CC BY
21
оригинальные статьи
Пробл. особо опасных инф. 2017; 4:23-26. DOI: 10.21055/0370-1069-2017-4-23-26
УДК 616.98:579.842.23(575.2)
А.к.Джапарова1, с.ТАбдикаримов1, Г.А.Ерошенко2, н.Ю.носов2, л.м.куклева2, Д.А.Адамбеков3,
и.Ш.Альджамбаева3
оценка эффективности молекулярной диагностики YERSINIA PESTIS в полевом материале из сарыджазского очага в Кыргызстане
'Республиканский центр карантинных и особо опасных инфекций Министерства здравоохранения Кыргызской Республики, Бишкек, Кыргызская Республика; 2ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов, Российская Федерация; 3Кыргызская государственная медицинская академия им. И.Ахунбаева, Бишкек, Кыргызская Республика
цель исследования. Оценка эффективности методов молекулярной диагностики и идентификации штаммов Yersinia pestis в полевом материале, полученном в условиях Сарыджазского высокогорного очага в Кыргызской Республике. материалы и методы. Исследованы образцы полевого материала, выделенные в 2016 г. в Сарыджазском высокогорном очаге чумы, с помощью классических методов лабораторной диагностики и методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным и электрофоретическим учетом результатов. результаты и выводы. показано, что в ряде случаев молекулярно-генетический метод обладает большим разрешением по сравнению с традиционными методами лабораторной диагностики чумы. Это доказывает необходимость более широкого использования молекулярно-диагностических методов в эпизоотологическом мониторинге чумы в природных очагах в Кыргызской Республике.
Ключевые слова: возбудитель чумы, диагностика, ПЦР, штаммы.
Корреспондирующий автор: Джапарова Айгуль Кулубековна, e-mail: [email protected].
A.K.Dzhaparova1, S.T.Abdikarimov1, G.A.Eroshenko2, N.Yu.Nosov2, L.M.Kukleva2, D.A.Adambekov3, I.Sh.Al'dzhambaeva3
Evaluation of Effectiveness of Yersinia pestis Molecular Diagnostics in the Field Material from Sarydzhas Focus in Kyrgyzstan
'Republican Center on Quarantine and Particularly Dangerous Infections of the Ministry of Health of the Kyrgyz Republic, Bishkek, Kyrgyz Republic; 2Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Saratov, Russian Federation; 3I.Akhunbaev Kyrgyz State Medical Academy, Bishkek, Kyrgyz Republic
Objective of the study is to assess the effectiveness of the methods for molecular diagnostics and identification of Yersinia pestis strains in the field material obtained from Sarydzhas high-mountain focus in Kyrgyz Republic. Materials and methods. Investigated were the samples of the field material, isolated in 2016 in Sarydzhas high-mountain plague focus, using conventional methods of laboratory diagnostics and PCR with hybridization-fluorescent and electrophoretic registration of results. Results and conclusions. It is demonstrated that in a number of cases molecular-genetic method has a higher resolution as compared to conventional methods of laboratory diagnostics of plague. It proves the necessity of wider usage of molecular-diagnostic methods in epizootiological monitoring of plague in natural foci in Kyrgyz Republic.
Key words: plague agent, diagnostics, PCR, strains.
Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest.
Funding: The authors received no specific funding for this work.
Corresponding author: Aigul K. Dzhaparova, e-mail: [email protected].
Citation: Dzhaparova A.K., Abdikarimov S.T., Eroshenko G.A., Nosov N.Yu., Kukleva L.M., Adambekov D.A., Al'dzhambaeva I.Sh. Evaluation of Effectiveness of Yersinia pestis Molecular Diagnostics in the Field Material from Sarydzhas Focus in Kyrgyzstan. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2017; 4:23-26. (In Russ.). DOI: 10.21055/0370-1069-2017-4-23-26
В статье представлена оценка эффективности молекулярно-генетического исследования образцов полевого материала, полученных в 2016 г. в Сарыджазском автономном очаге чумы. Чума по-прежнему представляет собой угрозу для населения многих стран. По данным ВОЗ, на глобальном уровне около 13 тыс. человек были инфицированы чумой в 2004-2013 гг. В 2015 г. в США зарегистрировано 16 случаев чумы. На 31 октября 2017 г. общее число случаев чумы на Мадагаскаре составило 1838 и 64 смерти [11]. В 2014-2016 гг. три случая чумы зарегистрированы в Российской Федерации.
