CC BY
24
DOI 10.26724 / 2079-8334-2017-4-62-123-126 УДК 616.153: 616.379-008.64]-092.9
I. В. I еруш. О. I . Че|........ М. В.. Цка.1
ИДИ > УкраТмм «Букоиммськмм держкаг.мим медичмим умм-.ерсинч». м. Чермшш
ОСОБЛИВОСТ1 ЗМ1НИ АКТИВНОСТ1 ФЕРМЕНТ1В КЛАСУ ТРАНСФЕРАЗ ПРИ МОДЕЛЮВАНН1 АЛОКСАНОВОГО ЦУКРОВОГО Д1АБЕТУ У ЩУР1В
chernyukh. oksana72@gmail. com
У робота проведено дослвдження концентрацп 6ioxiMi4HHX показникв плазми KpoBi у бших нелiнiйних щур1в на фонi шдукованого алоксанового цукрового дiабету (ЦД). Алоксановий ЦД моделювали у тварин (n=20) шляхом внутршньоочеревинного введення 5 % розчину алоксан моногiдрату у розрахунку 150 мг/кг. На 14 добу експерименту проаналiзовано змгни показникв у п^внянш з контрольною групою (n=20). Вiдзначено достовiрне зростання активност ферментв АСТ та ГГТ, вiдповiдно на 84 % (р<0,01) та 79 % (р<0,01), при цьому зростання активност АЛТ було дещо нижчим - на 36 % (р<0,05). Встановлено, що на фонi гстотно! гшерглжеми (12,6±1,28 ммоль/л) змша активном! дослiджених фермента е бiльш чутливими показниками дисфункцп печiнки за умов розвитку гостро! фази ЦД (14 доба моделювання), нiж такi загальноприйнят1 бiохiмiчнi показники як вмкт загального бшка, альбумшу, сечовини, креатиншу. О^м того, коефiцiенти спiввiдношення активност ферментв вказували на гостре порушення функцюнального стану печiнки як первинного органу, який вщповщае за перебудову метаболiчних шляыв внаслiдок лiзису iнсулiн-продукуючих клгтин.
Ключов! слова: алоксановий цукровий д1абет (ЦД), плазма KpoBi, актившсть фермента, бш щур1.
Робота е фрагментом НДР «Стрестдуковаш морфофункцюнальш та бюхжчш змти структур хроноперюдичног i гепаторенальноi систем у ссавщв» (номер держреестрацп 0114U002472).
Статистика щодо зростання та поширеност цукрового д1абету (ЦД), незважаючи на досягнення у р1зномаштних галузях медицини, залишаеться невтшною, незалежно вщ р1вня сощально-економ1чного розвитку кра!ни. Зпдно даних шституту ендокринологп та обмшу речовин !м. В.П. Комюаренка Нацюнально! академп медичних наук Укра!ни станом на перше с1чня 2015 року в нашш кра!ш зареестровано 1 млн. 198,5 тис. ос1б (2,99% населення). Кшьюсть хворих на ЦД у свт також неухильно зростае i за прогнозами М1жнародно! Д1абетично! Федерацп (IFD) у 2030 р. може досягнути 552 млн. ос1б, а до 2040 року - 642 млн. [6].
Проблема полягае в тому, що на даний момент не виявлено ч1тких молекулярних мехашзм1в успадкування схильносп до ЦД I типу, немае едино! загальноприйнято! теорп, яка б пояснила отримаш численш даш в цш области Окр1м того, р1зномаштш метабол1чш ураження систем та оргашв, як розвиваються на фош ЦД II типу е також суттевою загрозою для здоров'я людсько! популяцп та одшею з причин швалщизацп населення.
