CC BY
23Токсикологический вестник № 2 (11 з)
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бадтиев Ю.С., Кулемин А.А. Биоиндикация окружающей природной среды. // Экологический вестник России. - 2001. - № 5. - С. 36-38.
2. Данильченко О.П., Бузинова Н.С., Реакция моллюсков Limnaela stognalis на загрязнение. Сооб.1. Выживаемость, размножение, эмбриональное развитие /Биологические науки.- 1982.- N6.- С.61-69.
3. Данильченко О.П. Процессы приспособления и регуляции у моллюсков и эмбрионов рыб при изменении среды // Реакции гидробионтов на загрязнение. 1983., М.: Наука. С. 103-112.
4. Котова Л.И., Рыжков Л.П., Полина А.В. Биологический контроль качества вод. М.: Наука. - 1989. - 144 с.
5. Методы биотестирования качества водной среды. Методические указания./ Под. ред. О.Ф.Филенко.- М.:МГУ - 1989. - 124 с.
6. Полонский А.С. Содержание и разведение аквариумных рыб.- М.: Агропромиздат. 1991.-383с.
7. Строганов Н.С. Методика определения токсичности водной среды.// Методика биологических исследований по водной токсикологии.- М.: Наука. - 1971. - с.14-16.
8. 8. Филенко О.Ф., Михеева И.Н. Основы Водной токсикологии. - М.: Колос, 2007.- 144 с.
Filenko O.F., Oganesova Ye.V. Warm-water shell-fish as a potential object for bio testing a water medium quality
M.V.Lomonosov Moscow State University
Sodium bichromate produced a lethal effect on gastropods Planorbis corneus and Melanoides granifera at concentrations of 1 and 0.1 Cr mg/l correspondingly over a testing duration of up to 30 days. The toxicant Cr at a concentration of 0.1 mg/l inhibits the reproduction of Planorbis corneus. Planorbis corneus is a prospective test-object to test a durable effect of sub-lethal concentrations of potentially hazardous compounds on survival and reproduction whereas Melanoides granifera as a test-objet more sensitive to acute effects of toxic substances may be a promising object for toxicological screening.
Материал поступил в редакцию 19.10.2010
УДК 57.04-0.15
Оценка биобезопасности гуминовых кислот как компонентов наногибридного детоксиканта в стандартных тест-системах
Терехова В.А.,
Кыдралиева К.А.,
Рахлеева А.А., Пукальчик М.А.,
Тимофеев М.А.,
Юрищева А.А.
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова
В статье обсуждается возможность использования гуминовых кислот как компонентов магнитоактивных наногибридных детоксикантов нового поколения, создаваемых в целях эффективной ремедиации химически загрязненных почв. В этой связи проведена экспериментальная оценка биобезопасности по реакциям стандартизованных тест-организмов, установлены пределы концентраций, допустимых для нормального функционирования представителей биоты. Установлены безопасные концентрации, рекомендуемые для создания сорбентов.
Ключевые слова: ремедиация почв, детоксикация, сорбенты, гуминовые вещества, био-теетирвваные
Введение. В настоящее время нет достаточно обоснованных экологических технологий, нацеленных на использование гумусосодержащих продуктов для детоксикации и ремедиации химически загрязненных природных сред. Существующие производства гуминовых продуктов направлены в основном на выпуск гуматов как органических удобрений или как стимуляторов роста растений. Единственная в стране технологическая линия по выпуску гуматов, оптимизированных по показателю детоксицирующей способности, установлена в Институте прикладной биохимии и машиностроения. Эффективность гуминовых препаратов, выпускаемых для целей детоксикации тяжелых металлов и радионуклидов, продемонстрирована в
условиях полевого эксперимента. Однако для широкого использования этих продуктов необходима характеристика не только их ремедиационных свойств, но и определение уровня биобезопасности, установление концентраций, безвредных для существования биоты [1,2,3,4].
В ходе выполнения проекта по созданию ремедиационного средства нового поколения -магнитоактивного наногибридного композита на основе гуминовых препаратов и наночастиц металлов стояла задача оценки экотоксикологической безопасности его предшественников. Цель настоящего исследования заключается в биотестировании гуминовых кислот, используемых в качестве полимерной составляющей магнитоактивного нанокомпозита, для выявления
35
безопасных для живых организмов концентраций».
