Оценка антиоксидантной активности продуктов переработки винограда с применением амперометрического метода и биолюминесцентного теста Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК: 634.853:663.252.6:678.746.47:613.292

оценка антиоксидантной активности продуктов переработки винограда с применением амперометрического метода и биолюминесцентного теста*

А.М. АВИДЗБА1, доктор сельскохозяйственных наук, академик УНААН, директор (e-mail: magarach@ rambler.ru)

A.В. КУБЫШКИН2, доктор медицинских наук, зам. директора (e-mail: [email protected])

Т.И. ГУГУЧКИНА3, доктор сельскохозяйственных наук, зав. научным центром (e-mail: guguchkina@ mail.ru)

B.А. МАРКОСОВ3, доктор технических наук, зав. лабораторией

А.М. КАЦЕВ2, доктор биологических наук, зав. кафедрой (e-mail: [email protected])

Н.В. НАУМОВА2, ассистент (e-mail: naumova-csmu@ mail.ru)

Ю.И. ШРАМКО2, кандидат медицинских наук, доцент (e-mail: [email protected])

Г.П. ЗАЙЦЕВ1, младший научный сотрудник (e-mail: [email protected])

И.В. ЧЕРНОУСОВА1, кандидат технических наук, старший научный сотрудник (e-mail: [email protected])

Ю.А. ОГАЙ1, кандидат технических наук, зав. отделом (e-mail: [email protected])

И.И.ФОМОЧКИНА2, доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник (e-mail: fomochkina_i@ mail.ru)

1Национальный научно-исследовательский институт винограда и вина «Магарач», ул. Кирова, 31, Ялта, 298600, Российская Федерация

2Медицинская академия имени С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского», бульвар Ленина, 5/7, Симферополь, 295006, Российская Федерация

3Северо-Кавказский научно-исследовательский институт садоводства и виноградарства, пр-т 40-лет Победы, 39, Краснодар, 350901, Российская Федерация

Резюме. В работе приведен фенольный состав соков, ви-номатериалов (Мерло, Каберне) и пищевых концентратов (Эноант, Фэнокор) из красных сортов винограда Крыма и Краснодарского края. Флавоноиды представлены антоциа-нами, в значительном количестве присутствуют олигомерные процианидины, а также полимерные процианидины, которые составляют основную часть полифенолов виноматериалов и концентратов из красных сортов винограда. Среди нефлаво-ноидных полифенолов идентифицированы оксибензойные и оксикоричные кислоты, наибольшее относительное содержание которых в сумме полифенолов отмечено в соках, самое низкое - в концентратах. По результатам количественного физико-химического анализа образцов и их антиоксидантной активности получено экспериментальное уравнение для расчетов антиоксидантной активности в единицах Тролокс: У=0,53627+0,1395Х+0,080439Х2-0,00064708Х3, r= 0,9952, где У - антиоксидантная активность, г/дм3 в пересчете на тролокс; X - массовая концентрация фенольных веществ по Фолину-Чокальтеу, г/дм3 (уравнение справедливо при У в интервале от 0,76 до 196,22 г/дм3 в пересчете на тролокс; Х - от 1,0 до 82,67 г/дм3). Биотестирование антиоксидантных свойств ис-

следуемых образцов осуществляли методом люминесценции с использованием бактерий Photobacterium leiognathi Sh1 в присутствии фермента люциферазы. Биолюминесцентную реакцию рассматривали как модельную систему, а ее ингиби-рование как результат антиокислительного действия. В качестве стандартов использовали два модельных антиоксидан-та - галловую кислоту и кверцетин в виде препарата Корвитин. Стандартные антиоксиданты оказали сходное ингибирующее воздействие на бактерии, которое отмечали через 10 мин. воздействия и при 18 часовом тесте. Аналогичный эффект отмечен при использовании тестируемых виноматериалов красных сортов винограда и виноградных концентратов. Корреляция величин антиоксидантной активности, полученных с использованием биотеста на светящихся бактериях (18 ч воздействия) с данными ВЭЖХ, результатами определения по Фолину-Чокальтеуи Тролоксусоставляет0,75-0,81. Ключевые слова: полифенолы винограда, антиоксидантная активность, биотестирование, биолюминесцентные бактерии, вино, концентраты винограда

Для цитирования: Оценка антиоксидантной активности продуктов переработки винограда с применением амперометри-ческого метода и биолюминесцентного теста / А.М. Авидзба, А.В. Кубышкин, Т.И. Гугучкина, В.А. Маркосов, А.М. Кацев, Н.В. Наумова, Ю.И. Шрамко, Г.П. Зайцев, И.В. Черноусова, Ю.А. Огай, И.И. Фомочкина // Достижения науки и техники АПК. 2015. Т.29. №12. С. 113-118.