Актуальним залишаеться питання щодо дослщження алоксаново! им1чно! модел1 експериментально! д1абетологп, токсичний вплив яко! вщбуваеться не тшьки у напрямку органу-мшеш - тдшлунково! залози, а призводить до дезштеграцп основних бiохiмiчних процес1в життед!яльносп, внаслщок генерацп величезно! кшькост токсичних метаболтв, в тому числ1, вшьнорадикальних [2-4, 11]. Зпдно думки переважно! бшьшосп науковщв алоксанова експериментальна модель викликае ЦД I типу, що шдтверджено ктшчно та морфолопчно [2, 12]. Але, з огляду на багатограннють шлях1в та прояв1в дп алоксану, юнування можливост вщновлення певно! частини р-клгтин остр1вюв Лангерганса, внаслщок !ндивщуально! гетерогенносп тварин, ця х1м1чна модель може мати риси прояву як ЦД I так i II тишв [9]. Вище зазначеш факти можуть пояснити широкий спектр отриманих результат1в дослщження [1, 5], школи, навгть з численними суперечностями щодо д1абетогенного та токсикогенного ефекпв алоксану залежно вщ доби дослщження, модел1 ЦД, гетерогенност метабол1чних прояв1в [7].
Метою роботи було охарактеризувати зм1ну активност ферменпв трансфераз (АЛТ, АСТ, ГГТ) та коефщенпв !х сшввщношення у плазм1 кров1 бших нелшшних щур1в, як найбшьш чутливих бюх1м1чних маркер1в та важливих клшчних скриншгових показниюв ураження тдшлунково! залози та печшки при моделюванш алоксанового ЦД (14 доба).
Матер1ал та методм дослщження. Експерименти проводилися на 40 статевозрших нелшшних щурах самцях (Rattus rattus L.) з масою тша - 0,16-0,18 кг. Упродовж одного мюяця до початку та шд час експерименту тварини утримувалися у в1варп за умов стало! температури (1821 С), вологосп пов1тря (50-55%) в окремих обм1нних кл1тках з вшьним доступом до питно! води та !'ж1 для адаптацИ до умов експерименту. Тварини були роздшеш на дв1 п1дгрупи: контрольну 1нтактн1 щури, (n=20) й досл1дну (n=20) - щури з !ндукованим алоксановим ЦД (ЦД викликали
шляхом уведення 5% алоксан монопдрату внутршньоочеревинно в дозi 150 мг/кг, у якост розчинника використано 0,09 % NaCl). Дослiдження рiвня базально! глшемп проводили за допомогою приладу «OneTouch» (виробник "Johnson&Johnson"), який становив > 10,0 ммоль/л при заборi кровi з хвостово! вени. Тварин забивали на 14 добу з моменту моделювання ЦД шляхом декаштацп пiд легким ефiрним наркозом у вiдповiдностi до етичних принципiв щодо проведення експерименпв згiдно вимог Свропейсько! конвенцп про захист хребетних тварин (Страсбург, 1986). Матерiалом для дослiдження була плазма кровь
Визначення концентрацл основних бiохiмiчних показникiв проводили в гепаринiзованiй плазмi без слiдiв гемолiзу загальноприйнятими утфшованими методиками. Концентрацiю загального бiлка визначали бiуретовим методом, альбумiну - з бромкрезоловим зеленим, глюкози -ферментативним глюкозооксидазним, сечовини - ферментативним уреазним, реактивами виробництва ПрАТ «Реагент» (м. Дтпропетровськ, Украна). Визначення концентрацп креатишну та активностi ферментiв класу трансфераз (АЛТ [2.6.1.2], АСТ [2.6.1.1], ГГТ [2.3.2.2]) проводили юнетичними спектрофотометричними методами анашзу з використанням оптичного тесту Варбурга, яю розробленi у вщповщносп з рекомендацiями Мiжнародно! федерацл Кштчно! ими (IFCC). Концентрацiю креатинiну визначали модифшованим методом Яффе без депроте!шзацп за реакцieю взаемодп пiкратами натрда та креатинiном у лужному середовищi з утворенням похщного 2,4,6-триштро-циклогексащену. Визначення активностi амiнотрансфераз (АЛТ, АСТ) проводили юнетичним методом без шридоксаль-5-фосфата, що базуеться на рiзницi поглинання окиснено! та вщновлено! форми НАД, актившсть ГГТ визначали за реакщею швидкостi утворення 5-амшо-3-нiтробензоата реагентами фiрми «Согтау» (м. Ломяню, Польща). Вимiрювання здiйснювали на фотометрi «Solar» РМ-1111, бiохiмiчному напiвавтоматичному аналiзаторi ВА-88 «Mindray». Для контролю правильностi та достовiрностi результатiв використовували контрольну сироватку «Согтау Serum НР» (REF 5-173; Lot 05-510F) для кожно! серп вимiрювань. Статистичну обробку, даних проводили за допомогою програм «Statistica 6» (Statsoft, США), аналiз результапв здiйснено за допомогою t-критерiя Стьюдента з поправкою на рiзницю дисперсш за критерiем U-Уiлкоксона. Результати вважали значущими на рiвнi достовiрностi p<0,05.
