CC BY
26
клинико-диагностической службы»
7. Мошкин А. В., Кондрашева Е. А., Котова О. М. Зависимость качества результатов в
рутинной клинической химии от используемых аналитических систем» /Клин.лаб. диагностика.-2000.-№11.- С.44-46
ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВТОРИЧНОГО АНТИФОСФОЛИПИДНОГО СИНДРОМА ПРИ АУТОИММУННОЙ ПАТОЛОГИИ
Н.В. Ким, Н.В. Попова, Л.В. Козина Национальный научный медицинский центр, Астана, Казахстан
Вторичный антифосфолипидный синдром (АФС) - широко распространенный аутоиммунный процесс, в основе которого лежит образование в организме в высоком титре антифосфолипидных антител (АФА) на фоне уже существующей аутоиммунной патологии, злокачественных новообразований, инфекционных и инфекционно-иммунных заболеваний, вследствие приема ряда лекарств [1]. Чаще всего вторичный АФС развивается при аутоиммунных заболеваниях (АИЗ): системная красная волчанка, ревматоидный артрит, системная склеродермия, системные заболевания соеденительной ткани, и т.д [2]. При АИЗ помимо симптоматики основного заболевания, происходит развитие тромбо-филического статуса, вследствие снижения тромборезистентности эндотелия, активации тромбоци-тарного гемостаза и дисбаланса в системе коагуляционного гемостаза. Все клинические проявления тромбофилии обусловлены гиперпродукцией АФА. Мишени АФА - это отрицательно заряженные мембранные фосфолипиды: кардиолипин, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин ,фосфотидило-вая кислота; связанные с ними гликопротеины: ß2-гликопротеин-1(ß2-ГПI), аннексин V, протромбин; и белки: тромбомодулин, протеины С и S, фактор XI, кининоген, мембранные белки тромбоцитов и эндотелиоцитов. Антитела блокируют фосфолипидо-белковые комплексы как свободных фосфоли-пидных микровезикул плазмы крови (липопротеины, факторы свертывания), так и лабилизированных клеточных мембран эндотелия, тромбоцитов и других клеток. [3]. Другое проявление АФС - снижение активности антитромбина III и депрессия противосвертывающих механизмов, в частности в системах протеина С, тромбомодулина и фибринолиза. Происходит торможение активации и взаимодействия между собой плазменных факторов свертывания крови, в лабораторных тестах выявляется положительный волчаночный антикоагулянт (ВА). Для присоединения АФА к антигенам, необходимы кофакторы гликопротеины. Важнейшими из них являются р2-ГП!, аннексин V, протромбин и тромбин [1].
Число аутоиммунных заболеваний, а как следствие, развитие на их фоне вторичного АФС неуклонно растет. Как причина тромбофилии АФС выступает на первое место. На современном этапе очень важна правильная и своевременная лабораторная диагностика. Большое число разных по качеству лабораторных тестов, недостаточное оснащение специализированных лабораторий создает определенные сложности. Целью нашей работы явилось оценить эффективность лабораторной диагностики АФС в центре и найти пути ее усовершенствования.
Материалы и методы. Исследования проведены на 40 пациентах с аутоиммунной патологией, находящихся на стационарном лечении в отделении терапии. Распределение по диагнозам следующее: 26(65%) - системная красная волчанка, 5(12,5%) - системная склеродермия, 4(10%) - ревматоидный артрит, 3(7,5%) - системные заболевания соединительной ткани и по 1(2,5%) - узелковый полиартрит и дерматополимиозит. АФА IgG/IgM определяли методом количественного твердофазного ИФА наборами Anti-Phospholipid Screen IgG/IgM фирмы ORGENTEC на иммуноферментном анализаторе ChemWell. ВА определяли двумя типами наборов «Экспресс-люпус-тест» и «Люпус-тест» фирмы «Технология Стандарт» на механическом коагулометре Thrombostat 2. Материалом для лабораторных исследований ВА служила бедная тромбоцитами плазма, а для определения АФА - сыворотка крови, полученная в один и тот же день. Согласно последним Сиднеевским Критериям АФС (2006г.) в качестве достаточного лабораторного критерия предложен любой из трех компонентов: 1) ВА должен определяться не менее 2 раз на протяжении 12 недель. 2) Анти-кардиолипиновые антитела класса IgG/IgM (Анти-КЛ Ат IgG/IgM) должны определяться не менее 2 раз в концентрациях выше нормы минимум в 2 раза на протяжении 12 недель. 3) Ат к р2-ГП! должны определяться не менее 2 раз в концентрациях выше нормы минимум в 2 раза на протяжении 12 недель [6].
