CC BY
36
УДК (612.35:577.31) - 092.9
ОСТРЫЕ ЭФФЕКТЫ ВАЛЬПРОАТА НАТРИЯ НА СПЕКТР СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ ПЕЧЕНИ И ПЛАЗМЫ КРОВИ КРЫС, НАХОДИВШИХСЯ НА ИСКУССТВЕННОМ ЦИКЛЕ ДЕНЬ/НОЧЬ
М.М. Золотухин, В.Ю. Смирнов, Е.М. Дорошенко
ЦНИЛ
УО «Гродненский государственный медицинский университет»
Исследованы острые эффекты вальпроата натрия (Na-VPA) в дозе 400мг/кг на спектр свободных аминокислот и их производных в печени и плазме крови крыс в темновую фазу. Введение Na-VPA приводило к снижению содержания Pro, Ctr, Lys, Orn, Ala в плазме крови и увеличению уровней а-аминомасляной кислоты (aABA) и NH3 В печени снижались уровни фосфоэтаноламина, этаноламина, Pro, Ile, leu, Orn, Lys и увеличивалось содержание Phe и Tyr. Это свидетельствует, что Na-VPA, вводимый в темновую фазу, вызывает через 1,5 ч угнетение цикла мочевинообразования, влияет на транспорт Leu, Ile, Phe, Tyr в гепатоциты и вызывает усиление катаболизма кетогенных и гликогенных аминокислот.
Ключевые слова: вальпроат натрия, крыса, печень, плазма крови, аминокислоты, циркадианный ритм.
The effects of acute sodium valproate (Na-VPA) administration in a dose of400 mg/kg on the levels of free amino acids in the liver and blood plasma were studied in rats in the dark phase. The Na-VPA treatment led to a decrease in the concentrations of Pro, Ctr, Lys, Orn, and Ala in the blood plasma and increase in the levels of aABA and NH3 In the liver the levels of PEA, EA, Pro, Ile, leu, Orn, Lys decreased while those of Phe and Tyr were increased. It is suggested that Na-VPA administration in dark phase can lead to depression of urea cycle as well as affects the transport of Leu, Ile, Phe, Tyr to liver and speeds up the catabolism of ketogenic and glycogenic amino acids (1.5 h following the administration).
Key words: sodium valproate, rat, liver, blood plasma, amino acids, circadian rhythm.
Вальпроат (VPA, 2-пропилпентановая кислота) широко используется как антиконвульсант, но проведенные клинические и экспериментальные исследования выявили ряд его эффектов в отношении метаболизма углеводов, липидов и аминокислот в печени. Так, при введении вальпроевой кислоты или ее натриевой соли отмечали ингибирование ß-окисления и синтеза жирных кислот, глюконеогенеза, цикла мочевинообразования и окислительного фосфорилирования [5]. При введении крысам вальпроевой кислоты или вальпроил-CoA наблюдалось значительное ингибирование глицин-расщепляющей системы и повышение уровня глицина в сыворотке крови, печени и моче, причем эффект был дозозависимым [5, б, 9]. Введение вальпроата в дозе 200 мг/кг в течение 8 дней приводило к снижению уровней Ser, Gln и Ala в плазме крови и Gln, Cys, Phe и His и увеличению содержания Tau, Thr, Gly, aABA, Ile и Tyr в печени [4]. Отмечено, что использование вальпроата в больших дозах (80 мг/100 г массы тела) приводит к снижению синтеза белка в печени, индуцированного триптофаном [10]. Были отмечены также изменения конформации белков внутренней мембраны митохондрий, гипераммониемия и увеличение оттока желчи. Механизмы эффектов длительного введения вальпроата или его метаболитов мало изучены [5].
Очень мало работ посвящено влиянию вальпроата на обмен аминокислот при однократном его введении. Так, перфузия через яремную вену VPA в дозе 4 мг/кг/ мин в течение 50 мин приводила к увеличению уровней пирувата и аланина в ткани печени крыс, при этом содержание лактата не изменялось. Уровни Gln, Glu, Asp, малата и цитрата были очень высокими [12].
При использовании дозы 400 мг/кг максимальное влияние VPA на обмен метионина наблюдалось спустя 1 ч после введения. В печени отмечалось повышение уровней S-аденозилгомоцистеина (SAH), окисленного
глутатиона, снижение активности метионин^-аденозил-трансферазы на 56% и снижение соотношения SAM/ SAH. Все эти изменения приходили в норму в течение 24 ч с параллельным снижением концентрации VPA в сыворотке крови [14].