Результати дослiдження та Тх обговорення. Результати проведених дослiджень виявили виражену гшерглшемда, що коливалась в межах 11-20 ммоль/л у експериментальних тварин. Середня величина концентрацп глюкози становила 12,6 ммоль/л, що було вдвiчi вищим у порiвняннi з аналопчним показником у групi контрольних тварин (табл. 1) та свщчило про розвиток алоксанового ЦД.
Таблиця 1
Середнш bmíct основних бiохiмiчних показникчв у nna3MÍ кров1 щурiв за умов алоксанового v_ЦД (14 доба) (M±m)_
^Показники Групй\ тварин Глюкоза ммоль/л Заг. бiлок г/л Альбумш г/л Сечовина ммоль/л Креатишн мкмоль/л АЛТ U/l АСТ U/l ГГТ U/l
Контроль (n=20) 6,0±0,13 62,1±1,25 34,6±0,92 5,5 ± 0,23 55,6±0,21 56,2±0,25 128,1±0,12 32,3±0,12
Д1абет (n=20) 12,6±1,28 ** 51,1±0,85 * 31,8±0,65 4,1±0,04 53,3±0,13 76,8±0,14 * 235,4±0,11* * 58,1±0,15 **
Примiтка: * - р<0,05 та ** - р<0,01 - вiрогiднiсть змiн у пс^внянш з контрольною групою
З огляду нашого експерименту, найбiльш тковими були результати щодо змiни активност ферментiв, якi задiянi в обмш амiно- та кетокислот.
Величина активносп АСТ достовiрно зростала майже вдвiчi за умов моделювання алоксанового дiабету на вiдмiну вiд контрольно! групи тварин (в 1,8 рази); при цьому змша активносп АЛТ у плазмi дослщно! групи було дещо нижчою - у 1,4 рази (табл. 1).
Пщвищення активностi АСТ з одше! сторони буде свщчити про некротичнi процеси у гепатоцитах, а з шшо! - можна припустити, що пiдвищення активностi АСТ пов'язане або з необхiднiстю вщведення продуктiв глiколiзу вiд органiв, яю знаходилися в умовах гшоксп, або з шдвищенням енергетичних витрат печшкою. Тобто, суттеве зростання активностi АСТ в умовах нашого експерименту може свщчити про транзиторне ураження як шдшлунково! залози так i печшки. Вiдома безпосередня участь АСТ у трансмембранному перенос вiдновних потенцiалiв через мiтохондрiальну мембрану й регенерацп НАДН, у цьому контекстi пiдвищення активност АСТ свiдчить не тiльки про лiзис клiтин, а й про метаболiчну гiперактивнiсть для забезпечення необхщних бiохiмiчних механiзмiв та фiзiологiчних функцш на тлi гострого перiоду розвитку ЦД. ГГТ переважно локалiзований у м^охоц^ях i мiкросомах клiтин шдшлунково! залози та
гепатоцинв, що дозволяе вщнести дiагностику даного ферменту до процешв ураження цих оргашв. За умов нашого експерименту спостер^алось достовiрне зростання активностi ГГТ у порiвняннi з контрольною величиною на 79% (табл. 1).
Для оцшки функцюнального стану органiзму е важливими не тшьки данi щодо активносп ферментiв, а також коефiцiент сшввщношення !х активностi, що дозволяе характеризувати стушнь ушкодження клiтин (АЛТ як бшьш вiрогiдний цитоплазматичний маркер ушкодження, а АСТ та ГГТ- вщповщно - як мiтохондрiальнi).