Для обнаружения АФА приемлемо использование скрининговых диагностических наборов (Anti-Phospholipid Screen IgG/IgM) содержащих смесь всех видов высокоочищенных ФЛ ассоциированных с ГП - эти тесты более чувствительны, чем определение только одного вида АФА, например Анти-КЛ Ат IgG/IgM. Следует иметь в виду, что и при достаточно полном иммунологическом обследовании значительная часть случаев АФС (по разным данным в пределах 35-60%) остается нераспознанным, если одновременно не определяются в плазме ВА [5].
Для определения ВА в соответствии с рекомендациями субкомитета по АФС/ВА Комитета по науке и стандартизации Международной Ассоциации по тромбозам и гемостазу (2000, 2002) используется трехэтапное выявление эффектов аутоантител, обладающих свойствами ВА [2]. Как известно для
обнаружения ВА есть два типа диагностических наборов: экспресс-наборы на основе одной реакции АЧТВ и трехэтапные наборы на основе трех реакций - АЧТВ, ПВ и ВА. Экспресс-наборы благодаря простоте выполнения исследования и относительно недорогой цене пользуются большим спросом. Но определение ВА в них основано на одном тесте АЧТВ с высокочувствительным к ВА реагентом, что полностью не исключает влияния дефицита факторов свертывания и других причин. В трехэтапных наборах, рекомендованных Международной Ассоциацией, принцип определения ВА основан на том, что гипокоагуляция, обусловленная этим ингибитором свертывания не корригируется нормальной бедной тромбоцитами плазмой, но исправляется добавлением к исследуемой плазме источника фос-фолипидов (тромбоцитина). Т.е проводятся скрининговые и противовесные тесты, а патологические результаты в них проверяются в подтверждающих тестах [2,7].
Результаты и обсуждение. По нашим исследованиям повышение показателей ВА и АФА IgG/ IgM среди пациентов с аутоиммунной патологией наблюдается довольно часто и составляет соответственно 60% и 40%. Положительный ВА со средним значением 1,44±0,24 ед, АФА IgG/IgM повышены в среднем в 2 раза от нормы: 10 ед. Нельзя ставить знак равенства между АФС и ВА, в некоторых случаях при коагулологических признаках ВА не находят иммунологических признаков АФС, в свою очередь АФС не всегда сопровождается коагулологическими признаками ВА [1]. Считается, что ВА обладает более высокой специфичностью, а Анти-КЛ Ат IgG/IgM - большей чувствительностью для диагностики АФС: ВА чувствительность 29-59%, специфичность 81-86%, анти-Кл Ат IgG чувствительность 45-68%, специфичность 71-75%.
Среди обследованных пациентов с клиническими проявлениями АФС сочетание повышенных АФА IgG/IgM и положительный ВА выявлены у 10(25%). Повышение АФА IgG наблюдалось в 13(32,5%) случаях, а АФА IgM в 16(40%). Причиной более частого повышения АФА IgM может быть госпитализация и взятие крови на анализ в период обострения и активации аутоиммунного воспаления, а так же повышение АФА IgM из-за сопутствующей патологии. Известно, что распространенные инфекции, вызванные вирусом гепатита С, ВИЧ, вирусом Эпштейна-Бар, парвовирусом В19, стрептококками, H.pylori, а так же возбудителями сальмонеллеза и инфекций мочевыводящих путей являются частыми индукторами образования анти-КЛ Ат IgM [9]. При них специфические IgM появляются в низких титрах и плавно снижаются после выздоровления. Если исключить влияние этих инфекций, то истинное повышение анти-КЛ Ат IgM при АФС гораздо ниже.
