Отечественная питательная среда – коринебакагар для выделения возбудителя дифтерии Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

УДК 576.852.23

ОТЕЧЕСТВЕННАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА - КОРИНЕБАКАГАР ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ДИФТЕРИИ

© Шепелин А.П.

ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора, Оболенск

E-mail: [email protected]

Разработана питательная среда коринебакагар для культивирования Corynebacterium diphtheriae с улучшенными ростовыми свойствами. Коринебакагар содержит гидролизат панкреатический рыбной муки - 20,0; стимулятор роста гемофильных микроорганизмов - 10,0; натрий хлористый - 5,0; глюкоза - 0,5; агар микробиологический - 11,0; тел-лурит калия - 2% раствор - 12,5 мл. Предлагаемая питательная среда обеспечивает оптимальные условия для культивирования дифтерийных бактерий, позволяющие повысить высеваемость коринебактерий более чем в 2 раза, скорость роста - в 1,8 раз. Коринебакагар рекомендуется к использованию в практике здравоохранения при проведении бактериологического анализа.

Ключевые слова: Corynebacterium diphtheria, питательная среда, коринебакагар, ростовые свойства.

DOMESTIC NUTRIENT MEDIUM - CORYNEBACAGAR FOR ISOLATING THE CAUSATIVE

AGENT OF DIPHTHERIA Shepelin A.P.

SSC of Applied Microbiology & Biotechnology, Obolensk

A nutrient medium named corynebacagar has been developed for cultivation of Corynebacterium diphtheria with the improved growth properties. Corynebacagar contains pancreatic hydrolysate of fish meal - 20.0; hemophilic microorganisms growth stimulator - 10.0; sodium chloride - 5.0; glucose - 0.5; microbiological agar - 11.0; potassium tellurite (2% solution) -

12.5 ml. The proposed medium provides the optimum conditions for cultivation of diphtheria bacteria allowing doubling the isolation rate of corynebacteria, and increasing the speed of growth - more than 1.8 times. Corynebacagar is recommended for using in public health practice when conducting a bacteriological analysis.

Keywords: Corynebacterium diphtheria, medium, corynebacagar, growth properties.

Возбудитель дифтерии постоянно циркулирует среди населения благодаря существованию бактерионосительства токсигенных штаммов дифтерийных бактерий, что создает угрозу возникновения новых вспышек дифтерии [1, 5].

Для выделения коринебактерий из инфицированного материала в соответствии с приказом Минздрава СССР № 450 «О мерах по предупреждению заболеваемости дифтерией»в практике здравоохранения широко используются среды лабораторного приготовления - кровяной теллу-ритовый агар и среда Клауберга II. В состав этих сред входит сухой питательный агар, а в качестве стимулятора роста — кровь крупного рогатого скота [2]. Однако при культивировании дифтерийных бактерий на указанных питательных средах единичные колонии возбудителя появляются только через 24 часа, а достаточное их количество, необходимое для дальнейшего проведения бактериологического исследования, вырастает через 48 и более часов [2, 4].

В отделе питательных сред ФБУН ГНЦПМБ для культивирования возбудителя туляремии и легионеллёза разработаны сухие питательные среды, содержащие в качестве заменителя крови -стимулятор роста гемофильных микроорганизмов (ТУ 64-15-119-909), полученный путём фермента-

тивного гидролиза суспензии чёрного альбумина с последующей сушкой методом распыления. В этой связи представляет интерес определить возможность использования стимулятора роста гемофильных микроорганизмов взамен крови в составе сред для культивирования коринебактерий.

Целью исследования явилась разработка питательной среды - коринебакагар для выделения возбудителя дифтерии с улучшенными ростовыми свойствами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве стимуляторов роста микроорганизмов в состав питательной среды введены гидролизат панкреатический рыбной муки и стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, в качестве источника энергии - глюкоза. Все компоненты разводили в дистиллированной воде. Для получения среды необходимой плотности использовали агар микробиологический. В качестве ингибитора роста сопутствующей микрофлоры применяли раствор теллурита калия.

Питательную среду для выделения дифтерийных бактерий [6] готовили следующим образом: смешивали панкреатический гидролизат рыбной

муки, стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, натрий хлористый, глюкозу, агар микробиологический в смесителе барабанного типа. Полученный сухой препарат расфасовывали в ламинированные пакеты или стеклянные банки с ввинчивающейся крышкой. Для приготовления плотной питательной среды содержимое пакета или банки (42 г) растворяли в 1 л дистиллированной воды, тщательно размешивали, доводили до кипения и кипятили 1-2 мин при перемешивании, стерилизовали при 1 атм. (+121°С) в течение 20 мин. После охлаждения до 45-60°С добавляли

12.5 мл 2% раствора теллурита калия и разливали по чашкам Петри.

Разработанная питательная среда имела следующий состав(в г/л): гидролизат панкреатический рыбной муки - 20,0; стимулятор роста гемофильных микроорганизмов - 10,0; натрий хлористый - 5,0; глюкоза - 0,5; агар микробиологический - 11,0; теллурит калия - 2% раствор -

12.5 мл.

Для проверки стерильности чашки с питательной средой выдерживали 24-48 часов в термостате.

