CC BY
133
ЖВАЧНЫЕ
бует больших затрат времени, труда и средств, а тестируемые штаммы приона должны быть адаптированы к соответствующей линии мышей. В противном случае можно получить лож-ноотрицательные результаты или столкнуться с удлинением инкубационного периода, что можно устранить применением трансгенных мышей, экспрессирующих PrPС с аминокислотной последовательностью, соответствующей структуре при-она, который присутствует в анализируемой пробе [3, 6, 7].
Второй способ активной диагностики основан на выявлении инфекционной формы прионного белка с помощью культур клеток [12]. Данный метод не только значительно дешевле биопробы на мышах, но и позволяет получить результат в десятки раз быстрее. Обычно с этой целью используют линию клеток нейробластомы мышей Ша, проявляющую высокую чувствительность к PrPBSE. Перед заражением культуру клеток необходимо проверять на отсутствие посторонних прионов.
Третий способ активной диагностики прионных болезней — циклическая амплификация PrPBSE, содержащегося в анализируемой пробе [17]. Небольшое количество инфекционного материала вносят в гомогенат мозга, полученного от неинфицированного животного, и трансформируют in vitro PrPC, а его — в PrPBSE. Образующиеся агрегаты PrPBSE разделяют на отдельные молекулы ультразвуком. Освобожденные молекулы служат затравкой для следующей стадии реакции [13, 14]. Вначале этот тест проводили, добавляя к исследуемой пробе гомогенаты ГМ неинфицированных животных с низким содержанием PrPC [18], а затем с целью повышения чувствительности и специфичности их стали заменять очищенными препаратами PrPC [8]. Метод принципиально похож на ПЦР. PrPBSE выполняет роль матричной цепи нуклеиновой кислоты, на которой проводится синтез, а PrPС
— олигонуклеотидных праймеров и мононуклеотидов, обеспечивающих амплификацию PrPBSE. Тест позволяет in vitro многократно увеличивать количество PrPBSE, благодаря чему удается выявлять животных, находящихся в инкубационном периоде инфекции, когда клинические признаки болезни еще отсутствуют, а другие методы диагностики дают отрицательные результаты [19].
Заключение
За последние 15 лет достигнуты значительные успехи в лабораторной диагностике прионных болезней, в т.ч. ГЭ КРС. В дальнейшем, по всей видимости, будет уделено большее внимание совершенствованию существующих и разработке новых методов выявления инфекционной формы прионного белка, позволяющих обнаруживать его в биоптатах легкодоступных тканей, крови, спинномозговой жидкости, моче и др. Решение этих задач станет основой прижизненной диагностики ГЭ КРС. Выявление и уничтожение животных, находящихся в инкубационном периоде болезни, обеспечат ее надежный контроль и предотвратят распространение среди животных и людей.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Рыбаков С.С., Рябоконь А.А, Егоров А.А. и др. Методы диагностики и мониторинг губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота в России. Ветеринария, 2001, 2, 17—21.
2. Рыбаков С.С. Губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота.
- Владимир: Реклайн, 2007 г.
3. Asante E.A., Linehan J.M., Desbruslais M. et al. BSE prions propagate as either variant CJD-like or sporadic CJD-like prion strains in transgenic mice expressing human prion protein. EMBO J, 2002, 21, 6358—6366.
4. Baron T., Biacabe A.-G., Arsac J.-N. Et al. Atypical transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) in ruminants. Vaccine, 2007, 25, 5625—5630.
5. Besnoit C., Morel C. Note sur les tesions nerveuses de la tremblante du mouton. Rev Vet, 1898, 23, 397—400.
6. Browning S.R., Mason G.L., Sewald T. et al. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J Virol, 2004, 78, 13345—13350.
7. Crozet C., Flamant F., Bencsik A. et al. Efficient transmission of two different sheep scrapie isolates in transgenic mice expressing the ovine PrP gene. J. Virol, 2001, 75, 5328—5334.
8. Deleault N.R., Lucassen R.W., Supattapone S. RNA molecules stimulate prion protein conversion. Nature, 2003, 425, 717—720.
9. Grassi J., Comoy E., Simon S. et al. Rapid Test for the preclinical diagnosis of BSE in central nervous system tissue. Vet Rec, 2001, 149, 577—582.
10. Griffiths P.C., Spiropoulos J., Lockey R. et al. Bioassay of Atypical Scrapie Cases from Great Britain in TG338 Mice Provides Evidence That They Are Indistinguishable from NOR98. Prion 2007, Edinburgh, UK.Book of Abstracts, 2007, 38.
11. Jacobs J.G., Langeveld J.P.M., Biacabe A-G. et al. Molecular Discrimination of Atypical Bovine Spongiform Encephalopathy Strains from a Geographical Region Spanning a Wide Area in Europe. J of Clin. Microbiol, 2007, 45, 6, 1821—1829.
12. Klohn P.C., Stoltze L., Flechsig E. et al. A quantitative, highly sensitive cell-based infectivity assay for mouse scrapie prions. PNAS USA, 2003, 100, 11666—11671.