Материалы и методы исследования. Материалом исследования служил препарат гу-миновых кислот (ГК) с рабочим названием НА^ Препарат использовался в работе как органический предшественник магнитоактивного нанокомпозитного сорбента загрязняющих веществ.
Гуминовые кислоты (НА^) получены из окисленных бурых углей месторождения Кызыл-Кия, Киргизия. Содержание гуминовых веществ (ГВ) в составе окисленных углей достигает 80%. Обработка углей с целью извлечения ГВ проводилась 0.5 М КОН, т.е. наиболее распространенным способом извлечения ГВ из углей. Для выделения ГК в Н+-форме из солевой формы препарата проводили его обессоливание. Для этого навеску препарата растворяли в дистиллированной воде, подкисляли и выпавший осадок обессоливали путем диализа в течение 2-х недель. Полученный препарат характеризовали методами элементного анализа, титриметрии, ИК- и ЯМР 13С спектроскопии и гель-хроматографии .
Элементный состав препарата ГК в пересчете на беззольный препарат и рассчитанные атомные соотношения Н/С и О/С приведены в таблице 1.
Таблица 1
Элементный состав и
сшжа риечеислоаныеззвлБпуюл^еоп^
ате гуминовых кислот
Препарат ГК Содержание элементов, масс. % Атомные соотношения, % Зольность, % Содержание кислотных групп, ммоль/г
C H N S O H/C O/C COOH Ar-OH Ar-CHO
HAKzK 63.93 4.07 1.0 0.33 30.50 0.76 0.36 7.14 5.00 2.40 1.44
Исследовали суспензии образцов HA^k в интервале концентраций 0.001- 1.0 (%). Суспензии HAkzk готовили либо в дистиллированной воде, либо в культивационной среде в соответствии с требованиями стандартных методик биотестирования. Во всех пробах контролировали рН, минерализацию, температуру и содержание кислорода. При необходимости пробы доводили раствором 10 % КОН или 10% HCl до рН 7.0-8.2.
Оценка биобезопасности исследуемых концентраций гуминовых кислот осуществлялась по критерию острой токсичности в лабораторных экспериментах по реакции стандартизованных тест-культур организмов разной таксономической принадлежности. В работе использованы высшие растения - семена горчицы Sinapis alba L., микроводоросли сценедес-мус - Scenedesmus quadricauda (Tup.) Breb., простейшие - инфузории Paramecium caudatum Ehrenberg, клетки млекопитающих - сперматозоиды быка (in vitro) Биотестирование HA^k проводили в соответствии с методиками выполнения измерений, рекомендованными для щелей государственного экологического контроля и зарегистрированными в Федеральном реестре (ФР) и реестре природоохранных нормативных документов федерального уровня (ПНД Ф Т). Токсикологическую оценку проводили в сертифицированной лаборатории экотоксико-логического анализа почв (ЛЭТАП) МГУ имени М.В. Ломоносова (www.letap.ru, аттестат аккредитации № РОСС RU. 0001.513050).
Фитотестирование ГК на высших растениях осуществляли по развитию корней проростков горчицы белой согласно бельгийской методики www.microbiotest.com [5], в модификации [6]. Пластиковые контейнеры с предварительно обработанными ГК семенами горчицы инкубировали в течение 4-х суток в термостате при 250C. Эффект биоактивности образцов оценивали по изменению длины корней проростков семян. Наибольшую недействующую концентрацию (no observed effect concentration - NOEC) оценивали по величине 20% отклонения значений тест-функций в опыте относительно контроля; полуэффективную концентрацию (EC50) - по концентрации ГК, при которой наблюдалось сокращение средней длины корней прор50остков на 50% относительно контроля.