Сравнительный анализ концентраций АФА IgG и АФА IgM показал увеличение IgG в 2,5 раза, а IgM в 2 раза от нормы. Это доказывает, что большая часть ВА являются АФА IgG, и именно они участвуют в аутоиммунных реакциях, это подтверждается большинством исследователей [2,3,6]. Описано, что на долю антител обладающих свойствами волчаночного антикоагулянта, приходится около 70% всех антифосфолипидных антител [2]. Среди пациентов нашей клиники в 11(27,5%) случаев повышенные АФА IgG/IgM подтверждаются положительным ВА. Mожно предположить, что низкий процент связан с использованием экспресс-набора для определения ВА. Известно, что ВА по своей природе неоднороден и полное его выявление требует использования всех предложенных для этого фос-фолипид-зависимых скрининговых и подтверждающих методик, прошедших апробацию в многоцентровых исследованиях. Кроме того немаловажен преаналитический этап, непрямые антикоагулянты искажают результаты теста, а попадание в плазму разрушенных тромбоцитов блокирует АФА и дают ложноотрицательные результаты ВА. Показано, что при АИЗ происходит повышение ревматоидного фактора (РФ), СРБ, антистрептолизина-О и специфических Ат. РФ в высоких концентрациях мешает определению АФА [1].
После скринингового обследования набором Anti-Phospholipid Screen IgG/IgM международными требованиями рекомендован второй этап диагностики АФС - отдельное определение Анти-КЛ Ат IgG/ IgM и IgG-Ат к р2-ГП! [6]. Доказано что, Анти-КЛ Ат являются основной фракцией АФА, это объясняет постоянную ложноположительную реакцию Васермана у больных АИЗ. Кардиолипин является компонентом внутренней митохондриальной мембраны, содержится в большом количестве в плазме здоровых людей, будучи в ней заблокирован другими компонентами и бывает положительным не только при АФС, но и при других видах патологии [3,8]. Ранее согласно международным предварительным критериям АФС (Sapporo,1999) обязательные лабораторные методы лабораторной диагностики включали определение Анти-КЛ Ат IgG/IgM и обнаружение ВА. Но со временем применение только этих двух официальных критериев вызвало неудовлетворенность многих клиницистов, оба теста могли быть отрицательными при наличии клинических проявлений АФС и позволяли выявить АФС только в 70-80%.
Для определения риска тромбогенности при АФС главный тест это IgG-Ат к р2-ГП!, имеющий высокую чувствительность 29-58% и специфичность 80-95%. Для сравнения анти-КЛ Ат IgG чувствительность 53-77% и специфичность 72-85%. А ВА чувствительность 59-65% и специфичность 82-87%. р2-ГП! присутствует в нормальной плазме, связанный с отрицательно заряженными частицами - анионными фосфолипидами, гепарином и липопротеинами (его называют также аполипопротеином Н) и обладает естественной антикоагулянтной активностью. Однако определение IgG-Ат к р2-ГП! не может быть использовано в качестве лабораторного критерия диагностики АФС, так как это исследование
не стандартизовано на международном уровне. Сейчас этот тест дополняет выявление Анти-КЛ Ат IgG/IgM [6].
Для третьего этапа лабораторной диагностики АФС необходимы дополнительные тесты определения АФА и их кофакторов. Виды АФА это: Ат к фосфатидилинозитолу (Ат к АФИ), фосфатидил-серину (Ат к АФСе), фосфатидиловой кислоте (Ат к АФК). Виды кофакторов: Ат к аннексину V, Ат к протромбину и Ат к тромбину.
Например, для определения причины тромбоцитопении необходимо определение Ат к АФИ, Ат к АФСе, Ат к АФК. Определять отдельные виды АФА можно для исследователей при установлении серологических вариантов серонегативного АФС (т.е. с отрицательным результатом на Анти-КЛ Ат IgG/IgM).