Полифенолы, содержащиеся в кожице, мякоти и семечке виноградной ягоды, определяют антиоксидант-ную активность продуктов его переработки, которые, поступая в организм человека с пищей, препятствуют процессам перекисного окисления в биомембранах, повышают антиоксидантный статус и снижают риск возникновения заболеваний сердечно-сосудистой и дыхательной систем (атеросклероз, ишемическая болезнь, бронхит, бронхиальная астма, эмфизема, ревматизм), стресса, аллергии, лучевой болезни, отравления, старения организма, сахарного диабета и других нарушений обмена веществ [1, 2]. Условно полифенолы продуктов переработки красных сортов винограда можно отнести к флавоноидным и нефлавоноидным. Среди флавоноидов можно назвать такие соединения, как антоцианы, флавоны, мономерные, олигомерные (процианидины) и полимерные (танины) флаван-3-олы. Нефлавоноидные полифенолы представлены в основном оксикоричными и оксибензойными кислотами [3]. Среди групп полифенолов, присутствующих в продуктах переработки винограда в значительных объемах, можно выделить флаван-3- олы и галловую кислоту, которые относятся к наиболее мощным антиоксидан-там среди полифенолов винограда [4, 5].

Систематизированные данные о качественном и количественном составе полифенолов продукции из таких массовых красных сортов винограда для промышленной переработки, как Каберне-Совиньон, Саперави, Мерло, а также сведения, характеризующие антиоксидантную активность этой продукции, отсутствуют, что затрудняет оценку перспектив ее применения для здорового питания.

*Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки России. Уникальный идентификатор ПНИ RFMEFI60414Х0077при подписании Соглашения № 14.604.21.0077

Цель исследований - экспериментально установить антиоксидантную активность, а также качественный и количественный состав полифенолов в продукции из красных сортов винограда Каберне-Совиньон, Саперави и Мерло.

Условия, материалы и методы. При проведении исследований использовали сок, вино, пищевые концентраты полифенолов из винограда сортов Каберне-Совиньон, Мерло, выращенного в Крыму и на Кубани и полученного от производителей.

Качественный и количественный состав полифенолов определяли методом ВЭЖХ на хроматографической системе Agilent Technologies 1100 с диодно-матричным детектором. Для разделения веществ использовали хроматографическую колонку Zorbax SB-C18 размером 2,1x150 мм, заполненную силикагелем с привитой окта-децилсилильной фазой с размером частиц сорбента 3,5 мкм. Хроматографирование осуществляли в градиентом режиме. Состав элюента: раствор А - метанол, раствор В - 0,6%-ный водный раствор трифторуксусной кислоты. Состав элюента в ходе хроматографирования изменяли по следующей схеме (по содержанию компонента В): 0 мин. -8%; 0-8 мин. - 8-38%; 8-24 мин. - 38-100%; 24-30 мин. -100%; скорость протока элюента 0,25 мл/мин. Объем вводимой пробы - 1 мкл. Хроматограммы регистрировали при следующих длинах волн: 280 нм - для галловой кислоты, M-D-катехина, (-)-эпикатехина и процианидинов, 313 нм - для производных оксикоричных кислот, 371 нм - для кверцетина и 525 нм - для антоцианов. Идентификацию веществ проводили путем сравнения спектральных характеристик времени удерживания образцов с аналогичными величинами у стандартов. Спектральные характеристики отдельных веществ определяли с использованием сведений из литературы [6, 7, 8].

Расчет количественного содержания индивидуальных компонентов осуществляли с использованием калибровочных графиков зависимости площади пика от концентрации вещества, построенных по растворам индивидуальных веществ. Содержание антоцианов определяли в пересчете на хлорид мальвидин-3-О-глюкозида, кафтаровой кислоты - в пересчете на кофейную кислоту, полимерных и олигомерных процианидинов - в пересчете на (+)^-катехин. Все измерения проводили в трех повторностях.

В качестве стандартов использовали галловую кислоту, кофейную кислоту, (+)^-катехин, хлорид мальвидин-3-О-глюкозида, кверцетин дигидрат, изо-кверцитрин (Fluka Chemie AG, Швейцария) и транс-ресвератрол, (-)-эпикатехин, сиреневую кислоту (Sigma-Aldrich, Швейцария).

Результаты исследований обрабатывали стандартными методами математической статистики [9].