13. Lucassen R., Nishina K., Supattapone S. In vitro amplification of protease-resistant prion protein requires free sulfhydryl groups. Biochemistry, 2003, 42, 4127—4135.
14. Piening N., Weber P., Giese A., Kretzschmar H. Breakage of PrP aggregates is essential for efficient autocatalytic propagation of misfolded prion protein. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 326, 339—343.
15. Prusiner S.B. Prions. PNAS USA, 1998, 95, 13363—13383.
16. Rybakov S., Egorov A., Monks E. et al. Immunohistochemical detection of the bovine spongiform encephalopathy prion protein using antisera to synthetic peptide. Xl-th Intern Congr Virology. Intern Union of Microbiol Soc, Australia, Sydney, 1999, 272.
17. Saborio G.P., Permanne B., Soto C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding, Nature, 2001, 411, 810— 813.
18. Soto C., Saborio G.P., Anderes L. Cyclic amplification of protein misfolding: application to prion-related disorders and beyond. Trends in Neurosciences 2002, 25, 8, 390—394.
19. Soto C., Anderes L., Suardi S. et al. Pre-symptomatic detection of prions by cyclic amplification of protein misfolding FEBS Letters, 2005, 579, 3, 638—642.
Rybakov S.S., Egorov A.A. Achievements in the area of laboratory diagnosis of bovine spongiform encephalopathy.
СЕКРЕТЫ МАСТЕРСТВА
Отбор
УДК 619:616.98:578
патологического материала для
диагностики ГЭ КРС
С.С. Рыбаков, А.А. Егоров,
Федеральный центр охраны здоровья животных (г. Владимир)
Ключевые слова: диагностика, прион Сокращения: ПО — пробоотборник
Для постмортальной лабораторной диагностики ГЭ КРС берут пробы из стволовой части головного мозга (рис. 1А), поскольку в ней при данной патологии лее сильно нарушается структура и в максимальной степени накапливается прион (PrPBSE) [1, 4]. Особенно интенсивную вакуолизацию отмечают в скоплениях нейронов и их отростках в области задвижки продолговатого мозга (рис. 1 Б).
Ранее для отбора проб мозга КРС, проводившегося с целью диагностики ГЭ, распиливали череп животного (рис. 2). Этот способ имеет низкую производительность; его применяли в большинстве стран в 1990-е годы для пассивного мониоринга ГЭ КРС.
ЖВАЧНЫЕ
Рис. 1. Головной мозг КРС. А — схема отделов. Желтым цветом выделена стволовая часть; Б — стволовая часть. Указаны отделы, в которых находят изменения, характерные для ГЭ КРС
Рис. 2. Последовательность распиливания черепа КРС (1, 2 и 3 — разрезы) для извлечения головного мозга целиком
Рис. 3. Пробоотборники: А — титановый многоразовый (IZTL, Германия) [2]; Б (вид сверху и снизу) — пластиковый одноразовый, (Bio-Rad, Франция) [3]
Для активного мониторинга ГЭ КРС, который стали проводить во многих странах Европы с 1999.„2001 гг., стал необходим массовый анализ проб мозга.
Поэтому были разработаны ПО многоразового и одноразового применения (рис. 3 А и Б), позволяющие более безопасно и быстро извлекать через затылочное отверстие стволовую часть головного мозга у большого количества животных (например, во время массового убоя скота на мясокомбинате), а также у вынужденно убитого или павшего КРС. Для взятия стволовой части мозга у животных других видов (овцы, козы, оленя и т.д.) применяют аналогичные ПО, но меньшего размера.
Для извлечения пробы головного мозга ПО вводят полуцилиндрическим выступом вверх (рис. 4А) в большое затылочное отверстие на глубину 10.15 см (в зависимости от величины животного). Затем последовательно поворачивают его на 180° по и против часовой стрелки или делают оборот на 360°, чтобы перерезать ножки мозжечка и нервы. После этого ПО поворачивают полуцилиндрическим выступом вниз и извлекают стволовую часть
мозга (рис. 4 Б). Многоразовые ПО после использования стерилизуют 4...7%-м раствором гидроксида натрия в течение 3...4 мин и промывают водой.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Рыбаков С.С., Гусева Е.В., Чепуркин А.В., Егоров А.А. Инструкция по отбору проб мозга крупного рогатого скота для диагностики губкообразной энцефалопатии. Утверждена Департаментом ветеринарии 12.11. 1998 г. - Владимир, ВНИИЗЖ, 1998.
2. Innovations Zentrum fur Tiergezundheit and Landwirtshaft. Producte. http:// www.bse-sampler.de/PRODUKTE.HTM.
3. Bio Rad Laboratories, BSE Sampling Spoons. http://www.bio-rad.com/B2B/ BioRad/jsp.
4. Transmissible Spongiform Encephalopathies. Protocols for the laboratory diagnosis and confirmation of bovine spongiform encephalopathy and scrapie. Sci
Vet Com CEC, Brussels, 1994.
Rybakov S.S., Egorov A.A. Sampling of pathologic material for BSE diagnosis.
РВЖ СХЖ №1-2009
23