Альготестирование ГК с использованием микроводорослей Scenedesmus quadricauda проводили в течение 72 часов. Оценивали снижение прироста численности популяции клеток водорослей в опыте относительно контроля. Токсичными считали пробы, в которых рост водорослей подавлялся на 20% и более по сравнению с контролем [7]. ГК добавляли в среду
Успенского-1 . Состав среды (г/дм3): KNO3 -0.250, КН2РО4 x 3H20 - 0.025, K2C03 - 0.345, MgS04 x 3H2O 0.025; Ca(N03^ x 4Н2О - 0.144; растворы микроэлементов - 1 см3 из смеси
H3BO3 - 2,86; MnCl2 x 4H2O - 1.81; ZnSO4 x 7H2O - 0.222 г/л; MoO3 - 17.64; NH4VO3 - 22.96 мг/л. Прямой счет клеток водорослей проводили в камере Горяева под микроскопом.
Выживаемость инфузорий оценивали согласно стандартной методике [8]. Подсчет клеток простейших Paramecium caudatum проводили в лунках микроаквариума под бинокуляром через 24 ч инкубации с тестируемыми растворами при температуре 22-24 °С . NOEC оценивали по 10%-ной гибели инфузорий. EC50 - по концентрации образца, приводящей к 50% -ной гибели парамеций за установленной ст50андартной методикой период (24 ч).
Биотест на клетках млекопитающих ставили согласно методике [9]. Индекс токсичности образцов определяли по изменению подвижности сперматозоидов быка in vitro. Метод основан на регистрации изменений двигательной активности сперматозоидов в зависимости от времени воздействия химических агентов. Тест-функцией является подвижность половых клеток m , которая пропорциональна концентрации сперматозоидов c и среднему модулю скорости движения клеток v: m=c v. Подвижность суспензии сперматозоидов m=m(t) регистрировали с помощью цифрового анализатора микроскопических видеоизображений. Индекс токсического действия It, определяли как отношение средневзвешенного времени подвижности сперматозоидов в испытуемой пробе к значению этого параметра в контрольной пробе. Критерием отсутствия токсичности в испытуемой пробе служит величина индекса токсичности 80% < I < 120%. NOEC оценивали по 20% -ному отклонению двигательной активности клеток в опыте. EC50 определяли по снижению двигательной активности на 50% относительно контроля. 50
Результаты и обсуждение. Исследования биологической активности и токсичности гуминовых кислот HAk,k в четырех тест-системах, основанных на реакциях растений и животных, показали зависимость эффекта от действующей концентрации препарата (0.001-1.0%).
Реакция высших растений
Исследования биоактивности HA^ ГК в отношении семян горчицы белой показали, что препарат гуминовых кислот HA^k в исследованном диапазоне концентраций является нетоксичным. В интервале концентраций 0.001 - 0.100 % отмечена стимуляция роста корней проростков семян Sinapis alba (рис. 1a).
Подавление развития корней проростков семян Sinapis alba наблюдалось лишь при концентрации HAkzk 1.0% . Однако и в этом варианте опыта подавление не превышало установленный методикой порог токсичности - 20% (рис. 1б), что свидетельствует об отсутствии неблагоприятного воздействия HA^k в максимальной из исследуемых концентраций.
Реакция микроводорослей
Прямой счет клеток водоросли сценедесмус показал, что интенсивность прироста чис-
36
Токсикологический вестник № 2 (11 з)
ленности популяций водорослевых клеток в значительной степени зависит от концентрации HAKzK. На фоне закономерного возрастания плотности популяций через 72 ч во всех вариантах заметно подавление развития водорослей уже при концентрации 0.001% НАа-а. Отставание от контроля при этом составило 18%. При концентрациях НАа,а 0.010% и 0025°% зафиксирована острая токсичность, поскольку прирост водорослей в опыте был ниже относительно контроля более чем на 20 % (рис. 2).
Реакция культуры клеток млекопитающих in vitro
Результаты исследований препарата гуминовых кислот в тест-системе с половыми клетками быка показали, что при содержании 0.001 и 0.01% НАа,а пробы являются безвредными, индекс токсичности It - 101.1 и 83.0%, соответственно. Гуминовые кислоты НАа,а в концентрации 0.1 и 1.0% оказались токсичными для клеток млекопитающих (табл. 2).
