Оценка чувствительности и специфичности метода ПЦР для видовой идентификации коров, свиней и кур Текст научной статьи по специальности «Животноводство и молочное дело»

УДК 636.082.12:575.113

ОЦЕНКА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ И СПЕЦИФИЧНОСТИ МЕТОДА ПЦР ДЛЯ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ КОРОВ, СВИНЕЙ И КУР*

Е.Н. КОНОВАЛОВА, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник ВИЖ Россельхозакадемии О.В. ВАВИЛОВА, кандидат биологических наук Великолукская ГСХА

Е.А. ГЛАДЫРЬ, кандидат биологических наук, зав. лабораторией

Н.А. ЗИНОВЬЕВА, академик РАСХН, директор ВИЖ Россельхозакадемии E-mail: [email protected]

Резюме. С использованием разработанной методики ПЦР-анализа гена цитохрома В (cyt b) мтДНК дана оценка универсальности метода ПЦР для идентификации ДНК животного происхождения трех видов: корова (Bos Taurus), свинья (Sus scrofa domestica), курица (Gallus gallus). Изучена специфичность метода в зависимости от вида образца и способа его обработки (механическая, термическая, химическая). Оценена пригодность для анализа смешанных продуктов (имеющих в составе два и более видовых источника). Исследования выполняли на 72 образцах различного происхождения: бульон говяжий, колбаса 3-х сортов, курица готовая 2-х видов, майонез, молоко коровье 2-х видов, мясо свиньи, паштет из говяжьей печени, пирог, сыр трех сортов, продукты из творога 2-х видов, фарш 4-х видов из сырья одного вида и смешанного, яйцо, ушные выщипы коров, свиней, волосы коров, перо кур. По результатам ПЦР-анализа быладостигнута 100 %-ная видоспецифичная амплификация сырых продуктов, продуктов после механической, термической, механической и термической, термической и химической обработки. Успешная амплификация целевыхфрагментов в образцахконсервированных биологических проб достигалась в 82,4 % случаев. Предложенный метод можно использовать в молекулярно-генетическихлабораторияхдля видовой идентификации продуктов животного происхождения. Ключевые слова: идентификация видового состава, Bos Taurus, Sus Scrofa, Gallus Gallus, ПЦР, цитохром В, cyt b, мтДНК.

Один из важных элементов поддержания здоровья населения - обеспечение качества пищевых продуктов, контроль которого осуществляется различными методами ветеринарно-санитарной экспертизы [1, 2]. Один из аспектов проведения такой оценки - определение ассортиментной фальсификации продуктов, под которой подразумевается замена одного вида животного сырья другим, менее ценным. Сегодня для видовой идентификации применяют такие аналитические методы, как масс-спектрометрический анализ выявления специфических различий в актине, гемоглобине, миоглобине и альбумине [3], фракционное разделение экстрактов мышечной ткани посредством газовой хроматографии [4], иммунодиффузия [5] и др. Однако все они основаны на анализе белков или не разрушенных тканевых структур и их применение невозможно при оценке переработанных продуктов, подвергшихся механической или термической обработке, влекущей дегенеративные клеточные изменения.

Как известно, наиболее стабильная структура животного организма - ДНК. Будучи устойчивой к воздействию температурных, химических и механических факторов, она не утрачивает своей информативной функции под

*Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ, шифр 2012-1.4-12000-1001-010. В проведении исследований использовано оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.

влиянием агрессивных воздействий. В связи с этим наиболее чувствительным и специфичным для идентификации видовой принадлежности ДНК и определения сырьевого состава продукции сегодня считается метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) [6...9].

Цель наших исследований - оценить универсальность метода ПЦР для идентификации ДНК животного происхождения трех видов: корова (Bos Taurus), свинья (Sus scrofa domestica), курица (Gallus gallus). В частности, зависимость его чувствительности и специфичности от вида продукта или исследуемой биологической ткани, способа обработки продукции (механическая, термическая, химическая) и породной принадлежности, а также пригодность метода для анализа смешанных продуктов (имеющих в составе два и более видовых источника).

Условия, методы и материалы. Для анализа были отобраны образцы различных пищевых продуктов, а также ДНК животных из банка ДНК лаборатории молекулярной генетики ВИЖ Россельхозакадемии (табл. 1).

