CC BY
58
Оценка эффективности применения пробиотических препаратов при лечении сальмонеллёза на основании исследования показателей крови
Л.Л. Абрамова, д.б.н., профессор, А.Н. Сизенцов, к.б.н., Н.В. Шеботина, студентка, Оренбургский ГАУ
Основной проблемой последних лет является увеличение числа резистентных к антибиотикам инфекций и снижение эффективности ряда антибиотиков. Распространение бактерий, устойчивых к антибиотикам, влечёт за собой массовую аллергизацию больных и развитие дисбактериозов, частота которых быстро растет [1, 2].
В последние годы появились новые подходы к лечению дисбактериозов, связанные с восстановлением естественной экологии организма и основанные на использовании активных биологических продуктов. Одним из аспектов такого подхода является нормализация изменённого микробного состояния организма при помощи бактериальных препаратов [3, 4].
В клинической практике в качестве средств лечения и профилактики острых кишечных инфекций, дисбактериозов различной этиологии и стресса широко используются биопрепараты из живых микробных культур — пробиотики [5]. В отличие от антибиотиков, они не оказывают отрицательного воздействия на нормальную микрофлору, безвредны, экологически чисты и не имеют противопоказаний для применения. Дополнительной особенностью данных микроорганизмов является их самостоятельная элиминация из желудочно-кишечного тракта после окончания приёма. Поэтому конструирование лечебно-профилактических препаратов из пробиотических бацилл особенно перспективно [6].
Наиболее актуальным в настоящее время является сочетанное применение антибиотических и пробиотических препаратов. Однако для такого применения необходимо учитывать то, чтобы микроорганизмы, входящие в состав пробиотических препаратов, были резистентны по отношению к антибиотикам, в комплексе с которыми они применяются [7].
Целью нашего исследования послужило определение эффективности совместного применения пробиотиков с антибиотиками при лечении экспериментальной кишечной инфекции.
Исходя из поставленной цели, мы определили следующие задачи:
1. Изучить эффективность лечения лабораторной инфекции с раздельным применением
антибиотика, пробиотика и комплекса антибиотика и пробиотика.
2. Изучить воздействие исследуемых микроорганизмов на гистологические показатели органов мишеней лабораторных животных.
Материалы и методы исследования
В качестве объектов исследования использовались:
1) бактерии рода Bacillus, входящие в состав пробиотических препаратов («Биоспорин», «Споробактерин», «Бактисубтил»);
2) тест-организм (Salmonella enteritidis);
3) лабораторные животные.
Для решения поставленных задач мы применили следующие методы:
1. Определение антибиотикорезистентности штаммов микроорганизмов, входящих в состав пробиотических препаратов и исследуемого тест-организма, с использованием АТВ тест-систем, диско-диффузионного метода и метода серийных разведений.
2. Исследование гематологических, биохимических показателей сыворотки крови и факторов неспецифической резистентности сыворотки крови.
По результатам предварительных исследований мы выбрали антибиотики цефотаксим для сочетанного применения с биоспорином, пенициллин со споробактерином-хлорамфеникол и с бактисубтилом.
Подтверждению результатов способствовали исследования методом серийных разведений с целью определения количественных значений минимальных подавляющих концентраций.
Эффективность совместного применения пробиотиков и антибиотиков при лечении лабораторной инфекции исследовалась по схеме, представленной на рисунке 1.
Исследования, направленные на изучение эффективности комплексного применения антибиотиков и пробиотиков при лечении лабораторной инфекции, проводили на лабораторных животных.
С этой целью были созданы группы животных-аналогов по половой, возрастной и весовой характеристикам:
— фоновая группа, в которой оценивали действие пробиотиков на лабораторных крыс;
— группа, в которой оценивали действие лабораторной инфекции на организм животных без проведения лечения;
Рис. 1 - Схема исследования:
К0 - обычный рацион; К1 - заражение; К2 - биоспорин; К3 - споробактерин; К4 - бактисубтил; О1 - заражение + хлорам-феникол; О2 - заражение + цефотаксим; О3 - заражение + пенициллин; О4 - заражение + биоспорин; О5 - заражение + споробактерин; О6 - заражение + бактисубтил; О7 - заражение + биоспорин + цефотаксим; О8 - заражение + споробактерин + хлорамфеникол; О9 - заражение + бактисубтил + пенициллин
— группы, в которых оценивали действие пробиотиков (биоспорина, в состав которого входят (В. шЫШн + В. Нскет/огт1з), споробак-терина (В. ■гаМ/к), бактисубтилла (В. свгвт) на лабораторных крыс.