Контроль качества питательной среды осуществляли с помощью тест-штаммов: С.

diphtheriaegravis 3649, С. diphtheriaemitis 143, C. xerosis 1911, Stapylococcus аигеш Biomico 209p, полученных из ГКПМ ФГБУ ГИСК им. Л.А. Та-расевича Минздравсоцразвития.

В соответствии с методическими указаниями [3] определяли ростовые свойства разработанной питательной среды для выделения дифтерийных бактерий через 48 часов культивирования.

В качестве контрольной среды использовали кровяно-теллуритовый агар [2].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Установлено, что разработанная питательная среда - коринебакагар полностью обеспечивала питательные потребности С. diphtheriae. Добавленный в среду 2% раствор теллурита калия (12,5 мл/л) полностью ингибировал рост S.au^us Biomico 209р при разведении 10-10.

Предлагаемая питательная среда прозрачна в отличие от кровяно-теллуритового агара, что значительно облегчает обнаружение колоний дифтерийных бактерий на поверхности агара.

Анализ результатов сравнительного изучения основных ростовых свойств разработанной и контрольной питательных сред (табл. 1), полученных при проведении лабораторных испытаний, свидетельствовал о том, что разработанная питательная среда обладала высокой чувствительностью - 107 в отношении всех испытуемых штаммов, в то время как показатель чувствительности контрольной среды составил - 10-6. Повышенная скорость роста дифтерийных бактерий на предлагаемой среде проявлялась при меньшем времени культивирования. На разработанной питательной среде визуально обнаруживали колонии дифтерийных бактерий через 19-20 часов культивирования, тогда как на контрольной среде - только через 24-48 часов. Количество колоний, выросших на предлагаемой среде, больше, чем на кро-вяно-теллуритовом агаре. При культивировании взвеси дифтерийных бактерий из разведения 10-6 на разработанной питательной среде количество колоний составило от 93±6 до 123±10, на контрольной среде - от 31±4 до 86± 10. При этом выросшие колонии обладали типичной морфологией: округлые, с приподнятым центром, серо-чёр-

Таблица 1

Ростовые свойства питательных сред для культивирования C. diphtheriae

Ростовые свойства среды Тест-штаммы Разработанная среда(коринебакагар) Контрольная среда (кровяно-теллуритовый агар)

1. Размер колоний (мм) C.diphtheriae gravis 3689 і,5-2^ і,5

С. diphtheriae mitis 143 і,5-2^ !,5-2,Q

C. diphtheriae xerosis 1911 2,Q !,Q-і,5

2. Количество колоний C. diphtheriae gravis 3689 94±6 63±7

(посев из разведения C. diphtheriae mitis 143 93±6 31±4

10"6) C. diphtheriae xerosis 1911 123±10 86± 10

3. Чувствительность C. diphtheriae gravis 3689 10"7 10"7

C. diphtheriae mitis 143 10"7 10"7

C. diphtheriae xerosis 1911 10"7 10"7

4. Скорость роста микро- C. diphtheriae gravis 3689 і9^ 24-4S

бов (час) C. diphtheriae mitis 143 і9^ 24-4S

C. diphtheriae xerosis 1911 !9-2Q 24-4S

!Q9

ного цвета, с радиальной исчерченностью (С. Diphtheriae gravis) или гладкие (С. diphtheriae mi-tis). Диаметр образующихся на коринебакагаре колоний через 48 часов культивирования на 0,51,0 мм больше, чем на кровяно-теллуритовом агаре.

Использование оптимального соотношения двух компонентов - стимулятора роста гемофиль-ных микроорганизмов и гидролизата панкреатического рыбной муки способствовали повышению показателей ростовых свойств предлагаемой питательной среды - коринебакагара за счёт сокращения логарифмической фазы роста дифтерийных бактерий в процессе культивирования.

На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы:

1. Разработана отечественная питательная среда - коринебакагар для выделения C. diphtheriae.

2. Предлагаемая питательная среда - кори-небакагар позволяет обеспечить оптимальные условия для культивирования C. diphtheriae.

3. Разработанная питательная среда - кори-небакагар для выделения возбудителя дифтерии обладает улучшенными по сравнению с кровяно-теллуритовым агаром ростовыми свойствами и

рекомендуется к использованию в практике здравоохранения при проведении бактериологического анализа.

ЛИТЕРАТУРА

1. Яцковский К.А и др. Дифтерия в России в 20052009 годах // Эпидемиология и вакцинопрофилак-тика. - 2010. - № 3. - С. 31-36.

2. Методические указания 4.2.698-98. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции. М. : МЗ РФ, 1998. - 47 с.

3. Методические указания 4.2.2316-08. Методы контроля бактериологических питательных сред. -М. : Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008. - 66 с.

4. Миронов А.Ю., Харсеева Г.Г., Клюкина Т.В. Основы клинической микробиологии и иммунологии // Учебное пособие. - Ростов н/Д, 2011. - 248 с.

5. Харсеева Г.Г., Москаленко Е.П., Трухачев А.Л., Митрофанова Т.В. Патогенные свойства С. diphtheriae, циркулирующих в г. Ростове-на-Дону и Ростовской области в межэпидемический период // ЖМЭИ. - 2006. - № 6. - С. 6-9.

6. Питательная среда для выделения дифтерийного

микроба: пат. 2041947 Рос. Федерация.

№ 5030693 / 13; заявл. 04.03.92; опубл. 20.08.95.