После введения терапевтической дозы VPA новорожденным мышам в плазме крови снижались уровни ß -гидроксибутирата и глюкозы, в печени снижался поток субстратов через CoA-зависимые ферменты ЦТК, повышался уровень Ala в 2 раза и снижались уровни Asp, Glu и Gln [3].
Другой эффект, проявляющийся в начальных сроках после введения вальпроата - модуляция активности натриевых каналов [11]. Возможно, таким образом осуществляется его влияние на транспорт некоторых аминокислот.
Известно, что транспорт ряда аминокислот в различные органы подчиняется циркадианным изменениям, в ходе которых происходит активация метаболических цепочек, где происходит синтез интермедиатов, обладающих рядом физиологических эффектов. Биосинтез этих метаболитов зависит от доступности предшественников, которыми являются некоторые аминокислоты [8]. Из приведенных выше работ видно, что вальпроат способен изменять конформации некоторых белков мембран, возможно, эти изменения могут затрагивать транспортные системы аминокислот, изменяя их транспортную емкость, вызывая тем самым дисбаланс в обмене аминокислот. Однако эффекты вальпроата в отношении показателей обмена аминокислот в тканях не исследовались в зависимости от фазы циркадианных ритмов, в частности, при его введении в темновую фазу. Такой подход может быть использован для метаболической коррекции дисбаланса в обмене аминокислот, вызванного некоторыми патологическими процессами (изменения в серотонинергичес-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Журнал ТрТМУ2009 № 3
кой системе головного мозга, расстройство цикла сон-бодрствование, печеночная энцефалопатия и др.).
Целью данной работы было оценить влияние вальп-роата натрия на пул свободных аминокислот плазмы крови и печени у крыс с синхронизированным циклом сон-бодрствование после его введения в темновую фазу.
Материалы и методы
В эксперименте использовалось 12 (по 6 в каждой группе) половозрелых белых беспородных крыс-самцов массой 160-200 г, содержавшихся при искусственном световом режиме (12 ч/12 ч) 14 дней на стандартном рационе вивария. Вальпроат натрия вводили однократно внут-рижелудочно в дозе 400 мг/кг (доза, при которой вальп-роат натрия реализует разнообразные эффекты в тканях [7, 8, 11, 13, 14]. Контрольные животные получали воду в эквиобъемных количествах. Введение препарата осуществлялось с началом темновой фазы с последующей де-капитацией спустя 1,5 ч.
После забоя животных печень быстро извлекали и замораживали в жидком азоте. Кровь отбирали в гепари-низированные пробирки и получали плазму центрифугированием на холоду (2°С) при 2000g 15 мин.
Содержание свободных аминокислот и их производных определяли в хлорнокислых экстрактах плазмы крови и ткани печени методом ионообменной хроматографии в собственной модификации [1] на автоматическом анализаторе аминокислот T-339M (Чехия). Регистрация и обработка хроматограмм осуществлялась с помощью программно-аппаратного комплекса «МультиХром-1» (Россия).
В работе использовались реактивы квалификации не ниже хч. Реагенты для аминокислотного анализа готовились из коммерческих комплектов для определения свободных аминокислот («Lachema», Чехия) на деионизо-ванной воде, которая перед использованием была подвергнута тройной дистилляции.
Статистическая обработка данных (сравнение средних по /-критерию Стьюдента, корреляционный анализ) реализована программой 3d из пакета BMDP (BMDP Statistical Software).
Результаты
Введение вальпроата натрия в начале темновой фазы приводило к снижению уровней пролина, аланина, цит-руллина, орнитина в плазме крови, а также пролина, изо-лейцина, лейцина, фенилаланина, тирозина, этанолами-на, фосфоэтаноламина, цистеата в печени крыс. Вальп-роат повышал содержание аммиака, a-ABA в плазме крови (табл. 1-2).
Характер этих изменений можно интерпретировать в определенном приближении при помощи корреляционного анализа. Так, снижение уровней Orn, Ctr и повышение содержания аммиака в плазме может указывать на угнетение цикла мочевинообразования. Появление положительной корреляции между Glu и Gln (r = 0,95) в печени свидетельствует об активации глутаминсинтетазной реакции, в которой происходит связывание части аммиака. Концентрация Ala в плазме крови снижалась, при этом достоверных изменений содержания аланина в печени не наблюдалось. Характер этих изменений может свидетельствовать об активации глюкозо-аланинового
цикла и гликолиза в периферических тканях, в результате чего происходит дополнительная наработка пирувата, утилизируемого в ЦТК [2]. Появление положительной корреляции между уровнями аспартата и глицина (r = 0,97) в печени может говорить об активации деградации углеродного скелета последнего в ЦТК, при этом уровень глицина в печеночной ткани не изменялся, возможно, за счет поступления углеводородного скелета, образующегося при деградации PEA [11]. Об этом свидетельствует снижение уровней EA, PEA и появление положительных связей между уровнями PEA Gln (r = 0,92), а также EA (r = 0,93) в печени.