Массовую концентрацию фенольных веществ определяли колориметрическим методом, основанным на том, что реактив Фолина-Чокальтеу при добавлении в исследуемый продукт окисляет фенольные группы, восстанавливаясь при этом в соединение голубого цвета, оптическую плотность которого измеряют на фотоколориметре. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации фенольных веществ.

Массовую концентрацию фенольных веществ (С) по галловой кислоте определяли по градуировочной кривой, используя для вычисления формулу (1):

С= К■ ОП, (1)

где С - массовая концентрация фенольных веществ, мг/дм3; К - коэффициент разбавления; ОП - оптическая плотность.

Градуировочную кривую строили согласно п. 9 Р 4.1.1672-03 [10].

Вычисление проводили до первого десятичного знака после запятой. За окончательный результат принимали среднее арифметическое двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышало (для диапазона измерений 3000-20000 мг/дм3) 33 мг/дм3. Предел погрешности измерения массовой концентрации фенольных веществ при доверительной вероятности Р=0,95 для указанного диапазона измерения составлял ± 39 мг/дм3. Определения проводили в трех повторностях.

Оценку антиоксидантной активности образцов продукции (сока, вина, концентратов) осуществляли амперометрическим методом измерения массовой концентрации антиоксидантов по стандартному анти-оксиданту Trolox на приборе «Цвет-Яуза 01 -АА» по ГОСТ Р 54037 [11].

Для биолюминесцентного анализа антиоксидантной активности использовали светящиеся бактерии Pho-tobacterium leiognathi Sh1 из коллекции Медицинской академии Крымского федерального университета [12]. Биотестирование проводили по методикам оценки острого и хронического действий образцов на биолюминесценцию тест-бактерий (рис. 1).

Рис. 1. Методики биотестирования острого (А) и хронического (Б) действий с использованием светящихся бактерий, I - интенсивность биолюминесценции, %, С - концентрация исследуемого образца.

Принцип биолюминесцентных тестов заключается в инкубировании люминесцирующих бактерий в анализируемых средах, содержащих вещество или смеси веществ, способных оказать влияние на физиологическое состояние их клеток. Соответственно, возможными реакциями могут быть отсутствие изменения уровня свечения, его повышение или снижение, в последнем случае обычно интерпретируемое как развитие токсического эффекта. При этом в случае исследования образцов неизвестного состава, регистрируемый отклик неспецифичен, так как отражает реакцию на всю совокупность присутствующих в пробе химических веществ [14, 15, 16].

Мы рассматривали биолюминесцентную реакцию бактерий с участием фермента люциферазы в качестве модельной окислительной системы, а ее ингибирова-ние как результат антиокислительного действия [17, 18]. Учитывая, что бактерии реагируют изменением свечения на самые различные факторы, в том числе биоцидные, то одновременно с антиоксидантной активностью тест показывал и наличие антибактериальных свойств виноматериалов. Это можно считать дополнительным преимуществом такого подхода.

Таблица 1. Фенольный состав и антиоксидантная активность продуктов переработки винограда

Показатель Опытные образцы сока (Институт «Магарач») Вина (ГК НПАО «Массандра») Пищевые концентраты из Каберне-Совиньон (ООО «РЕССФУД»)

Каберне-Совиньон Мерло Каберне Мерло «Эноант» «Фэнокор»

Антоцианы, мг/дм3:

дельфинидин-3-О-глюкозид - 0,12 1,0 0,8 -

цианидин-3-О-глюкозид 0,04 1,26 0,2 0,2 - -

петунидин-3-О-глюкозид - 0,41 1,2 1,3 1,1 -

пеонидин-3-О-глюкозид 0,10 5,33 1,4 2,2 0.6 -

мальвидин-3-О-глюкозид 0,21 15,13 9,5 9,1 11,9 -

дельфинидин-3-О-(6'-ацетил-глюкозид) - - 2,2 5,8 1,0 -

цианидин-3-О-(6'-ацетил-глюкозид) - - 0,4 0,4 - -

петунидин-3-О-(6'-ацетил-глюкозид) - 0,07 0,3 0,3 - -

пеонидин-3-О-(6'-ацетил-глюкозид) - 0,67 0,4 0,8 - -

мальвидин-3-О-(6'-ацетил-глюкозид) 0,07 - 2,7 2,0 1,8 -

петунидин-3-О-(6'-п-кумароил-глюкозид) - - 0,4 0,4 - -

мальвидин -3-О-(6'-п-кумароил-глюкозид) 1,30 3,26 0,6 0,5 2,5 -

Флавоны, мг/дм3:

кверцетин-3-О-глюкозид 0,90 3,66 8,5 15,9 3,1 15,4

Кверцетин - - 2,8 1,6 49,6 10,2

Флаван-3-олы, мг/дм3:

(+)^-Катехин 0,07 2,12 34,7 44,8 177,6 1752.6

(-)-Эпикатехин - - 34,5 47,4 118,4 1374,2

Оксикоричные кислоты, мг/дм3:

кафтаровая кислота 49,76 104,35 45,6 58,0 11,7 -

каутаровая кислота - - 7,5 10,0 1,8 -

Оксибензойные кислоты, мг/дм3:

галловая кислота - 0,23 39,3 42,6 341,1 1119,2

сиреневая кислота 1,68 7.70 7,0 5,3 22,6 -

Проантоцианидины, мг/дм3:

олигомерные - - 187 222 603 4598

полимерные - - 3045 3723 28155 172662

Сумма фенольных веществ ВЭЖХ, г/дм3 0,062 0,163 3,43 4,20 29,50 181,53

Массовая концентрация фенольных веществ

в пересчете на галловую кислоту, г/дм3 0,293 0,455 2,36 2,75 18,51 82,69

Антиоксидантная активность в пересчете на

Trolox, г/дм3 0,079 0,198 4,35 4,56 24,72 196,22

На первом этапе для испытания люминесцентных бактерий в качестве модели для определения антиоксидантной активности изучали воздействие двух модельных антиоксидантов - галловой кислоты (нефлавоноидное фенольное соединение) и кверце-тина (флавоноид) - на интенсивность бактериальной люминесценции. В качестве водорастворимой формы кверцетина использовали фармацевтический препарат Корвитин (ПАО НПЦ «Борщаговский ХФЗ, Украина), представляющий собой комплекс кверцетина с по-ливинилпирролидоном. Далее было изучено действие образцов виноматериалов и виноградных концентратов на биолюминесценцию фотобактерий.

Для определения острого действия образцов в кюветах люминометра смешивали 0,8-0,9 мл тестируемого виноматериала в 3%-ном NaCl, 100 мкл фосфатного буферного раствора с рН=7,0 и 50-200 мкл бактериальной суспензии, до конечной концентрации 5-105 кл/мл. Изменение интенсивности биолюминесценции регистрировали в течение 30 мин. с использованием биолюминометра БЛМ 8801(Россия) с самописцем. Интенсивность действия выражали в виде значений биолюминесценции при определенной концентрации образцов (мг/мл, для растворов индивидуальных веществ) или их разведения (V/V, для растворов неизвестного состава).

Хроническое действие определяли как влияние тестируемого объекта на рост и биолюминесценцию P. leiognathi Sh1. Для этого, после измерения острого воздействия, в пробы дополнительно вносили 2050 мкл стерильной питательной среды для светящихся бактерий (Himedia, Индия, с добавлением NaCl до ко-

нечной концентрации 3%) и помещали их в термостат при температуре 30 °С. После инкубации в течение 18 ч измеряли интенсивность биолюминесценции, как изложено ранее.

результаты и обсуждение. Литературные сведения о флавоноидной и нефлавоноидной природе полифенолов красных сортов винограда нашли подтверждение и в наших опытах (табл. 1, 2).

Флавоноиды в изученных образцах были представлены антоцианами в форме гликозидов дельфиниди-на, мальвидина, цианидина, петунидина, пеонидина, кверцетина и его гликозида, (+) D-катехина, (-)-эпи-катехина. В значительном количестве присутствовали олигомерные процианидины, представляющие собой конденсированные катехиновые единицы (2-6), растворимые в воде, а также полимерные процианидины с количеством катехиновых единиц более 7, нерастворимые в воде. Полимерные процианидины составляют основную часть полифенолов вина и концентратов из красных сортов винограда, находятся в продукции в лабильном состоянии; в соке наблюдается полное отсутствие олигомерных и полимерных процианидинов, как известно, обладающих многообразной биологической активностью [13]. Среди нефлавоноидных полифенолов идентифицированы оксибензойные (галловая, сиреневая) и оксикоричные (кафтаровая, каутаровая) кислоты, относительное содержание которых в сумме полифенолов максимально в соке и минимально в концентратах.