В опытных группах сравнивалась эффективность лечения инфекции антибиотиками, а также комплексное использование антибиотиков и пробиотиков.
Убой животных проводился в количестве трёх голов на каждой точке исследований для определения эффективности применения изучаемых препаратов. В качестве точек исследования были установлены следующие сроки: фоновое перед применением препаратов; на пятый и на десятый дни после начала эксперимента. Заражение лабораторных животных вводили однократно перорально. Пробиотики и антибиотики вводились в соответствии с аннотацией к препарату, через 12 часов с момента заражения.
От опытных животных производили забор крови для гематологических, морфологических исследований и сыворотки крови для биохимических исследований и факторов неспецифической резистентности.
В ходе эксперимента было установлено, что наиболее значимые изменения отмечаются со
стороны таких морфологических показателей, как лимфоциты, моноциты, лейкоциты (табл. 1).
При фоновом исследовании концентрация показателей (табл. 1) находится в пределах физиологической нормы во всех группах экспериментальных животных. Через пять дней зарегистрировано повышение концентрации лимфоцитов в группах К1 (23,73%), О2 (30,12%) с выходом значений за пределы физиологической нормы. В группах О1, О4, О5,О6, О7,
08 на пятый день концентрация лимфоцитов не превышала верхней границы нормы. На десятый день только в группе К1 (25,45%) исследуемое значение превысило показатели физиологической нормы.
Концентрация моноцитов через пять дней исследования в группах К1 (112,78%), О5 (66,56%), О6 (206,91%), О7 (53,33%), О8 (40,45%),
09 (125,81%) превышает значения физиологической нормы, а в группах О1, О2, О3, О4 аналогичный показатель находится в верхней границе нормы. Высокие значения моноцитов на десятый день исследования установлены в группах К! (175,56%), О5 (70,63%) и О9 (87,09%).
Уровень лейкоцитов к пятому дню исследования в группах К1, О3, О4, О5, О6 превышал значения физиологической нормы и фонового
1. Динамика изменения показателей крови исследуемых животных
Исследуемые группы Ед.измерения Сроки исследования
фоновое через 5 суток через 10 суток
Лимфоциты
Ко % 63,43±0,698 58,40±1,193* 58,43±1,822
Кі % 62,23±1,078 77,00±1,155 78,07±1,157
К2 % 59,90±1,498 60,60±2,023 63,80±2,318
Кз % 59,57±2,022 62,90±1,735 65,40±1,833
К4 % 66,20±0,871 67,30±0,906 68,53±0,636
Оі % 64,33±2,028 76,73±0,897 71,50±1,323
О2 % 59,43±1,822 77,33±0,881 73,00±2,082
Оз % 66,83±0,898 73,67±1,581 73,03±1,605
О4 % 63,77±1,748 76,33±0,881 73,67±1,014
О5 % 60,23±1,748 75,67±1,453 73,97±1,517
О6 % 67,57±1,185 76,13±1,141 73,60±1,955
О7 % 61,80±1,744 74,33±1,453 65,47±2,021
О8 % 60,90±2,108 76,00±1,732 71,67±1,965
Оч % 66,77±1,320 72,30±2,259 73,67±1,260
Моноциты
Ко % 3,63±0,233 3,43±0,338 3,00±0,513
Кі % 2,66±0,441 5,66±0,881 7,33±0,441
К2 % 3,10±0,321 3,43±0,348 3,13±0,296
Кз % 3,26±0,348 3,10±0,264 3,30±0,360
К4 % 2,80±0,173 3,16±0,145 3,10±0,288
Оі % 2,46±0,371 3,90±0,115 4,23±0,145
О2 % 2,73±0,318 3,86±0,233 4,16±0,176
Оз % 2,26±0,240 4,06±0,240 4,10±0,173
О4 % 2,73±0,233 3,86±0,233 3,93±0,318
О5 % 3,20±0,251 5,33±1,764 5,46±0,484
О6 % 2,17±0,202 6,66±1,453 4,53±0,318
О7 % 3,00±0,763 4,66±0,284 4,43±0,120
О8 % 3,56±0,145 5,00±1,155 4,56±0,240
Оч % 3,10±0,173 7,00±1,155 5,80±0,458
Лейкоциты
Ко 109/л 8,23±0,1453 9,36±0,240 10,20±0,264
Кі 109/л 10,57±0,375 15,40±0,305 17,50±0,513