Таблица 1 - Содержание свободных аминокислот и родственных соединений в плазме крови, мкмоль/л
Контроль Вальпроат, 400 мг/кг
Tau 302,5 ± 56,2 275,5 ± 23,7
Asp 28,42 ± 4,71 27,38 ± 1,69
HPro 34,97 ± 4,37 30,48 ± 3,46
Thr 166,2 ± 33,2 197,9 ± 15,0
Ser 323,5 ± 48,7 269,9 ± 10,0
Glu 98,4 ± 12,9 138,0 ± 15,8
Gln 1751±242 1969±137
Pro 170,3 ± 13,9 65,72 ± 9,55*
Gly 340,6 ± 34,4 345,8 ± 33,6
Ala 537,6 ± 58,2 354,1 ± 41,9*
Ctr 107,12 ± 6,67 83,26 ± 7,18*
aABA 27,41 ± 1,10 33,35 ± 1,96*
Val 101,66 ± 9,37 103,7 ± 15,5
Cys 13,05 ± 3,38 17,12 ± 1,49
Met 31,45 ± 2,54 34,79 ± 2,65
Ile 58,65 ± 3,56 55,71 ± 6,61
Leu 94,20 ± 5,22 83,10 ± 9,19
Tyr 46,80 ± 3,73 38,95 ± 5,36
Phe 45,12 ± 2,57 49,98 ± 2,94
EA 22,22 ± 2,03 23,17 ± 3,71
NH3 458,92 ± 9,01 531,0 ± 29,5*
Orn 36,15 ± 2,00 27,27 ± 1,95*
Lys 303,4 ± 28,9 272,3 ± 14,8
His 48,48 ± 2,71 46,56 ± 3,13
Trp 83,8 ± 4,19 66,7 ± 7,0
Таблица 2 - Содержание свободных аминокислот и родственных соединений в печени, нмоль/г
Контроль Вальпроат, 400 мг/кг
CA 457,9 ± 26,7 307,0 ± 36,7*
Tau 1894±472 1047±171
PEA 1640±159 533,8 ± 37,0*
urea 835 ± 286 651±170
Asp 6169 ± 563 5117±410
Thr 718± 130 486±113
Ser 1269 ± 114 946,0 ± 99,0
Glu 2966 ± 343 2902 ± 283
Gln 3892±356 4353 ± 666
Pro 269,0 ± 57,4 119,0 ± 16,0*
Gly 2928±217 2740,5 ± 51,0
Ala 1423 ± 398 1419±312
Ctr 85,3 ± 21,6 74,9 ± 13,9
aAba 46,5 ± 16,6 58,40 ± 8,33
Val 207,3 ± 33,4 136,5 ± 16,8
Met 72,4 ± 13,8 47,87 ± 6,70
Ile 138,1 ± 10,4 68,19 ± 9,83*
Leu 277,3 ± 28,1 129,0 ± 11,3*
Tyr 146,1 ± 11,5 58,11 ± 9,49*
Phe 106,4 ± 14,0 51,46 ± 6,27*
EA 1844±196 1033±101*
NH3 8732 ± 1073 5984±927
Orn 260,9 ± 44,2 159,5 ± 13,0
Lys 466,0 ± 65,2 314,8 ± 25,6
His 456,1 ± 55,1 368,6 ± 30,5
Примечание: * — p<0,05 по отношению к контролю
Особый интерес представляют аминокислоты, имеющие разветвленную углеводородную цепь (Leu, Ile, Val) и ароматические (Phe, Tyr). Введение вальпроата приводило к появлению положительных корреляционных связей между уровнями Ile в печени, с одной стороны, и Ile (r = 0,9б), Leu (r = 0,99), Phe (r = 0,97), и Val (r = 0,98) в плазме, а также Leu в печени и Leu (r = 0,88) и Phe (r = 0,92) в плазме. Снижение концентраций Ile, leu, Phe и Tyr в печени (табл. 2) при неизменном уровне этих аминокислот в плазме крови, возможно, объясняется способностью вальпроата изменять транспорт этих соединений, а также усилением их катаболизма [5].
Повышение концентрации аАВА в плазме, снижение уровня цистеата и появление положительной корреляции между содержанием Ser и Thr (r = 0,89) в печени может свидетельствовать о торможении деградации серосодержащих аминокислот [1] и, возможно, о возрастании утилизации треонина и серина до 2-кетомасляной кислоты с последующим ее переаминированием.