За умов експерименту, на 14 добу з моменту введення алоксану, коефщент де Ртса (АСТ/АЛТ) зростав у 1,34 рази (таб. 2) у порiвняннi з його показником щодо контрольно! групи. Таке шкове зростання активносп АСТ та гiперболiзацiя коефiцiента де Ртса е маркером мiтохондрiально! дисфункцi! гепатоцинв та прояву гострих гепатотоксичних процешв на фонi розвитку алоксанового ЦД.
Високi значення коефiцiенту де Ртса свщчать про активне включення субстранв у цикл трикарбонових кислот та генералiзацiю основного метаболiчного шляху, при цьому загальш шляхи обмiну вуглеводiв сповiльнюються, що призводить до !х поступового виснаження та дисбалансу. Це свщчить про стресовий характер впливу та перенавантаження центральних метаболiчних шляхiв для забезпечення життедiяльностi основних систем оргашв. Змши в активностi ферменпв трансамiнування свiдчать про стан гомеостатично! функцi! печiнки.
Таблиця 2
Сшвв1дношення активноси ферменпв Контрольна група Алоксановий д1абет Коефщент зростання за умов ЦД/контроль
ГГТ/АлАт 0,57 0,75 1,31 *т
ГГТ/АсАТ 0,24 0,25 1,04
АсАТ/АлАТ 2,27 3,06 1,34 *t
Примiтка: * - р<0,05 - вiрогiднiсть змiни коефщенту.
За умов алоксанового дiабету будуть вщбуватися процеси активацiï окислювального стресу, провокуються змiни, що характернi для початкого гострого запального процесу ушкодження гепатоцинв. Приблизно однаково вщбуваеться зростання активносп АСТ та ГГТ, тому ïx спiввiдношення з активнiстю АЛТ характеризусться значним зростанням (табл. 2).
Дещо знижений рiст активностi АЛТ у порiвняннi з попереднiми ферментами, iмовiрно характеризуе змiни щодо глюкозо-аланшового циклу, внаслiдок активiзацiï процесiв глюконеогенезу для забезпечення тканин енергieю.
Показниками загальноï iнтоксикацiï органiзму також буде зниження бiлоксинтезуючоï функцiï печiнки. Адже концентращя загального бiлка кровi експериментальних тварин достовiрно знизилась (р<0,05) на фош порушення процесiв трансамiнування та метаболiзму амiнокислот, при вiдсутностi достовiрноï змiни щодо концентрацiï альбумiну (таб 1). Таю змши можуть свщчити про певний дисбаланс у ситэд глобулшово1' фракцiï та iнформувати про перерозподш вмiсту багатьох гострофазових бшюв.
Нами не вiдмiчена нефротоксична дiя алоксану: показники концентрацiï сечовини та креатишну залишалися без вiрогiдниx змш при порiвняннi контрольно!' та експериментально!' груп на 14 добу моделювання захворювання. Окрiм того, рiвень креатишну характеризувався достатньо низькою середньою величиною - 53,3 мкмоль/л, зпдно нашоï думки, при iмовiрнiй нефропатiï, вш мав сягати хоча б 75,0 мкмоль/л за умов вiдчутноï гшопротешемн (51,1г/л). На 14 добу моделювання алоксанового ЦД вщсутш достовiрнi прояви вираженоï iнтоксикацiï з посиленим розпадом тканин та переважанням катаболiчниx процешв над анаболiчними, пiдтвердженням чому е вiдсутнiсть змiн щодо зростання концентрацп сечовини та креатинiну у плазмi кровi.
Виражена недостатнiсть iнсулiну й гiперглiкемiя, якi розвиваються за умов алоксанового дiабету, здатнi викликати комплекс метаболiчниx порушень у системi пiшлунковоï залози та печiнки, пiдтвердженням чого е достовiрна, яскраво виражена, змша в активностi ферментiв АлАТ, АсАТ, ГГТ на початковому етапi формування патолопчних змiн. Використання цих показниюв у клiнiцi е загальнодоступними первинними маркерами ураження, а коефщенти сшввщношення ix активностi (АСТ/АЛТ та ГГТ/АЛТ) е важливими шдикаторами пошкодження цих тканин.