К2 109/л 11,68±0,574 12,30±0,692 10,65±0,431
Кз 109/л 9,64±0,7021 11,40±0,416 11,40±0,608
К4 109/л 10,60±0,461 11,97±0,589 12,03±0,348
Оі 109/л 10,57±0,547 14,40±0,264 13,33±0,272
О2 109/л 10,00±0,435 14,77±0,176 13,83±0,185
Оз 109/л 11,50±0,346 15,90±1,464 14,30±0,346
О4 109/л 10,33±0,202 15,03±0,145 14,43±0,202
О5 109/л 11,13±0,176 15,23±0,176 13,60±0,152
О6 109/л 10,73±0,497 16,13±1,920 14,00±0,208
О7 109/л 10,33±0,523 13,03±0,917 13,53±0,260
О8 109/л 10,95±1,041 14,63±0,272 13,47±0,296
Оч 109/л 10,63±0,463 14,50±0,360 14,00±0,208
исследования на 45,69; 38,26; 45,49; 36,84 и 50,33% соответственно. На десятый день только в группе К1 выявлено превышение физиологических значений, данный показатель по отношению к фоновому исследованию был выше на 65,56%, а в группах О3, О4, О6, О9 — в пределах верхней границы физиологической нормы. В остальных экспериментальных группах и на пятый, на десятый дни уровень лейкоцитов находился в пределах нормы. Концентрация остальных исследуемых морфологических показателей на всех сроках исследования во всех группах находилась в пределах нормы.
Для полноты картины происходящих в организме изменений и эффективности комплексного лечения экспериментальной инфекции нами оценивались гематологические показатели крови лабораторных животных, наиболее значимые
изменения регистрировались при изучении скорости оседания эритроцитов (табл. 2).
При фоновом исследовании СОЭ находилась в пределах нормы во всех группах. На пятый день показатели СОЭ превышали значения фонового исследования в группах К1 и всех опытных (О1-О9) на 48,04; 52,45; 96,15; 83,59; 64,56; 105,32; 119,34; 27,17; 50,49; 106,96% соответственно. К десятому дню данный показатель превышал значения физиологической нормы и фоновые значения в группах К!, О2, О4, О5, О6 на 104,58; 85,77; 45,57; 92,39; 108,23% соответственно. СОЭ в группах Оь О3, О7, О8, О9 снижалось до пределов верхней границы физиологической нормы. Гемоглобин в опытных группах находился в пределах нормы на всех сроках исследования.
При изучении процессов, происходящих со стороны биохимических показателей сыворотки
2. Динамика изменения СОЭ исследуемых животных
Исследуемые группы Ед.измерения Сроки исследования
фоновое через 5 суток через 10 суток
Ко мм/час 2,53±0,202 2,96±0,260 2,73±0,290
Кі мм/час 3,06±0,348 4,53±0,375 6,26±0,393
К2 мм/час 2,70±0,230 3,13±0,233 2,70±0,264
Кз мм/час 2,90±0,264 2,80±0,360 2,66±0,272
К4 мм/час 3,26±0,185 3,00±0,208** 2,83±0,176
Оі мм/час 2,86±0,202 4,36±0,240 4,23±0,338
О2 мм/час 2,60±0,321 5,10±0,264 4,83±0,272
Оз мм/час 2,56±0,176 4,70±0,305 4,10±0,378
О4 мм/час 3,16±0,185 5,20±0,264 4,60±0,264
О5 мм/час 2,63±0,202 5,40±0,264 5,06±0,145
О6 мм/час 2,43±0,145 5,33±0,318 5,06±0,272
О7 мм/час 3,46±0,318 4,40±0,264 3,80±0,208
О8 мм/час 3,03±0,318 4,56±0,260 4,23±0,409
О0 мм/час 2,30±0,173 4,76±0,290 4,23±0,504
3. Лизоцимная и бета-литическая активность сыворотки крови лабораторных животных
Исследуемые Ед.измерения Сроки исследования
группы фоновое через 5 суток через 10 суток
Лизоцим
К0 мкг/мл 5,22±0,520 2,70±0,458* 3,533±0,203*
К1 мкг/мл 4,83±0,549 12,27±0,644 14,3±0,603
К2 мкг/мл 2,52±0,754 12,03±0,841 14,27±0,617
Кз мкг/мл 3,033±0,353 15,08±0,549 17,33±0,569
К4 мкг/мл 4,20±0,871 14,30±0,906 16,53±0,636
О1 мкг/мл 4,38±0,565 8,47±0,537 8,20±0,625
О2 мкг/мл 4,18±0,524 9,60±0,404 9,23±0,722
Оз мкг/мл 6,83±0,898 11,67±0,581 13,03±1,605