Выводы
1. Введение интактным животным вальпроата натрия в дозе 400 мг/кг в начале темновой фазы вызывает спустя 1,5 ч увеличение деградации гликогенных аминокислот в печени, что может рассматриваться как компенсаторный механизм вследствие угнетения энергетического обмена при введении Na-VPA.
2. При введении VPA в темновую фазу вероятно изменение транспорта Leu, Ile, а также ароматических аминокислот (Phe, Tyr) в печень. Это может быть вызвано как изменением активности транспортных систем для этих групп аминокислот, так и конкурентными отношениями между вальпроевой (2-пропилпентановой) кислотой и этими аминокислотами за транспортную систему.
3. Введение Na-VPA в примененной дозе вызывает в печени угнетение мочевинообразования.
Литература
1. Смирнов, В.Ю. Эффекты недостаточности таурина в формировании фонда аминокислот и их производных в центральной нервной системе и периферических тканях / В.Ю. Смирнов, Е.М.Дорошенко, Л.И. Нефедов // Вести АН Беларуси. Сер. биол. наук. - 1997. - № 2. - C. 83-92.
2. Шарманов, Т.Ш. Синтез, транспорт и утилизация аланина (аланин-глюкозный цикл) / Т.Ш. Шарманов, Э.К. Мухамеджанов / / Вопр. мед. химии. - 1981. - Т.27, №3. - С. 300-310.
3. A single therapeutic dose of valproate affects liver carbohydrate, fat, adenylate, amino acid, coenzyme A, and carnitine metabolism in infant mice: possible clinical significance / J.H. Thurston [et al.] // Life. Sci. - 1985. - Vol. 36, № 17. - P. 1643-1651.
4. Bykov, I.L. Valproate-dependent changes in the spectrum of free amino acids in rats: L-carnitine effects / I.L. Bykov // Eksp. Klin. Farmakol.- 2005.- Vol.68, № 2. - P. 36-39.
5. Cotariu, D. Valproic acid and the liver / D. Cotariu, J.L. Zaidman // Clin. Chem. - 1988. - Vol. 34, №5.- P. 890-897.
6. Effects of dipropylacetate on the glycine cleavage enzyme system and glycine levels. A possible experimental approach to nonketotic hyperglycinemia / A. Martin-Gallardo [ et al.] // Biochem. Pharmacol. - 1985. - Vol. 34, № 16. - P. 2877-2882.
7. Kerwin, R.W. The effect of sodium- n-dipropyl acetate on gamma-aminobutyric acid-dependent inhibition in the rat cortex and substantia nigra in relation to its anticonvulsant activity / R.W. Kerwin, H.R.Olpe, M.Schmutz // Br. J .Pharmacol. - 1980. - Vol.71, № 2. - P. 545- 551.
8. Loscher, W. Cardiovascular effects of GABA, GABA-aminotransferase inhibitors and valproic acid following systemic administration in rats, cats and dogs: pharmacological approach to localize the site of action / W.Loscher // Arch. Int. Pharmacodyn .Ther. - 1982. -Vol.257, № 1. - P.32 -58.
9. Mortensen,P.B. Inhibition of the glycine cleavage system: hyperglycinemia and hyperglycinuria caused by valproic acid / P.B.Mortensen, S.Kolvra , E.Christensen // Epilepsia. - 1980. - Vol. 21,№ 6. - P. 563-569.
10. Sidransky, H. Toxic effect of valproic acid on tryptophan binding to rat hepatic nuclei / H. Sidransky, E.Verney // Toxicology. -1996. - Vol. 109,№ 1. - P. 39-47.
1 1 . The acute effect of valproate on cerebral energy metabolism in mice / C.U. Johannessen [et al.] // Epilepsy. Res. - 2001. - Vol. 47, № 3. - P. 247-256.
1 2. The early effects of valproic acid in low doses in liver metabolism / M. Culebras [et al.] // Rev. Esp. Fisiol. - 1989. - Vol. 45, № 4. - P. 327-330.
1 3. The modification of the ethanol withdrawal syndrome in rats by di-n- propylacetate / E.P. Noble [et al.] // Psychopharmacologia. - 1976.- Vol.46, № 2. - P. 127- 131.
1 4. Ubeda, N. Acute valproate administration impairs methionine metabolism in rats / N.Ubeda,E.Alonso-Aperte, G.Varela-Moreiras / / J. Nutr. -2002. - Vol. 132, № 9. - P. 2737-2742.
Поступила 25.03.08