Таблица 1. Характеристика образцов, из которых была выделена ДНК

Продукт Видовой источник Число проб

Бульон говяжий корова 2

Колбаса сортов «Докторская», сервелат «Московский», сервелат «Финский» корова 6

Курица запеченная, курица копченая курица 4

Майонез курица 1

Молоко коровье сырое и используемое для вымачивания свинины в течение 24 ч корова 4

Мясо свиньи свинья 2

Паштет из говяжьей печени корова 2

Пирог из сметанного теста корова 2

Сыр сортов «Российский», «Маас-дам», «Моцарелла» корова 5

Творог сырой из коровьего молока, творожная запеканка корова 4

Фарш говяжий, свиной, говядина+курица, свинина+курица корова 8

Яйцо куриное курица 2

Ушные выщипы и волосы коров ЗАО ПЗ «Рабитицы» и «Ленинский путь» корова 5

Перо кур курица 4

Ушные выщипы свиней свинья 5

Ушные выщипы коров пород чернопестрая, холмогорская, симментальская, костромская корова 16

ДНК из всех проб выделяли методом осаждения на кремниевом сорбенте при помощи набора Diatom Prep согласно протоколу. В качестве целевого фрагмента для ПЦР был выбран ген цитохрома В (cyt b) мтДНК, известный как наиболее консервативный регион митохондриального генома. Все пробы ДНК были исследованы в ПЦР в зависимости от видового источника. Последовательности праймеров, а также температурные и временные условия ПЦР были оптимизированы ранее [10, 11]. Электрофорез продуктов амплификации проводили по стандартной методике [12].

Для оценки чувствительности и специфичности при анализе различного биологического материала была

Таблица 2. Результаты анализа видового состава проб ДНК разных видов

Число Идентифиц ировано

Видовой источник источ- ников абсолютное число %

Корова (Bos Taurus) 54 50 92,6

Свинья (Sus scrofa domestica) 12 11 91,7

Курица (Gallus gallus) 12 11 91,7

Итого 78 72 92,3

проведена ПЦР проб сырых и переработанных пищевых продуктов, а также анализ ДНК, выделенной из таких источников, как ушные выщипы, шерсть животных и перо птицы.

В зависимости от способа переработки все пробы условно подразделяли на следующие категории: сырой продукт, механически обработанный, термически обработанный, подвергшийся одновременно механической и термической обработке, термической и химической обработке. Также была выделена отдельная категория «необработанная биологическая ткань», которая объединяла пробы крови, ушных выщипов и волос (пера), использованные для выделения ДНК.

Таблица 3. Чувствительность метода ПЦР для видовой идентификации в зависимости от способа обработки продукта

Вид обработки Число образцов

всего в том числе успешно амплифицированных

n %

Без обработки 8 8 100,0

Механическая 6 6 100,0

Термическая 6 6 100,0

Механическая + тер-

мическая 17 17 100,0

Термическая + хими-

ческая 2 2 100,0

Необработанная

биологическая ткань 34 28 82,4

в среднем по всем видам 92,3 % (табл. 2). В 7,7 % целевые фрагменты не амплифицировались. Анализ факторов, влияющих на получение ПЦР-сигнала, показал, что отсутствие амплификации наблюдалось в пробах, выделенных из биологических тканей (ушных выщипов, волос, пера, крови). Вероятно, подобная картина связана с ингибирующим влиянием консервантов, использующихся для хранения биологического материала, и, как следствие, получения ДНК низкого качества. Во всех пробах пищевых продуктов, независимо от вида обработки, наблюдалась 100 %-ная амплификация соответствующего вида (табл. 3).

Табл. 4. Результаты анализа проб смешанных продуктов

Продукт Видовые источники

Предпо- лагае- мые Фактически обнаружен- ные

Молоко, в котором вымачива- корова, корова,

лись свиные стейки 24 ч свинья свинья

Фарш свинина+говядина корова, корова,

сырой свинья свинья

Фарш пельменный корова, корова,

говядина+курица сырой курица курица

Для анализа чувствительности метода ПЦР в зависимости от породы было проанализировано 16 проб ДНК черно-пестрой, холмогорской, симментальской и костромской пород - по 4 пробы от каждой.

Результаты и обсуждение. В ходе исследований был проведен анализ 72 проб ДНК, выделенных из различных источников. Так как некоторые пробы имели смешанный состав, например, фарш говядина + свинина, то видовых источников было 78.

Эффективность амплификации в ходе определения видовой принадлежности образцов продукции составила

Оценка чувствительности метода ПЦР для идентификации вида в зависимости от породы показала, что фрагмент гена цитохрома В мтДНК коровы амплифици-ровался в ПЦР у подавляющего большинства животных независимо от породы. Это в очередной раз подтверждает высокую консервативность указанного гена, наименее подверженного мутациям, что делает его вполне пригодным для анализа видового происхождения.