Висновок
За умов модельованого алоксанового ЦД (14 доба) вiдбуваeться вiрогiдне зростання активносп ферментiв (АСТ, ГГТ, АЛТ), що е вiдображенням порушення кттинних метаболiчних
процешв. Сшввщношення активносп таких ферменпв як ГГТ/АЛТ та АСТ/АЛТ характеризують стан гострих патолопчних процесiв у печiнцi та е бiльш iнформативними показниками, шж концентрацiя загального бiлка, альбумiну, сечовини, креатиншу.
Перспектива подальших дослгджень будуть стосуватися до^дження взаемозв'язку aKmuemcmi ферментiв та концентрацп гострофазових быюв (С-реактивного протешу, церулоплазмту, фiбриногену, а-кислого глжопротешу) за умов алоксанового ЦД.
1. Baryisheva E. V. Izmenenie pokazateley prooksidantno-antioksidantnoy sistemyi pri snizhenii kontsentratsii deyteriya v organizme laboratomyih zhivotnyih s alloksanovyim diabetom. / E. V. Baryisheva // Fundamentalnyie issledovaniya. - 2015. - No.1. - C. 457-461.
2. Mozheyko L. A. Eksperimentalnyie modeli dlya izucheniya saharnogo diabeta. Chast I. Alloksanovyiy diabet. / L. A. Mozheyko // Zhurn. Grodnen. gos. med. un-t. - 2013. - No. 3, T.43. - S. 26-29.
3. Palchikova N. A. Gormonalno-biohimicheskie osobennosti alloksanovoy i streptozototsinovoy modeley eksperimentalnogo diabeta. / N. A. Palchikova, N. V. Kuznetsova, O. I. Kuzminova [i dr.] // Byul. SO RAMN. - 2013 - No.6. - S. 18-24.
4. Telushkin P. K. Osobennosti azotistogo obmena i energoobespecheniya miokarda pri insulinovoy gipoglikemii u kryis. [Elektronniy resurs]: / P. K. Telushkin, A. Yu. Stelmah, N. B. Medvedeva [i dr.] // Sovremennyie problemyi nauki i obrazovaniya. -2014. - No. 5. Rezhim dostupa: https://www.science-education.ru/ru/article/view?id=15112
5. Tkachenko V. I. Analiz poshyrenosti ta zakhvoriuvanosti na tsukrovyi diabet sered naselennia svitu ta Ukrainy za 2003 -2013 rr. / V. I. Tkachenko // Liky Ukrainy plius. - 2014. - No.4 (21). - S. 55-59.
6. Gati Mohannad Abdulrazzak Gati. Fizizologo-biohimicheskie aspektyi adaptatsii kryis k usloviyam alloksanovogo diabeta / Gati Mohannad Abdulrazzak Gati, D. N. Fedorin, N. D. Polyakova-Semenova [et al.] // Fundamentalnyie issledovaniya. - 2013. - No.11(3). - C. 465-469.
7. Bukhari Syed Shahid Imran. Dose optimization of Alloxan for diabetes in albino mice / Bukhari Syed Shahid Imran, Abbasi Muddasir Hassan, Khan Muhammad Khalil Ahmad // Biologia (Pakistan). - 2015. - 61(2). - P. 301-305.
8. Chatzigeorgiou A. The Use of Animal Models in the Study of Diabetes Mellitus / A. Chatzigeorgiou, A. Halapas, K. Kalafatakis [et al.] // Internat. J. of Exper. and Clinic. Pathophys. And Drug Research. - 2009. - No.2. - Vol.23. - P. 245-258.