Сумма фенольных веществ в образцах продукции, установленная по результатам ВЭЖХ и с использованием реактива Фолина-Чокальтеу в пересчете на гал-

Таблица 2. Фенольный состав и антиоксидантная активность столовых сухих красных вин, производства винодельческих предприятий краснодарского края

Показатель ООО «Фанагория ООО «Кубань вино» ООО «Кубанские вина» ООО «Аврора»

Мерло 1 Каберне Мерло I Каберне 1 Мерло Мерло 1 Каберне

Антоцианы, мг/дм3:

дельфинидин-3-О-глюкозид 20,4 16,0 10,8 5,2 2,1 5,7 11,1

цианидин-3-О-глюкозид 2,0 0,7 1,6 0,3 0,3 0,7 1,7

петунидин-3-О-глюкозид 23,0 17,4 11,4 6,9 2,2 6,3 12,1

пеонидин-3-О-глюкозид 19,0 9,6 13,4 4,7 2,0 3,6 9,1

мальвидин-3-О-глюкозид 137,2 151,8 95,9 92,1 9,3 26,3 60,3

дельфинидин-3-О-(6'-ацетил-глюкозид) 5,9 7,0 3,0 3,5 1,0 2,1 2,8

цианидин-3-О-(6'-ацетил-глюкозид) 1,3 0,8 0,7 0,3 0,5 0,6 0,9

петунидин-3-О-(6'-ацетил-глюкозид) 3,7 4,0 0,4 0,2 0,5 1,2 1,8

пеонидин-3-О-(6'-ацетил-глюкозид) 1,9 0,9 0,8 0,5 0,4 0,5 1,1

мальвидин-3-О-(6'-ацетил-глюкозид) 37,5 55,4 4,8 5,6 2,1 6,8 13,9

петунидин-3-О-(6'-п-кумароил-глюкозид) 2,6 1,9 0,9 0,5 0,3 0,4 1,1

мальвидин -3-О-(6'-п-кумароил-глюкозид) 14,1 12,3 8,9 5,8 0,5 2,1 8,1

дельфинидин-3,5-О-диглюкозид 1,0 1,4 0,7 - - 0,3 1,0

цианидин-3,5-О-диглюкозид 0,8 1,1 0,6 0,9 - - 1,0

петунидин-3,5-О-диглюкозид 1,5 0,9 0,8 0,6 - 0,6 2,0

мальвидин-3,5-О-диглюкозид 14,8 11,1 12,8 6,2 2,0 9,4 17,7

пеонидин-3,5-О-диглюкозид - - - - - - 8,6

Флавоны, мг/дм3:

кверцетин-3-О-глюкозид 15,2 8,9 36,9 15,7 5,6 4,6 4,2

кверцетин 1,1 0,9 4,1 0,3 1,1 0,4 2,4

Флаван-3-олы, мг/дм3:

(+)^-Катехин 63,6 58,1 83,5 60,8 33,3 45,2 82,0

(-)-Эпикатехин 58,2 49,9 78,8 52,9 40,9 45,1 51,0

Оксикоричные кислоты, мг/дм3:

кафтаровая кислота 59,8 49,2 52,7 29,9 53,5 34,4 73,1

каутаровая кислота 5,7 6,8 5,4 3,5 2,8 2,5 8,0

Оксибензойные кислоты, мг/дм3:

галловая кислота 41,8 45,0 67,8 78,1 65,3 71,5 61,2

сиреневая кислота 1,9 4,5 4,0 8,4 4,7 4,7 3,6

Проантоцианидины, мг/дм3:

олигомерные 215 188 222 221 143 164 251

полимерные 1650 1749 2072 2068 2007 1805 2126

Сумма фенольных веществВЭЖХ, г/дм3 2,40 2,45 2,79 2,67 2,38 2,24 2,82

Массовая концентрация фенольных веществ

в пересчете на галловую кислоту, г/дм3 2,23 2,25 2,49 2,37 2,28 2,50 3,05

Антиоксидантная активность в пересчете

на Trolox, г/дм3 3,75 3,84 3,85 3,89 3,81 3,86 4,14

ловую кислоту различается, что, по-видимому, связано с большей чувствительностью метода ВЭЖХ.

Антиоксидантная активность в единицах Тго1ох возрастает по мере повышения концентрации полифенолов в продукции. При этом взаимосвязь между этими величинами (рис. 2) аппроксимируется уравнением (2) с коэффициентом корреляции г=0,9952:

У=0,53627+0,1395X+0,080439X2-0,00064708X3 (2)

где У - антиоксидантная активность, г/дм3 в пересчете на Trolox, X - массовая концентрация фенольных веществ по Фолину-Чокальтеу, г/дм3

Зависимость справедлива в пределах варьирования 1,0-82,67 г/дм3 по фенольным веществам и 0,76196,22 г/дм3 антиоксидантной активности. Уравнение (2), обобщающее величины антиоксидантной активности в широком диапазоне изменения концентрации полифенолов для сока, вина и концентратов из красных сортов винограда Каберне-Совиньон, по-зволяеткосвенно оценить биологическую активность продукцис при наличии банка данных, полученных для нее in vivo.