При этом в пробе препарата гуминовых кислот с концентрацией 1.0 % выявлена острая токсичность (^=42.4 %), которая выразилась в заметно более ранней потере подвижности сперматозоидов в опыте по сравнению с контролем. По результатам данного испытания NOEC находится в пределах 0.01-0.1% НАа,а^ EC50 - 0.1-1.0%. Одновременно выявилась необычная реакция клеток сперматозоидов на концентрацию 0.1% НАа,а Токсичность этой пробы стандартным способом (по реакции равномерно распределенных клеток в суспензии) фиксировалась лишь на первых стадиях экспозиции, что выражалось в снижении подвижности относительно контрольной пробы и уменьшении индекса токсичности, рассчитанного по первым циклам эксперимента (^<73.0%). Позднее наблюдалась агрегация сперматозоидов, причем такие клеточные агрегаты вибрировали и, как хорошо было заметно на видеоизображении, продолжали хаотично двигаться, что фиксировалось прибором. В результате индекс токсичности на последних циклах экспозиции повышался, однако, по нашему мнению, такое агрегированное состояние клеток в суспензии должно квалифицироваться как наличие неблагоприятного воздействия, а концентрацию 0.1% НАа,а следует считать токсичной.
Реакция простейших
Оценка биологической активности препарата гуминовых кислот по выживаемости инфузорий Paramecium caudatum показала, что клетки простейших малочувствительны к действию НАа,а. Существенное снижение выживаемости особей наблюдается при 0.1% и 1.0% НАа,а В диапазоне концентраций для НАа,а 0.001-0.1% выживаемость снижается незначительно и не достигает уровня 10% - отклонения от контроля, при котором констатируется токсический эффект (рис. 3).
Таким образом, препарат НАа,а в концентрациях 0.001 и 0.1% является нетоксичным для простейших, NOEC и EC5o находятся в интервале 0.1-1.0%.
Выводы. Обобщая данны е, полученные при исследовании биологической активности препарата НАа,а, следует отметить, что чувствительность разных тест-культур к гуминовым кислотам заметно различалась. Токсичными для культуры половых клеток быка и инфузорий оказались концентрации НАа,а 0.1% и выше, для микроводорослей - 0.01% и выше, а по отношению к высшим растениям токсичность в исследуемых интервалах концентраций не выявлена. При принятии решений на основе экспресс-оценки биобезопасности препаратов в таких случаях руководствуются правилом «слабого звена». На этом основании безопасными для испытанных живых организмов следует считать НАа,а в концентрации < 0.01%.
Таким образом, полученные данные дают возможность оптимизировать состав и структуру сорбентов с позиций безопасности для окружающей среды. При разработке новых средств ремедиации почв и других природных сред на основе продуктов «зеленой химии», к которым относят гуминовые вещества, целесообразно уже на стадии создания композитных сорбирующих агентов обращать внимание на допустимый для биоты уровень содержания предшественников (соблюдать принцип: «не навреди»). Поскольку экотоксикологическая оценка подобных препаратов должна основываться на реакциях организмов, чувствительных к гуминовым веществам, то в «батарее биотестов» в качестве обязательного звена должны быть включены микроводоросли, которые по данным проведенного нами исследования, оказались наиболее чувствительными к действию препарата гуминовых кислот НАа,а .
Работа выполняется при частичной финансовой поддержке проектов Минобрнауки РФ №№ 02.740.11.0693 и 14.740.11.0796.
Авторы благодарят дбн Д.Н. Маторина, кбн О.В. Лисовицкую, А.В. Каратееву за помощь в работе.
37
2 £
ш
X
о. о
SC
03 X
50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 О
а
0,000% 0,001% 0,010% 0,100% 1,000% [hakzk],%
0
(1J S X
01
о ä? с; m ас
I- ос
О ■=; , о >х о.