В Кыргызстане в 2013 г. произошел один случай чумы с летальным исходом. В последующие годы культуры возбудителя также выделены в природных очагах Кыргызской Республики от грызунов. В период 2012-2015 гг. зарегистрировано 10 культур Т pestis. В 2016 г. эпизоотия чумы выявлена в ур. Караколтор на территории Сарыджазского автономного очага в Тянь-Шанском природном очаге чумы. Выделено три штамма Т pestis, в том числе от трупа серого сурка, собранных с него клещей, а также группового посева сурков. В том же очаге в ур. Шакыратма по соседству с ур. Караколтор найден
загнивший труп сурка, от которого традиционными методами культуру выделить не удалось. Однако при постановке молекулярно-генетического исследования методом ПЦР в режиме реального времени была обнаружена ДНК Т pestis. Проводимый масштабный мониторинг природных очагов чумы в Кыргызской республике требует совершенствования методов диагностики и контроля чумы с привлечением современных молекулярно-генетических методов.
Все культуры Т pestis в 2013-2016 гг., включая выделенную от человека, получены в Сарыджазском высокогорном очаге чумы. Сарыджазский автономный очаг с давних пор является одним из активных и стойких очагов чумы в составе Тянь-Шаньского высокогорного очага [1, 5]. Северной частью он примыкает к сыртам систем рек Текеса и Кокжара, находящимся на территории Казахстана. На западе они граничат с Иштык-Тарагайскими сыртами Кыргызской республики, на востоке примыкают к главному горному узлу - Хан-Тенгри, а на юге - к Синьцзяню в Китае. Впервые эпизоотии чумы на участках, расположенных в верхнем и среднем течении р. Сарыджаз, установлены в 1947 г., когда чумной микроб был изолирован от сурка, отловленного в ур. Шилун. В последующие годы эпизоотологи-ческого наблюдения были выявлены новые участки со значительным количеством эпизоотийных точек, высоким процентом зараженности сурков и их эктопаразитов (ур. Эчкилиташ, Мингтур, Тюз, Шилун). Рельеф этого района отличается сильной пестротой растительного покрова. Наблюдались факты выделения одной культуры возбудителя чумы в Сарыджазских сыртах в 1957 г. из пищевых остатков стула черного коршуна. Кроме того, по одной культуре чумного микроба выделено в 1954 г. от трупа лисицы, а в 1956 г. - через групповую биопробу от 17 узкочерепных полевок [2, 3, 6]. Для предупреждения возможности полного восстановления эпизоотийной активности Сарыжазского мезоочага в 1978-1979 гг. его территория была оздоровлена методом глубинной дезинсекции нор сурков дустом ДДТ. Дустация показала высокую эффективность, после которой индексы обилия (ио) блох в шерсти сурков уменьшились в 8-19 раз и составили 0,04-0,13 против 0,8-1,1. В гнездах ИО составили в среднем 0,8 и оказались в 22 раза ниже доотработочных значений в 1976-1977 гг. (14,0-24,0).