рис. 2. Зависимость антиоксидантной активности от массовой концентрации фенольных веществ продуктов переработки красных сортов винограда.

рис. 3. Действие галловой кислоты и корвитина на биолюминесценцию P. leiognathi Sh1: а) - 10 минутный тест; б) -18 часовой тест: —- галловая кислота; -■— корвитин.

рис. 4. Действие исследуемых образцов виноматериалов на биолюминесценцию P. leiognathi Sh1: а) - 10 минутный тест; б) - 30 минутный тест; - Мерло; -*- - Каберне;

— Эноант; — Фэнокор.

На первом этапе исследования антиоксидантной активности образцов на биологической модели - люминесцентных бактериях - и галловая кислота, и кверцетин (в виде препарата Корвитин) оказывали сходное ингибирующие воздействие, которое отмечали через 10 мин. (рис. 3, а). При 18 часовом тесте (рис. 3, б) оно усиливалось. В последнем случае наблюдалось также и увеличение хронического эф-

тестах ингибирование биолюминесценции Эноан-том и Фэнокором было практически одинаковым, то при в 18 часовом действие усиливалось в ряду Эноант -Фэнокор, что совпадает с увеличением содержания в них полифенольных антиоксидантов, а также с повышением общей антиоксидантной активности.

Между результатами биотестирования на светящихся бактериях и величинами антиоксидантной активности, полученными другими методами (содержание фенолов по ВЭЖХ, Фолину-Чокальтеу и общая АОА по Тго1ох), наблюдается достаточно строгая обратная корреляция (табл. 3). Повышенное содержание антиоксидантов в образцах приводило к более сильному ингибированию биолюминесценции и уменьшению показателей интенсивности свечения тест-бактерий. Самые высокие коэффициенты корреляций (0,75-0,81) отмечены со значениями биолюминесценции при 18-часовом тесте на хроническое действие и разведении образца в 1000 раз (0,001).

выводы. Таким образом, установлен фенольный состав соков, виноматериалов и пищевых концентратов из красных сортов винограда Крыма и Краснодарского края. Флавоноиды представлены анто-цианами, в значительном количестве присутствуют олигомерные процианидины, а также полимерные процианидины, которые составляют основную часть

фекта Корвитина, по сравнению с галловой кислотой.

Таблица 3. корреляция показателей антиоксидантной активности образцов и результатов биотести рования на светящихся бактериях

Биолюминесценция, отн. ед.

Образец 10 мин., разведе- 30 мин., разведе- 18 ч., разведение

ние 0,01 ние 0,01 0,001

Каберне 77,52 79,83 50,25

Мерло 93,02 90,34 62,81

Эноант 48,45 37,82 25,13

Фэнокор 38,76 29,41 0

Корреляция с содержанием фенольных веществ

(ВЭЖХ), г/дм3 -0,672 -0,651 -0,781

Корреляция с содержанием фенольных веществ по

Фолину-Чокальтеу, г/дм3 -0,709 -0,690 -0,809

Корреляция с антиоксидантной активностью по Trolox,

г/дм3 -0,635 -0,611 -0,750

Результаты оценки острого действия (10 и 30 мин.) исследуемых образцов на биолюминесценцию показали более сильное влияние концентратов (Эноант, Фэнокор), по сравнению с образцами вин (рис. 4).

При использовании 18 часового биотеста наблюдалось изменение активности полифенольных концентратов(рис. 5). Если при 10 и 30 минутных

рис. 5. Хроническое действие исследуемых образцов виноматериалов на биолюминесценцию P. leiognathi Sh1, 18 часовой тест: -»- - Мерло; -*— Каберне; — Эноант; - Фэнокор.

полифенолов виноматериалов и концентратов из красных сортов винограда. Среди нефлавоноидных полифенолов идентифицированы оксибензойные и оксикоричные кислоты, наибольшим относительным содержанием которых в сумме полифенолов отличаются соки, наименьшим - концентраты. По результатам показателей количественного физико-химического анализа и антиоксидантной активности образцов получено экспериментальное уравнение для расчета последней в единицах Тго1ох. Величина антиоксидантной активности возрастает по мере повышения концентрации полифенолов в образцах. Зависимость справедлива в пределах варьирования 1,0-82,67 г/дм3 по фенольным веществам и 0,76196,22 г/дм3 антиоксидантной активности. Установлена применимость биотеста на люминесцентных тест-бактериях Photobacterium leiognathi Sh1 для оценки антиоксидантной активности виноматериалов и виноградных концентратов.

Корреляция величин антиоксидантной активности, полученных с использованием биотеста на светящихся бактериях (18 ч воздействие), с данными ВЭЖХ, результатами определения по Фолину-Чокальтеу и Тго1ох составляет 0,75-0,81.