т к аннексину V не только специфичны для АФС, но так же повышены у пациентов с СКВ и РА, считается что концентрация их выше именно при вторичном АФС, по сравнению с первичным. Аннексин V это кальций-зависимый белок, представлен на эндотелиоцитах, обладает антикоагулянт-ными свойствами. На плаценте аннексин V покрывает фосфолипиды по типу ковра, оказывая местный антикоагулянтный эффект и поэтому во время физиологической беременности на поверхности тро-фобласта не происходит тромбообразования. При АФС и на фоне инфекционных процессов возрастает концентрация Ат к аннексину V и повышается риск потери плода, из-за развития тромботической васкулопатии и гипоксии.
т к протромбину являются основной причиной тромбоза у пациентов с СКВ (IgM - 12%, IgG -14%) и АФС. Эти Ат связываются с тромбоцитами, активированными тромбином, и подавляют эндо-телиальный синтез мощного естественного ингибитора агрегации тромбоцитов и вазодилататора - простациклина [4]. Это приводит к гиперактивности тромбоцитов и снижению тромборезистентности эндотелия. Причем при повышении этих антител повышается риск таких серьезных осложнений, как тромбоз глубоких вен бедра, эмболии легочной артерии, инфаркта миокарда.
т к тромбину - новый тест для диагностики АФС и имеет наибольшую чувствительность именно для диагностики тромбоэмболических осложнений. У 67% пациентов с повышенным содержанием этих антител наблюдаются тромбозы, для сравнения при Ат к р2-ГП! в 62%, при положительном ВА - 63%. В настоящее время тест стандартизируется на международном уровне.
Выводы. Для современной иммуннодиагностики АФС необходимо выполнение всех этапов: скрининга, подтверждения и дополнительных критериев. Скрининговое исследование с помощью Anti-Phospholipid Screen IgG/IgM недостаточно для полной диагностики АФС и дает низкий процент выявления АФА. Дополнительные тесты определения видов АФА и кофакторов АФА позволят более полно понять патогенез и оценить риск тромботических осложнений в каждом конкретном случае. Достоверное определение и правильная интерпретация ВА требует работы квалифицированного врача в условиях оснащенной гемостазиологической лаборатории. Полная лабораторная диагностика АФС - это использование зарегистрированных на международном уровне тест-систем, соблюдение кратности обследования и совместная врача-клинициста и специализированной лаборатории.
Литература
1. Л.Н. Кирпичёнок. Лабораторная диагностика аутоиммунных заболеваний: Дис. ...к-та мед. наук. - Витебский государственный медицинский университет. - 2000г. - 90с.
2. С.Баркаган, А.П.Момот, Л.П.Цывкина и др. Основы лабораторной диагностики «Антифосфолипидного синдрома». - Алтайский государственный медицинский университет. - г.Барнаул. - 2000г.- 5с.
3. Момот А.П., Патология гемостаза. Принципы и алгоритмы клинико-лабораторной диагностики. - Санкт-Петербург. - ФормаТ. - 2006г. - 208с.
4. Козлов А.А, Берковский А.Л., Мелкумян А.Л., и др. Клиническая и лабораторная диагностика наиболее часто встречающихся нарушений гемостаза. - Москва. - НПО «Ренам». - 2008г.
- 42с.
5. В.В.Долгов, П.В. Свирин. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза. - Москва. - ООО «Издательство «Триада». - 2005г. - 227с.
6. Рытикова Н.С., Смирнова М.А., Уголькова Н.В. и др. Каталог том II. Наборы и оборудование для клинической лабораторной диагностики. Группа компаний «БиоХимМак».
- Москва. - 2009г. - 992с.
7. «Технология-Стандарт». Инструкция по применению набора реагентов для определения антикоагулянта волчаночного типа «Экспресс-Люпус-тест» и «Люпус-тест» - г. Барнаул.
- 2009г. - 4с.
8. Orgentec Diagnostika GmbH. Instruction for use Anti-Phospholipid Screen IgG/IgM. - Mainz. -2001г. - 4с.
9. Макацария А.Д., Бицадзе В.О., Гениевская М.Г. и др. Антифосфолипидный синдром в акушерской практике. - Москва. -2000г. - 215с.