Определение эффективности амплификации проб фарша смешанного происхождения (говядина+курица, говядина + свинина) и молока, в котором в течение суток вымачивали свиные стейки, показало, что фактически обнаруженные источники на 100 % совпали с предполагаемыми (табл. 4). Это указывает на высокую чувствительность метода. Исследование на наличие ДНК других видов продемострировало отсутствие ложноположительных результатов.

Выводы. Таким образом, в ходе исследований установлено, что разработанный метод характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью, подходит для видовой идентификации, как биологического материала (кровь, кожа, шерсть, перо), так и пищевых продуктов различного происхождения. С его помощью можно определить ДНК вида независимо от породной принадлежности биоматериала или способа переработки продукции. Кроме того, метод подходит для анализа продуктов, имеющих в составе два или более видовых источника.

Литература.

1. Буркин А.А., Кононенко Г.П., Буркин М.А. Методы санитарного контроля животноводческой продукции. Сообщение I. Иммуноферментный анализ тетрациклинов// Сельскохозяйственная биология. - 2010. - № 4. - с. 110-117.

2. Кононенко Г.П., Буркин А.А. Методы санитарного контроля животноводческой продукции. Сообщение II. Иммуноферментный анализ бацитрацина // Сельскохозяйственная биология. - 2010. - № 6. - с. 88-93.

3. Taylor A. et al. Extraction and ESI-CID-Ms/Ms analysis of myoglobins fran different meat species // Food Sci. &Techn. Tod. -2000. - v. 69. - № 1. - p. 8186.

4. Helle N. et al. Methods of allocation DNA from chicken. // Arch. Fur Lebensmittelhygiene, 1996. - v. 3. - № 2. - p. 48-51.

5. Черняева М.Н. Анализ видовой принадлежности мяса и мясопродуктов //Ветеринария. - 2001. - № 6. - с. 47-50.

6. Rogers NL, Cole SA, Lan HC, Crossa A, Demerath EW. New saliva DNA collection method compared to buccal cell collection techniques for epidemiological studies.// Am J Hum Biol. - 2007. - 19. - p.319-326.

7. Smith LM, Burgoyne LA. Collecting, archiving and processing DNA from wildlife samples using FTA(R) databasing paper// BMC Ecol. - 2004. - 4. - p.4.

8. Wolf C, Rentsch J, Hubner P. PCR-RFLP analysis of mitochondrial DNA: a reliable method for species identification. // J Agric Food Chem. - 1999. - 47. - p.1350-1355.

9. Nsubuga AM, Robbins MM, Roeder AD, et al. Factors affecting the amount of genomic DNA extracted from ape faeces and the identification of an improved sample storage method// Mol Ecol. - 2004. - 13. - p .2089-2094.

10. Коновалова Е.Н., Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А. Видовая идентификация мяса птицы в животноводческой продукции в применением метода полимеразной цепной реакции //Достижения науки и техники АПК. - 2011. - № 10. - с. 67-69

11. Коновалова Н.А., Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А. Мультиплексная ДнК-идентификация видового происхождения мясной продукции // Сельскохозяйственная биология. - 2011. - № 6. - с. 80-83.

12. Зиновьева Н.А., Попов А.Н., ЭрнстЛ.К., Марзанов Н.С., Бочкарев В.В., Стрекозов Н.И., Брем Г. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве. - Дубровицы, 1998. - 36 с.

EVALUATION OF SENSITIVITY AND SPECIFICITY OF PCR FOR SPECIES IDENTIFICATION OF COWS,

PIGS AND CHICKENS E.N. Konovalova, O.V. Vavilova, E.A. Gladyr, N.A. Zinovieva

Summary. Using developed method of PCR analysis of mtDNA cytochrome B gene (cyt b) the universality of PCR method for identification of animal DNA of three species (bovine, Bos Taurus, pig, Sus scrota domestica, chicken, Gallus gallus) was evaluated. The specificity of developed method in dependence of sample type, method of treatment (mechanical, temperature and chemical) was studied. The application of method for analysis of mixed products (two and more animal species) was shown. The analysis were performed on 72 samples of different origin: beef broth, sausage of three kinds, cooked chicken of two kinds, cow milk of two types, mayonnaise, pork, paste from beef liver, pie, cheese of three kinds, products of cottage cheese of two types, minced meat from single and mixed raw meat of four kinds, chicken eggs, ear samples of cattle and pigs, cattle hair samples, chicken feather. Using PCR amplification the species specific amplification of raw products and products after mechanical, temperature, mechanical and temperature, temperature and chemical treatment was achieved in 100 per cent of cases. The successful amplification of target sequences of conserved biological samples was achieved in 82.4 per cent cases. The developed method can be used by molecular genetics laboratories for species identification of products of animal origin.