О4 мкг/мл 6,17±2,23 10,87±0,90 12,53±0,783
О5 мкг/мл 5,13±0,578 10,23±0,775 11,40±0,656
О6 мкг/мл 4,57±0,185 10,13±0,141 13,60±0,955
О7 мкг/мл 5,60±0,322 8,633±0,348 8,533±0,376
О8 мкг/мл 6,68±0,696 7,77±0,353 5,53±0,67
О9 мкг/мл 5,74±0,320 9,24±0,259 8,89±0,267
Бета-лизин
К0 % 26,81±0,941 22,71±1,158 23,53±0,803
К1 % 28,25±1,05 34,80±1,079 36,13±1,147
К2 % 29,23±0,924 38,22±1,197 39,99±0,963
Кз % 28,40±1,601 29,82±1,116 33,25±0,925
К4 % 27,80±0,173 37,16±0,145 38,10±0,288
О1 % 29,23±0,769 30,00±0,954 31,50±0,569
О2 % 30,27±0,845 30,31±1,343 30,23±0,962
Оз % 28,26±0,240 36,06±0,240 40,10±0,173
О4 % 31,00±0,781 32,93±1,392 33,93±1,487
О5 % 29,13±0,982 32,53±0,593 33,23±1,519
О6 % 2,717±0,202 33,66±1,453 37,53±0,318
О7 % 27,07±0,987 28,33±1,017 29,93±1,415
О8 % 28,76±1,074 29,57±2,092 30,20±1,905
О9 % 25,10±0,173 30,06±1,155 33,00±0,458
крови, достоверных и значимых изменений зарегистрировано не было.
Для оценки эффективности влияния пробиотических штаммов бактерий рода Bacillus на показатели неспецифического иммунитета мы исследовали такие показатели, как лизоцим-ную и бета-литическую активность сыворотки крови (табл. 3). Применение пробиотических препаратов способствует активации показателей неспецифической резистентности [8].
Из представленных данных следует, что эффект при применении биоспорина значительно выше по сравнению с другими исследуемыми препаратами. Это достигается тем, что в состав биоспорина (пожалуй, единственного из пробиотиков на основе бацилл) входят не один, а
два штамма — B.subtilis 3 и В. Licheniformis 31. B.subtilis 3 является генно-модифицированным и способен продуцировать интерферон а.
Проведённые исследования позволяют нам сделать следующие выводы:
1. Применение пробиотических препаратов на основе бактерий рода Bacillus оказывает положительный эффект при лечении экспериментальной инфекции во всех опытных группах, о чём свидетельствуют такие показатели крови, как лейкоциты и скорость оседания эритроцитов.
2. Концентрация лейкоцитов в крови экспериментальных животных свидетельствует о том, что наиболее эффективным при лечении экспериментальной инфекции является при-
менение хлорамфеникола, хлорамфеникола в комплексе со споробактерином и биспорина с цефотаксимом соответственно.
3. Применение пробиотических препаратов способствует активации факторов неспецифического иммунитета, при этом наиболее выраженным эффектом обладает биоспорин.
Литература
1. Городецкий О. И. Антибиотики: жизнь против жизни URL: http://www.health-ua.c0m/articles/l 156.html
2. Никитин A.B. Антибиотики как регуляторы механизмов воспалительных реакций организма при инфекционном
процессе // Антибиотики и химиотерапия. 1997. №9. С, 2-4.
3. Пинешн Б.В. Современные представления о стимуляции антиинфекционного иммунитета с помощью иммуномодулирующих препаратов // Антибиотики и химиотерапия. 2000. №12. С, 3-8.
4. Kenneth Т. Bacterial Resistance to Antibiotics // Science Magazine. 2004. Vol.304. №12. P. 1421.
5. Roberfroid M. D. Prebiotics: preferential subtrates for specific germs? // Am J Clin Nutr. 2001. Vol.73. №1. P. 406-409.
6. Cummings J.H., Macfarlane G.T. Prebiotics digestion and fermentation // Am J Clin Nutr. 2001. Vol.73. №8. P. 415 - 420.
7. Егоров H.C. Что такое антибиотики // Основы учения об антибиотиках. М., 2004. С. 528.
8. Ахмедов А.М. Сальмонеллёзы молодняка. М.: Колос, 2000. 240 с.
