans при воздействии флуконазолом: А — 150 мг/мл, Б — 2 мг/мл
Фото 3. Зоны ингибиции роста C. albicans при воздействии дифлазоном: А — 150 мг/мл, Б — 2 мг/мл
Фото 4. Зоны ингибиции роста C. albicans
при воздействии микосистом: А — 150 мг/мл, Б — 2 мг/мл
к риV ■-•■
• ■ jIttK н к ' Ш ж! ' ^ УШ fe^ /г-у •'iifi V ЯJ ¥ V ¿Ш
А . ;
■ _._ _.. "" /
J...- ■ а-: \
А в. . • -у - figf*
..... * J
дов дрожжей рода Candida различными препаратами, содержащими в качестве МНН флуконазол, свидетельствует о том, что наибольшую статистически достоверную фунгицидную активность на всех трех модельных штаммах C. albicans (ВКПМ Y-3108), C. parapsilosis (КБП 3050), С. glabrata (КБП 3049) как при максимальной (150 мг/мл), так и минимальной (2 мг/мл) концентрации показал дифлюкан. Также
очень важен тот факт, что дифлюкан тормозил рост штаммов не только C. albicans, но и других видов дрожжей — C. parapsilosis и C. glabrata. C. albicans и C. parapsilosis оказались достоверно более чувствительны к дифлюкану, чем устойчивый к различным антимикотикам C. glabrata [1, 12]. Полученные нами данные свидетельствуют, что дифлюкан статистически достоверно более сильно подавляет рост C. glabra-
Рисунок 4. Фунгицидное действие различных системных антимикотиков в концентрации 150 мг/мл на тест-штаммы Candida parapsilosis (КБП 3050)
Рисунок 5. Фунгицидное действие различных системных антимикотиков в концентрации 2 мг/мл на тест-штаммы Candida glabrata (КБП 3049)
Рисунок 6. Фунгицидное действие различных системных антимикотиков в концентрации 150 мг/мл на тест-штаммы Candida glabrata (КБП 3049)
Рисунок 7. Диаметр (мм) зон ингибиции роста тест-штаммов дрожжей под воздействием дифлюкана. C.a. C. albicans; C. p.— C. parapsilosis; C. g. — C. glabrata
ta, чем другие исследуемые препараты (рис. 6, 7). Похожие результаты по сравнительному изучению фунги-цидной активности ди-флюкана и некоторых его дженериков были получены и на других видах дрожжей рода Candida и, что важно, другими методами [4].
Таким образом, в результате проделанной работы мы пришли к следующим выводам:
1. При сравнительном изучении различных препаратов, содержащих флуконазол, наибольшую статистически достоверную фунги-цидную активность на всех трех модельных штаммах дрожжей, при максимальной (150 мг/мл) и минимальной (2 мг/мл) концентрации показал дифлюкан.
2. Фунгицидная активность капсулированной формы дифлюкана (2 мг/мл) и жидкой для внутривенного введения (2 мг/мл) статистически достоверно не отличалась как на C. albicans, так и на C. parapsilosis.
Фото 5. Зоны ингибиции роста C. albicans
при воздействии микомаксом: А — 150 мг/мл, Б — 2 мг/мл
Фото 6. Зоны ингибиции роста C. albicans
при воздействии флюкостатом: А — 150 мг/мл, Б — 2 мг/мл
■ -
rfi. "^jfe ,■■ X
Htf" ■ ■ 1 i № 74
А i, ■ }m у/ fc . L I % £ Б
3. Наиболее чувствительным к дифлюкану видом оказалась C. albicans (ВКПМ Y-3108) и C. parapsilosis (КБП 3050). Дифлюкан статистически достоверно более сильно подавляет рост C. glabrata, чем другие исследуемые препараты.
ЛИТЕРАТУРА
1. Анкирская А.С., Муравьева В.В., Миронова Т.Г., Королева Т.Е, Люба-совская Л.А., Карапетян Т.Э., Байрамова ГР. Генитальный кандидоз в структуре оппортунистических инфекций влагалища. Принципы лабораторной диагностики и значение мониторинга чувствительности грибов к антимикотикам. Акушерство и гинекология, 2009, №5, с. 31—37.
2. Анкирская А.С., Муравьева В.В., Фурсова С.А., Миронова Т.Г., Королева Т.Е. Мониторинг видового состава и чувствительности к антимикотикам дрожжеподобных грибов, выделенных из влагалища женщин репродуктивного возраста. // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер., 2006, т. 8, №1, с. 87—95.
3. Бурова С.А. Особенности возникновения и комплексного лечения кандидозных вульвовагинитов. // Лечащий врач, 2003, №4, с. 53—56.
4. Васильева Н.В., Выборнова И.В., Елинов Н.П. Чувствительность Candida species к флуконазолу и некоторым его дженерикам в испытаниях in vitro. Проблемы медицинской микологии, 2002, т. 4, №2, с. 43—44.
5. Кунгуров Н.В, Н.М.Герасимова, И.Ф.Вишневская. Современные представления о лечении урогенитального кандидоза. Лечащий врач, 2004, №6, с. 46—48.
6. Кунельская В.Я. Опыт применения микофлюкана (флуконазола) при лечении фарингомикоза. // Лечащий врач, 2005, №1, 67—69.
7. МУК 4.2.1890—04. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Клин. микробиол. антимикроб. химиотерап., 2004, т. 6, №4, с. 306—359.
8. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований. Под ред. Лабинской АС., Блинковой Л.П., Ещиной А.С. — М., «Медицина», 2004, 189 с.
9. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Под. ред. Егорова Н.С. — М.: Изд-во МГУ, 1995, 224 с.
10. Сметник В.П., Л.АМарченко, Г.Е.Чернуха. Опыт применения ми-кофлюкана (флуконазола) для лечения кандидозного вульвоваги-нита. Лечащий врач, 2004, №2, с. 73—76.
11. Талибов О.Б. Дженерики и эквивалентность лекарственных препаратов. http://www.rusmg.ru.
12. Pfaller M.A., D. J. Diekema, M.G. Rinaldi, R.Barnes, B.Hu, A.V.Veselov, N.Tiraboschi, E.Nagy, D.L.Gibbs, and the Global Antifungal Surveillance Group.Results from the ARTEMIS DISK Global Antifungal Surveillance Study: a 6.5-Year Analysis of Susceptibilities of Candida and Other Yeast Species to Fluconazole and Voriconazole by Standardized Disk Diffusion Testing. J Clin Microbiol., 2005, 43(12), р. 5848—5859.