Литература.

1. Природные антиоксиданты. Содержание в пищевых продуктах и их влияние на здоровье и старение человека / Я.И. Яшин, В.Ю. Рыжнев, А.Я. Яшин, Н.И. Черноусова. М.: трансЛит. 2009. 192 с.

2. Биологические активные вещества винограда и здоровье: монография / Под общ. ред. Загайко А.Л. Х.: Изд-во «Форт», 2012. 404 с.

3. Полифенольные биологически активные компоненты пищевого концентрата «Эноант»/Ю.А. Огай, Л.М. Алексеева, О.М. Сиказан, Л.И. Катрич //Материалы конференции «Биологически активные природные соединения винограда - III: Гигиенические и медицинские эффекты применения продуктов с высоким содержанием полифенолов винограда» г. URL: http://enoant.info/_pdf/_sb2/3_enoant_info_Ogay.pdf./(2014 г.)

4. Bombardelli E.,Morazzoni P. Vitis vinifera L.//Fitoterapia. 1995. LXVI. № 4. Рр. 291-317.

5. Composesphenoliques durasin, duvinetsante/P.L. Teissedre, R.L. Walzem, A.L. Waterhouse, J.B. Cterman, E.N. Frankel, S.E. Ebeler, A.J. Cliffoer//Revuedes Oenologues.1996. 79. Pp. 7-14.

6. Free radicals and grape seed proanthocyanidn extract: importance in human health and disease prevention / D. Bagchi, M. Bagchi, S.J. Stohs, D.K. Das, S.D. Ray, C.A. Kuszynski, S.S. Joshi, H.G. Pruess//Toxicology. 2000. Vol. 148.Pp. 187-197.

7. Molecular mechanisms of cardioprotection by a novel grape seed proanthocyanidin extract / D. Bagchi, C.K. Sen, S.D. Ray, K. Dipak, M. Bagchi, H.G. Preuss, J.A. Vinson//Mutation Research.2003. Vol. 523. Pp. 87-97.

8. Woodring P. J., EdwardsP.A., Chisholm M.G. HPLC determination of nonflavonoid phenols in vidal blanc wine using electrochemical detection// J. Agric. Food Chem. 1990. Vol.38. Pp. 729-732.

9. Лакин Г.Ф. Биометрия: учеб. пособие для биол. спец. вузов- 4 -е изд., перераб. идоп. М.: Высш. шк., 1990. 352 с.

10. Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище. Руководство Р 4.1.1672.

11. ГОСТР 54037-2010 Продукты пищевые. Определение содержания водорастворимых антиоксидантов ампероме-трическим методом в овощах, фруктах, продуктах их переработки, алкогольных и безалкогольных напитках.

12. Кацев А.М. Новые термофильные люминесцентные бактерии, выделенные из Азовского моря // Таврический медико-биологический вестник. 2014. Т. 17. №2. С. 59-64.

13. В.Г. Спрыгин, Н.Ф. Кушнерова. Природные олигомерные процианидины- перспективные регуляторы метаболических нарушений // Вестник ДВО РАН. 2006. №2. С. 81-90.

14. Дерябин Д.Г. Бактериальная биолюминесценция: фундаментальные и прикладные аспекты. М.: Наука, 2009. 248 с.

15. Synthesis of New 6-{[M-(Dialkylamino(heterocyclyl)alkyl]thio}-3-R-2H-[1,2,4]triazino[2,3-c]quinazoline-2-ones and Evaluation of their Anticancer and Antimicrobial Activities / G.G. Berest, O.Y. Voskoboynik, S.I. Kovalenko, I.S. Nosulenko, L.M. Antypenko, O.M. Antypenko, V.M. Shvets, A.M. Katsev//Sci Pharm. 2012. V.80(1). Pр. 37-65.

16. Synthesis, cytotoxicity by bioluminescence inhibition, antibacterial and antifungal activity of ([1,2,4]triazolo[1,5-c] quinazolin-2-ylthio)carboxylic acid amides / L.N. Antipenko, A.V. Karpenko, S.I. Kovalenko, A.M. Katsev, E.Z. Komarovska-Porokhnyavets, V.P. Novikov//Archivder Pharmazie Arch Pharm (Weinheim). 2009. V. 342(11). P. 651-660.

17. Kudryasheva N., Vetrova E., KuznetsovA. et al. Bioluminescence assays: effects of quinones and phenols // Ecotoxicol. and Environ. Safety. 2002. Vol. 53. № 3. P. 198-203.