река Койлу берет начало от слияния р. Каракол-тор, Ашуутор и Каратор. Протяженность ее от верховья до слияния с р. Сарыджаз составляет около 46 км, при ширине между хребтами, ограничивающими ее бассейн, от 9 до 19 км. Непосредственно долина реки имеет ширину 1-2 км. Левая терраса реки узкая - от 200 до 400 м, правая - до 1-2 км, пологая. Северные склоны заняты еловым лесом. лесные поляны покрыты субальпийским разнотравьем. Прибрежная зона нижней части занята высокогорной злаковой степью. Западные склоны многочисленных ущелий заболочены и покрыты влажными субальпийскими
лугами. Левый берег более сухой. Сухие злаковые степи чередуются с полынной растительностью и формациями с глинисто-шебнистой полупустыней. Западные склоны отходящих от р. Койлу ущелий в основном покрыты злаково-кобрезиевыми лугами. Бассейн р. Койлу обследовался в 1990, 1991, 1993, 1996 и 1997 гг. Эпизоотии чумы в популяции серых сурков не обнаружены. И только в 2016 г. 3 культуры чумного микроба выделены в районе ур. Караколтор, Сарыголот, Майсаз, Шакыратма. Эпидемиологическим отрядом РКЦиООИ летом 2016 г. обследован другой участок Сарыджазского автономного очага в районе ур. Кашкасуу. Полученный там полевой материал обследован в дальнейшем в условиях стационара.
Целью работы была оценка эффективности методов молекулярной диагностики и идентификации штаммов Y. pestis в полевом материале, полученном в различных участках Сарыджазского высокогорного очага в Кыргызской республике.
Материалы и методы
Для проведения бактериологического исследования на чуму использованы: агар Хоттингера (рН 7,2), приготовленный в РЦКиООИ (серия № 2 от 31.05.2016 г.). В качестве стимулятора роста чумного микроба в питательный агар добавлялся 2,5 % раствор сульфита натрия в количестве 1 мл на 100 г агара. для подавления посторонней микрофлоры использовался генцианвиолет в концентрации 1:800000. Лабораторные исследования проводили в соответствии с практическим руководством по лабораторной диагностике чумы [7, 8].
параллельно с культурально-морфологическими исследованиями образцов выполняли молекулярно-генетический анализ методом пцр с регистрацией результатов в режиме реального времени (пцр-рв), а также методом пцр с электрофоретическим учетом результатов (ПЦР-ЭФ) [9]. При постановке ПЦР использовали «Базовый набор для постановки ПЦР» производства SibEnzyme (Россия). Выделение ДНК проводили с помощью набора «ДНК-Сорб-В» (Амплисенс, (Москва). Анализ выполняли в приборе Rotor-Gene Q (Германия). Для индикации возбудителя чумы в образцах применяли «Набор реагентов для выявления ДНК Y pestis методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени (Ген Yersinia pestis -Индикация-РГФ)», Саратов, Россия. Молекулярную идентификацию методом ПЦР-ЭФ проводили в 1,5 % агарозном геле. Для определения подвидовой и биоварной принадлежности применяли праймеры на ДНК-мишени «Med24» и «45», описанные ранее [4].
Результаты и обсуждение
В 2016 г. обследование в Сарыджазском высокогорном очаге проводилось на двух эпизоотий-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Результаты биологического исследования на чуму полевого материала, выделенного в Сарыджазском высокогорном очаге чумы в 2016 г.
Всего исследовано От них поставлены биопробы Выделено штаммов
Вид грызуна индивидуальные из них павших пассажей групповые из них павших пассажей чумного микроба (Y. pestis)
Сурок серый 181
Узкочерепная полевка 124
Лесная мышь 3
Хомячок серый 1
Всего: 309
14
1 1 16
10
10
32 15
47
ных участках: в районе ур. Караколтор, Сарыголот, Майсаз, Шакыратма, а также в ур. Кашкасуу. При обследовании в 2016 г. численность сурков составила 7,1 зверька на 1 кв. км площади. Более высокая численность в бассейне р. Койлу отмечалась в верховьях в ур. Каратор, Караколтор, Ашуутор - 19,2 зверька на эту же единицу площади. Сравнение с данными учетных работ предыдущих лет обследований свидетельствуют об увеличении численности сурков. В период работы отряда климат Койлу был более суровым, чем на остальной территории. Зима была продолжительной. Осадков выпало больше, чем в прошлом году на 30-40 %. Весна была затяжной с большим количеством осадков. В течение всего периода работы были также частые осадки в виде дождя и града. Большое количество осадков во время вегетации растительности дало возможность создания высокого травостоя и кормовой базы для животных.