9. Lucchesi A. N. Diabetes mellitus triggers oxidative stress in the liver of alloxan treated rats: a mechanism for diabetic chronic liver disease / A. N. Lucchesi, N. Tavares de Freitas, L. L Cassettari [et al.] // Acta Cir. Bras. - 2013 - 28(7), P. 502-508. DOI: 10.1590/S0102-86502013000700005
10. Mnafgui K. Inhibition of key enzymes related to diabetes and hypertension by Eugenol in vitro and in alloxan-induced diabetic rats. / K. Mnafgui, F. Kaanich, A. Derbali [et al.] // Archives of Physiology and Biochemistry. - 2013. - 119(5). - P.225-233.
11. Mohd Azam Hyder. Comparative Levels of ALT, AST, ALP and GGT in Liver associated Diseases. / Mohd Azam Hyder, Marghoob Hasan, Abdelmarouf Hassan Mohieldein // European Journal of Experimental Biology. - 2013. - No.3 (2). - P. 280-284.
12. Radenkovich M. Experimental diabetes induced by alloxan and streptozotocin: The current state of the art / M. Radenkovich, M Stojanovich, M. Prostran // J. of Pharm. and Toxicol. Methods. - 2016. - No.78. - P.13-31.
Реферати
ОСОБЕННОСТИ ИЗМЕНЕНИИ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ КЛАССА ТРАНСФЕРАЗ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ АЛЛОКСАНОВОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА У КРЫС Геруш И. В., Чернюх О. Г., Дмкал М. В. В работе изучено содержание основных биохимических показателей плазмы крови нелинейных белых крыс на фоне индуцированного сахарного диабета (СД). Аллоксановый СД моделировали путем внутрибрюшинного введения 5 % раствора моногидрата аллоксана в расчете 150 мг/кг массы тела. На 14 сутки эксперимента изучены изменения показателей в сравнении с контрольными данными. Отмечено достоверное увеличение активности АСТ и ГГТ, соответственно на 84% (р<0,01) и 79 % (р<0,01), при этом возрастание активности АЛТ было немногим меньше - на 36 % (р<0,05). Установлено, что на фоне существенной гипергликемии (12,6±1,28 ммоль/л) изменение активности ферментов является более чувствительным показателем острой фазы развития аллоксанового СД, чем такие общепринятые показатели как концентрация общего белка, альбумина, мочевины, креатинина. Кроме этого, коэффициенты соотношения активности ферментов могут указывать на некротические нарушения функционального состояния печени, как первичного органа, который отвечает за перестройку метаболических путей вследствие лизиса инсулин продуцирующих клеток.
Ключевые слова: аллоксановый сахарный диабет, плазма крови, биохимические показатели, белые крысы.
Стаття надшшла 13.10.2017 р.
PECULIARITIES OF TRANSFERASE ENZYMATIC ACTIVITY CHANGES IN SIMULATING ALLOXAN-INDUCED DIABETES MELLITUS IN RATS
Gerush I V., Cherniukh O. G., Dikal M. V.
A subject of study in this work is exploration of main biochemical indices of the blood plasma of albino rats with the background of induced diabetes mellitus (DM). Alloxan DM was modeled in rats by intraperitoneal injection of a 5% liquid of alloxan monohydrate in the dose of 150 mg/kg of body weight. On the 14th day of the experiment, the changes in the indices were compared with the control data . The results of our studies have found a pronounced hyperglycemia ranging within 1120 mmol/L. An average glucose concentration was 12,6 ± 1,28 mmol/L that was twice as much as compared to the similar index in the group of control animals 6,0 ± 0,13 mmol/L. A significant increase in AST and GGT activity was observed, respectively, by 84% (p <0.01) and 79% (p<0.01), while the increase in ALT activity was slightly less - by 36% (p<0.05). It has been established that against a background of significant hyperglycemia (12.6 ± 1.28 mmol/L), the change in enzyme activity is a more sensitive indicator of the acute phase of alloxan DM development than such generally accepted indicators as the concentration of total protein, albumin, urea, creatinine. Furthermore, the enzyme activity ratios may indicate necrotic disorders of the functional state of the liver, as the primary organ responsible for rearranging the metabolic pathways due to the lysis of the insulin-producing cells.
Key words: alloxan's diabetes mellitus, blood plasma, biochemical indices, albino rats.
Pe^roeHT KocreHKO B.O.