18. Исмаилов А. Д. Биолюминесценция как излучательная форма защиты от окислительного стресса у морских фотобактерий //Материалы VII Съезда Российского фотобиологического общества. Пущино, 2014. С. 104.

evaluation of antioxidant activity of products of grape processing

BY AMPEROMETRIC METHOD AND BIOLuMINESCENT TEST

A.M. Avidzba1, A.V. Kubyshkin2, T.I. Guguchkina3, V.A. Markosov3, A.M. Katsev2, N.V. Naumova2, Yu.I. Shramko2, G.P. Zaitsev2, I.V. Chernousova1, Yu.A. Ogai1, I.I. Fomochkina2

'«Magarach» National Research Institute for grape and wine, ul. Kirova, 31, Yalta, 298600, Russian Federation 2Medical Academy of V.I.Vernadsky Crimean Federal University, bulevar Lenin, 5/7, 295006, Simferopol, Russian Federation 3North Caucasian Regional Research Institute of Horticulture and Viticulture, prosp. 40-let Pobedy, 350901, Krasnodar, Russian Federation

Summary. Phenolic composition of juice, wine stocks (Merlo, Cabernet) and food concentrates (Enoant, Fenokor) from red grapes from Crimea and Krasnodar region is presented in the work. Flavonoids are presented by anthocyanins, oligomeric procyanidins and polymeric ones are in significant amount, which consist the main part of polyphenols of wine stocks and concentrates from red grapes. Among nonflavonoid polyphenols it was identified hydroxybenzoic and hydroxyl-cinnamic acids; the largest content of which in the total polyphenols were registered in juices, the smallest one-in concentrates. An experimental equation in obedience to results of quantitative physical and chemical analysis of samples and their antioxidant activity by Trolox method was obtained: Y = 0.53627 + 0.1395X + 0.080439X2 - 0.00064708X3, r = 0.9952; Y is antioxidant activity, g/dm3 by Trolox method; X is mass concentration of phenolic substances according to the Folin-Ciocalteu method, g/dm3. The equation is valid for Y from 0.76 to 196.22 g/dm3 by Trolox method; X from 1.0 to 82.67 g/dm3. The biological test of antioxidant action of the studied samples of wine stocks (Merlo, Cabernet) and food concentrates (Enoant, Fenokor) was carried out by luminescent method using bacteria Photobacterium leiognathi Sh1 and enzyme luciferase. Bioluminescent reaction was examined as a model system, and its suppression-as a result of the antioxidant action. Two model antioxidants: gallic acid and quercetine (Corvitin) were used as the standards. Standard antioxidants had identical suppression influence on bacteria, which was registered in 10 minutes of exposition and in 18-hour test. The similar effect was caused by tested wine stocks of red grapes and grape concentrates. The correlation of antioxidant activity values, obtained by the biotest with bioluminescent bacteria (18 h), with results of high performance liquid chromatography (HPLC) and results, obtained by the methods of Folin-Ciocalteu and Trolox, is 0.75-0.81.

Keywords: grape polyphenols, antioxidant activity, biological test, bioluminescent bacteria, wine, grape concentrates. Author Details: A.M. Avidzba, D.Sc. (Agr.), director (e-mail: [email protected]); A.V. Kubyshkin, D.Sc. (Med.), deputy director (e-mail: [email protected]); T.I. Guguchkina, D.Sc. (Agr.), head of research center (e-mail: guguchkina@mail. ru); V.A. Markosov, D.Sc. (Tech.), head of laboratory; A.M. Katsev, D.Sc. (Biol.), head of department (e-mail: [email protected]), N.V. Naumova, assist. (e-mail: [email protected]); Yu.I. Shramko, Cand. Sc. (Med.), assoc. prof. (e-mail: julianashramko@ rambler.ru); G.P. Zaitsev, junior research fellow (e-mail: [email protected]); I.V. Chernousova, Cand. Sc. (Tech.), senior research fellow (e-mail: [email protected]); Yu.A. Ogai, Cand. Sc. (Tech.), head of division (e-mail: [email protected]); I.I. Fomochkina, D.Sc. (Med.), leading research fellow (e-mail: [email protected])

For citation: Avidzba A.M., Kubyshkin A.V., Guguchkina T.I., Markosov V.A., Katsev A.M., Naumova N.V., Shramko Yu.I., Zaitsev G.P., Chernousova I.V., Ogai Yu.A., Fomochkina I.I. Evaluation of Antioxidant Activity of Products of Grape Processing by Amperometric Method and Bioluminescent Test. Dostizheniya nauki i tekhniki APK. 2015. V.29. No 12. Pp. 113-118 (In Russ.).