Во время работы отряда рцКиООи в районе ур. Караколтор в 2016 г. всего отловлено 309 экз. грызунов, из них серых сурков - 181, узкочерепных полевок - 124, лесных мышей - 3, серых хомячков - 1, узкочерепных полевок - 2 (таблица). Собрано 498 эктопаразитов, из них 145 блох, 344 клещей и 9 вшей. Весь комплекс лабораторных исследований проводился классическим методом в полевых условиях. Собранный материал исследован бактериологическим, серологическим и биологическим методом. Три культуры чумного микроба, выделенные в ур. Караколтор, Сарыголот, были типичными по морфологическим и тинкториальным свойствам, хорошо лизировались чумным и псевдотуберкулезным бактериофагами. Они были глицерин-позитивны, не разлагали рамнозу, Д^ для белых мышей составил более 103 м.к.
В результате проведенных исследований из 63 поставленных биопроб были выделены три культуры Y pestis, которые, кроме классических методов, были также подтверждены методом Пцр в режиме реального времени в стационарных условиях. В остальных образцах биопроб культурально-морфологическими методами и методом Пцр-рВ возбудитель чумы не обнаружен.
На обследованной территории в секторе ур. Шакыратма обнаружен труп молодого серого сурка массой 0,4 кг, длина тела - 22 см. При визуальном осмотре увеличения лимфоузлов не отмечено. При вскрытии трупа внутренние органы были без
особых видимых паталого-анагомических изменений. Биологическим методом были заражены белые мыши подкожно и накожно по 0,5 мл. Проба доведена до трех пассажей, биопробы были вскрыты на 6-е сутки, поставлена проба с бактериофагами чумным Покровским, псевдотуберкулезным и Л-413, результат которых оказался отрицательным.
Из органов найденного трупа сурка, из которых не удалось выделить культуру возбудителя чумы, были получены взвеси тканей печени, селезенки, крови. При проведении индикации методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени с использованием набора «Ген Yersinia pestis - Индикация-РГФ» (Саратов, Россия) в них была выявлена ДНК Y pestis (рисунок).
Для молекулярной идентификации образцов ДНК методом ПЦР-РВ и ПЦР-ЭФ по подвидовой и биоварной принадлежности использованы прайме-ры на ДНК мишень «45» - участок ДНК, в котором у штаммов основного подвида содержится делеция в 45 п.н. У исследованных образцов сигнал по этой ДНК-мишени в ПЦР-РВ отсутствовал, что свидетельствовало об их принадлежности к основному подвиду [4]. Методом ПЦР-ЭФ с использованием праймеров на другую ДНК-мишень - «Med24», на участке которой у штаммов Y. pestis основного подвида средневекового биовара содержится делеция в 24 п.н., установлена принадлежность исследуемых образцов ДНК из сурков к штаммам античного биовара основного полвида, поскольку маркерная делеция штаммов средневекового биовара у них отсутствовала. Ранее нами при исследовании штам-
0,7
0,6
ZS
ш о 0,5
о
Ц 0,4
■В-
£ а 0,3
X 0,2
0,1
0,0
^^^—~
Порог . —^L— —
Цикл
Выявление ДНК У. pestis в образцах органов из трупов сурков, найденных в ур. Караколтор (1) и Шакыратма (2) в 2016 г., а также в ур. Кашкасуу (3, 4) в 2016 г.; 5 - положительный контроль; 6 - отрицательный контроль
8
3
2
8
3
1
2
мов Y pestis из Сарыджазского высокогорного очага установлена их принадлежность к античному биовару основного подвида, древней филогенетической ветви 0.ANT [10].
Во время работы отряда РЦКиООИ в другом эпизоотийном участке - ур. Кашкасуу летом 2016 г. отловлено 50 экз. сурков, из них у 2 подозрительных на чуму сурков отобраны образцы тканей (печень, селезенка, кровь), которые были заморожены и далее исследованы в условиях стационара. С помощью набора для выделения ДНК «ДНК-Сорб-В» из них получена ДНК, которую анализировали методами ПЦР-РВ и ПЦР-ЭФ. С помощью ПЦР-РВ с применением тест-системы «Ген Yersinia pestis - Индикация-РГФ» в этих образцах выявлено наличие ДНК чумного микроба. В ПЦР с праймерами на мишени «Med24» и «45» проведена молекулярная идентификация образцов и установлена их принадлежность к штаммам основного подвида античного биовара Y pestis.