£ I
ас го х
50 40 30 20 10 О -10 -20 -30 -40
____ »- _
0,0( 1% о,о: 0% 0,1( 0% 0%
б
[НА™],
Рис. 1 Влияние гуминовых кислот HAKzK на длину корней проростков горчицы белой S. alba: а - изменение длины корней, мм; б - отклонение значений длины корней в опыте относительно контроля, %
38
Токсикологический вестник № 2 (i i з)
и 2
ш
5
о
Q. О (I О О
ас О I-0) ч х
л
t о
X X
ш
s
180 160 140 120
•^LOO
и §80
60
40
20
0
-< »-
V
i А g % а
— —-—^4 к-
[hakzk],% •0,000% — 0,001% -à— 0,025 % ■а—0,010%
0ч
24ч
72 ч
Рис. 2. Динамика численности клеток микроводорослей сценедесмус S. qudricauda при разных концентрациях гуминовых кислот HA„ „
Влияние
Таблица 2
гдопшшишм НАчщпдловыжжаь. Kit ) A ш-
системе с
Концентрация [HAKzK], % Индекс токсичности It ср., % Число повторностей Стандартное отклонение,% Доверительный интервал,%
-95% +95%
0.001 101.1 5 2.4 98.1 104.1
0.010 83.0 5 7.9 73.2 92.8
0.100 <73.0* 4
1.000 42.4 5 1.9 40.1 44.8
*Прим. 1( рассчитан по неполному циклу экспозиции пробы (пояснения в тексте)
39
2 ^
о о.
х о
5С 5£
U
О §
О) га m
л m
40 20 О -20 -40 -60 -80 -100
--^
0,0( 1% 0,01 0% и, д (0% 1,000 %
\
\
[hakzk],%
Рис. 3. Выживаемость инфузорий P. caudatum при разных концентрациях гуминовых кислот HA^
список литературы
1. Орлов Д.С. Свойства и функции гуминовых веществ // Гуминовые вещества в биосфере. - М., 1993.- С. 16-27.
2. Перминова И.В. Гуминовые вещества— вызов химикам XXI века // Химия и жизнь. 2008. № 1. С. 50-55.
3. Якименко О.С. Промышленные гуминовые препараты: перспективы и ограничения использования // Материалы 2-й Международной научно-практической конференции «Дождевые черви и плодородие почв». 17-20 марта 2004. Владимир. Россия, C. 249-252.
4. Van Stempvoort, D. R., Lesage, S., Novakowski, K. S., Millar, K., Brown, B. and Lawrence, J. R. Humic acid enhanced remediation of an emplaced diesel source in groundwater. 1. Laboratory-based pilot scale test. J. Contaminant Hydrol. 2002. 54. P.249- 276.
5. Persoone G. Recent new microbiotests for cost-effective toxicity monitoring: the Rapidtoxkit and the Phytotoxkit// 12th International Symposium on Toxicity Assessment - Book of Abstracts, 2005, p.112. (http://www.microbiotest.com)
6. Лисовицкая О.В., Терехова В.А. Фитотестирование: основные подходы, проблемы лабораторного метода и современные решения // Доклады по экологическому почвоведению, 2010, вып. 13, № 1. С. 1-18.
7. ФР.1.39.2007.03223. Методика определения токсичности вод, водных вытяжек из почв, осадков сточных вод и отходов по изменению уровня флуоресценции хлорофилла и численности клеток водорослей.
8. ФР. 1.39.2006.02506. ПНД Ф Т 14.1:2:3.13-06; 16.1:2.3:3.10-06 Методика определения токсичности отходов, почв, осадков сточных, поверхностных и грунтовых вод методом биотестирования с использованием равноресничных инфузорий Paramecium caudatum Ehrenberg.
9. ФР. 1.31.2009.06301. ПНД Ф 14.1:2:4:15-09; 16.1:2:2.3:3.13-09. Методика выполнения измерений индекса токсичности почв, почвогрунтов вод и отходов по изменению подвижности половых клеток млекопитающих in vitro.
Terekhova V.A., Kydraliyeva K.A., Rakhleyeva A.A., Pukalchik M.A., Timofeyev М.А., Yurishcheva A.A.
Assessment of bio safety of humic acids as components of nano hybrid detoxicants in standard bio test-systems
Are discussed possibilities of using humic acids as components of magnetically active nano-hybrid de-toxicants of a new generation which are being developed to effectively remediate chemically contaminated soils. To this purpose an experimental evaluation of bio safety was conducted based on responses of standard test-organisms, allowable concentrations recommended for normal functioning of the biota representatives are set. Safe concentrations recommended for developing sorbents were established.
Материал поступил в редакцию 23.03.2012 г.
40