Key words: animal species identification, Bos Taurus, Sus Scrofa, Gallus Gallus, PCR, cytochrome B, cyt b, mtDNA

УДК 636.064; 573.7

МОЛОЧНАЯ ПРОДУКТИВНОСТЬ КОРОВ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ИНФИЦИРОВАННОСТИ ВИРУСОМ ЛЕЙКОЗА И ГЕНОТИПА ПО BOLA-DRB3*

Е.А. ГЛАДЫРЬ, кандидат биологических наук, зав. лабораторией

Н.А. ЗИНОВЬЕВА, академик РАСХН, директор А.С. БЫКОВА, кандидат биологических наук, ведущий специалист

И.В. ВИНОГРАДОВА, младший научный сотрудник ВИЖРоссельхозакадемии \Л.К. ЭРНСТ\ академик РАСХН E-mail: [email protected]

Резюме. С использованием разработанной тест-системы диагностики провирусной формы вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) выполнено исследование степени распространения лейкоза среди животных черно-пестрой (n=302) и красной горба-товской пород (n=156) с различными генотипами по BoLA-DRB3.

В группе гомозиготных носителей аллелей BoLA-DRB3, ассоциированных с генетической устойчивостью клейкозу (аллели 11, *23,

*28=*7А) носители вируса, отсутствовали, в то время какв группах гетерозиготных носителей и не носителей степень инфицирован-ности ВЛКРС в среднем составила 23,1 и 20,7 %. У голштинизи-рованных коров черно-пестрой породы (n=267) установлены достоверно более высокие уровни удоя (+588кг, р<0,05), содержания жира (+0,14 % абс., р<0,05), количества молочного жира (+19,3 кг, p<0,01) и количества белка (+9,2 кг, р<0,05). Аналогичные тенденции выявлены укоров красной горбатовской породы (n=133). Перечисленные закономерности сохраняются в группах с различными генотипами по BoLA-DRB3 у животных обеих пород.

Ключевые слова: вирус лейкоза крупного рогатого скота, ДНК-диагностика, BоLA-DRBз, молочная продуктивность

Основные цели селекционной работы в молочном скотоводстве - увеличение удоя и выхода молочного жира и белка. Однако повышенная молочная продуктивность, как правило, сопряжена со снижением устойчивости к

*Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ, государственный контракт № 16.М04.11.0018. В проведении исследований использовано оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.

различным заболеваниям, что негативно сказывается на процессе производства, значительно увеличивая стоимость выходной продукции [Одно из широко распространенных на территории России заболеваний животных - лейкоз крупного рогатого скота [2]. По данным Россельхознадзора в 2010 г. было выявлено около 10 % животных, инфицированных вирусом лейкоза (ВЛКРС), у которых наблюдались неопластические изменения и изменения лейкоформулы [3]. Одной из причин широкого распространения лейкоза в высокопродуктивных стадах может быть снижение резистентности, о чем свидетельствуют более высокие показатели молочной продуктивности у коров, инфицированных ВЛКРС. Так, установлен более высокий уровень удоя у коров голштинской породы канадской селекции, инфицированных ВЛКРС в латентной стадии, по сравнению с серонегативными животными [4], и более высокий гене-

100 80 60 40 20 0

ER/ER ER/- -/- ER/ER ER/- -/- ER/ER ER/- -/1-------1--------"---------1--------"---------1--------'

Черно-пестрая Краснаягорбатовская В среднем

порода порода

Рисунок. Инфицированность коров ВЛКРС в зависимости от присутствия в генотипе «желательных» аллелей BoLA-DRB3 ось Х - генотип коров по BoLA-DRB3 по каждой из пород и в среднем по двум породам; ось Y - распределение коров по инфицированности ВЛКРС (%); ц - ВЛКРС «+» - носители провирусной формы ВЛКРС, Q - ВЛКРС «-» - не носители провирусной формы ВЛКРС (по результатам ПЦР анализа). __ Достижения науки и техники АПК, №8-2012