Таким образом, нами показана эффективность использования методов молекулярной индикации и идентификации ПЦР-РВ и ПЦР-ЭФ для анализа на чуму полевого материала, выделенного в Сарыджазском высокогорном очаге чумы. В некоторых случаях (например, при анализе образцов тканей сурка из ур. Шакыратма) метод ПЦР оказался более чувствительным по сравнению с традиционными методами лабораторной диагностики чумы. Эти данные свидетельствуют о необходимости широкого применения методов молекулярной диагностики для повышения эффективности эпизоотологического мониторинга в природных очагах чумы Кыргызской Республики
конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Айкимбаев А.М., Литвак Я.И., Шварц А.В. Руководство по эпидемиологическому надзору в горных очагах чумы Тянь-Шаня и Алая. Алма-Ата; 1991. 123 с.
2. Дмитриевская М.Е., Крылов Д.Г., Тарасов П.П. Опыт выявления и некоторые особенности чумных эпизоотий в Сарыджасских сыртах. В кн.: Труды Средне-Азиатского научно-исследовательского противочумного института. Алма-Ата-Фрунзе; 1961. Т. 7. С. 61-71.
3. Дмитриевская М.Е., Тарасова Н.Е. Случай выделения культуры чумного микроба от лисицы в Центральном Тянь-Шане. В кн.: Труды Средне-Азиатского научно-исследовательского противочумного института. Алма-Ата; 1959. Т. 5. С. 271-2.
4. Ерошенко Г.А., Одиноков Г.Н., Куклева Л.М., Павлова А.И., Краснов Я.М., Шавина Н.Ю., Гусева Н.П., Виноградова Н.А., Кутырев В.В. Стандартный алгоритм молекулярного типи-рования штаммов Yersinia pestis. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2012; 3:25-35.
5. Кутырев В.В., Попова А.Ю., редакторы. Кадастр эпидемических и эпизоотических проявлений чумы на территории Российской Федерации и стран ближнего зарубежья (с 1876 по 2016 год). Саратов: ООО «Амирит»; 2016. 248 с.
6. Лаврентьев А.Ф., Популях П.А. Случай обнаружения спонтанных зараженных чумой неспецифических носителей. В кн.: Труды Средне-Азиатского научно-исследовательского противочумного института. Алма-Ата; 1959. Т. 5. С. 273-7.
7. Лабораторная диагностика полевого материала на чуму. Методическое руководство. Бишкек; 2006.
8. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., редакторы. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. М.: ЗАО «Шико»; 2013. 560 с
9. Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности. МУ 1.3.2569-09. М.; 2009.
10. Eroshenko G.A., Nosov N.Y., Krasnov Y.M., Oglodin Y.G., Kukleva L.M., Guseva N.P., Kuznetsov A.A., Abdikarimov S.T., Dzhaparova A.K., Kutyrev V.V. Yersinia pestis strains of ancient phylogenetic branch 0.ANT are widely spread in the high-mountain plague foci of Kyrgyzstan. PLoS One. 2017; 12(10):e0187230. DOI: 10.1371/journal.pone.0187230.
11. Tsuzuki S., Lee H., Miura F., Chan Y.H., Sung-mok Jung S.M., Akhmetzhanov A.H., Nishiura H. Dynamics of the pneumonic plague epidemic in Madagascar, August to October 2017. Euro Surveill. 2017 Nov; 22(46). DOI: 10.2807/1560-7917. ES.2017.22.46.17-00710. PMID: 291622.
References
1. Aikimbaev A.M., Litvak Ya.I., Shvarts A.V. [Guidelines on Epidemiological Surveillance in the Mountain Plague Foci of Tien-Shan and Alai]. Alma-Ata; 1991. 123 p.
2. Dmitrievskaya M.E., Krylov D.G., Tarasov P.P. [Experience in detection and certain peculiarities of plague epizooties in Sarydzhas syrtas]. In: [Works of Central-Asian Research Anti-Plague Institute]. Alma-Ata-Frunze; 1961. Vol. 7. P. 61-71.
3. Dmitrievskaya M.E., Tarasova N.E. [A case of plague microbe culture isolation from a fox in Central Tien-Shan]. In: [Works of Central-Asian Research Anti-Plague Institute]. Alma-Ata; 1959. Vol. 5. P. 271-2.
4. Eroshenko G.A., Odinokov G.N., Kukleva L.M., Pavlova A.I., Krasnov Ya.M., Shavina N.Yu., Guseva N.P., Vinogradova N.A., Kutyrev V.V. [Standard algorithm of molecular typing of Yersinia pestis strains]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 2012; 3:25-35.
5. Kutyrev V.V., Popova A.Yu., editors. [Cadastre of Epidemic and Epizootic Manifestations of Plague in the Territory of the Russian Federation and Neighboring Countries (1876-2016)]. Saratov: "Amirit"; 2016. 248 p.
6. Lavrentiev A.F., Populyakh P. A. [A case of detection of spontaneous plague infected non-specific carriers]. In: [Works of Central-Asian Research Anti-Plague Institute]. Alma-Ata; 1959. Vol. 5. P. 273-7.
7. [Laboratory Diagnostics of Field Material for the Presence of Plague Microbe]. Methodological Recommendations. Bishkek; 2006.
8. Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., editors. [Laboratory Diagnostics of Dangerous Infectious Diseases]. Practice Guidelines. 2nd edition, revised and updated. M.: "Shiko"; 2013. 560 p.
9. [Management of laboratories using methods of nucleotide acids amplification when handling materials containing microorganisms of the I-IV groups of pathogenicity]. MR 1.3.2569-09. M.; 2009.
10. Eroshenko G.A., Nosov N.Y., Krasnov Y.M., Oglodin Y.G., Kukleva L.M., Guseva N.P., Kuznetsov A.A., Abdikarimov S.T., Dzhaparova A.K., Kutyrev V.V. Yersinia pestis strains of ancient phylogenetic branch 0.ANT are widely spread in the high-mountain plague foci of Kyrgyzstan. PLoS One. 2017; 12(10):e0187230. DOI: 10.1371/journal.pone.0187230.
11. Tsuzuki S., Lee H., Miura F., Chan Y.H., Sung-mok Jung S.M., Akhmetzhanov A.H., Nishiura H. Dynamics of the pneumonic plague epidemic in Madagascar, August to October 2017. Euro Surveill. 2017 Nov; 22(46). DOI: 10.2807/1560-7917.ES.2017.22.46.17-00710. PMID: 291622.
Authors:
Dzhaparova A.K., Abdikarimov S.T. Republican Center on Quarantine and Particularly Dangerous Infections of the Ministry of Health of the Kyrgyz Republic. 92, Skryabina St., Bishkek, Kyrgyz Republic. E-mail: ai_moon74@ mail.ru.
Eroshenko G.A., Nosov N.Yu., Kukleva L.M. Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe". 46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation. E-mail: [email protected].
Adambekov D.A., Al'dzhambaeva I.Sh. I.Akhunbaev Kyrgyz State Medical Academy. 92, Akhunbaeva St., Bishkek, Kyrgyz Republic. E-mail: [email protected].
об авторах:
Джапарова А.К., Абдикаримов С.Т. Республиканский центр карантинных и особо опасных инфекций Министерства здравоохранения Кыргызской Республики. Кыргызская Республика, Бишкек, ул. Скрябина, 92. E-mail: [email protected].
Ерошенко Г.А., Носов Н.Ю., Куклева Л.М. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: rusrapi@ microbe.ru.
Адамбеков Д.А., Альджамбаева И.Ш. Кыргызская государственная медицинская академия им. И.Ахунбаева. Кыргызская Республика, Бишкек, ул. Ахунбаева, 92. E-mail: [email protected].
Поступила 22.11.17.
