CC BY
19
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 616-002.71:576.809.33 • •
Ю.Д.Еременко, А.А.Бывалов, Е.В.Пименов .
1,1 •
ОСОБЕННОСТИ ЖИРНО-КИСЛОТНОГО СОСТАВА КЛЕТОК YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS, ВЫРАЩЕННЫХ НА ПЛОТНОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ТЕМПЕРАТУРАХ
НИИ микробиологии МО РФ, Киров; Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН, Сыктывкар
Изучено влияние температуры культивирования Y. pseudotuberculosis на содержание в клетках жирных кислот. Показано, что повышение температуры выращивания микробов на плотных питательных средах с 10 до 37 °С приводит к увеличению содержания циклопропановой кислоты с 17 атомами углерода и гидроксикислоты с 14 углеродными атомами, а также снижению количества ненасыщенных жирных кислот.
Жирные кислоты (ЖК)' грамотрицательных микроорганизмов являются одним из основных структурно-функциональных элементов клеточных мембран. Известно, что содержание насыщенных, ненасыщенных и циклопропановых ЖК и их соотношение влияет на скорость протекания мембранзависй-мых ферментативных реакций, определяет структуру клеточных мембран и, в конечном счете, их проницаемость для метаболитов и устойчивость клеток к стрессовым факторам окружающей среды [8].
Л.В.Андрееву [1] удалось выявить прямую связь содержания в микробах насыщенных и ненасыщенных ЖК с количеством основных интермедиатов: ацетил коА, пиридиннуклеотидов (НАД (Ф)), аминокислот и т.д. Это позволило на основе довольно простого (в методическом отношении) определения общего содержания бактериальных ЖК судить о метаболической,активности популяции в целом. Последнее нашло подтверждение в наших исследованиях [5].
С другой стороны, В.Ф.Конюхов с соавт. [7] показали высокую коррелятивную связь выживаемости бактерий Е. соИ при высушивании и аэрозо-лировании с содержанием в клетках ненасыщенных и циклопропановых ЖК.: : .
Немаловажное значение имеет тот факт, что некоторые исследователи связывают эндотоксиче-ские свойства патогенных бактерий (пирогенность, токсичность) с липидом А и, в частности, с содержанием в нем гидроксижирных кислот [2, 6].
Основываясь на этих исследованиях, мы установили, что анализ ЖК-состава клеток является надежным инструментом оценки процесса глубинного культивирования и прогнозирования сохраняемости бактерий У. ре$Ш (штамм ЕУ) при производстве чумной живой сухой вакцины [5].- • ; ■-
Име.ется большое количество, работ, результаты которых на примере ряда грамотрицательных бактерий согласуются с данными наших исследований, показывающих, что содержание отдельных классов жирных кислот существенно варьирует в ходе периодического культивирования микробов и в большой степени зависит от условий выращивания: температуры, состава питательных сред, аэрации, pH И Т.П. [3, 12].. ■
Известно, что возбудитель псевдотуберкулеза относится к числу сапрозоонозных микроорганизмов, могущих существовать как в природе (водоем, почва), так и в организме животных, в том числе теплокровных. Высокая приспособляемость Yersinia pseudotuberculosis к столь различным условиям обитания, в частности температурным, очевидно, обеспечивается мощными, генетически регулируемыми адаптационными возможностями микроба.
В связи с вышеизложенным целью наших исследований было изучение особенностей ЖК-состава клеток псевдотуберкулезного микроба при различных температурных режимах выращивания.
- , Материалы и методы
В работе использовали штамм 164/84 ОКС Y. pseudotuberculosis. из коллекции музея НИИМ МО РФ, полученный в результате селекции спонтанного , мутанта исходного штамма 164/84, серо-тип 1, утратившего плазмиду вирулентности. Бактериальную массу получали выращиванием микробов на плотной питательной среде на основе перевара Хоттингера при 10, 27 и 37 °С в течение 5, 2 и 3 сут соответственно. Клетки смывали 0,85 % раствором NaCl. . ,
К 0,5 мл бактериальной суспензии (5-109 м.к./мл) добавляли 4,5 мл 6н раствора НС! и подвергали гидролизу на кипящей водяной бане в течение 30 мин., Выделение ЖК проводили по методу Bligh E.G. et al. [9] хлороформтметанольной смесью (2:1, v/y). Метиловые производные жирных кислот (МЭЖК) получали в реакции с 10 % раствором BF3 в метаноле при 60 °С. Анализ МЭЖК проводили на газожидкостном хроматографе 5830А «Hewlett Packard» с использованием стеклянной насадочной колонки, заполненной 10 % Silar ЮС на газхроме Q в режиме программирования температуры от 160 до 190 °С, grad 3 °С мин-1. Детектор — ПИД, газ-носитель - гелий. ... ' :
.Идентификацию ЖК проводили сравнением времени удерживания (R,) отдельных пиков с R, стандартов фирмы «Merck». Наличие ненасыщенных и циклопропановых ЖК подтверждали также анализом хроматограмм после проведения реакции
Проблемы особо опасных инфекций, вып. 89, 2005
Жирная кислота Содержание ЖК,1
Состав жирных кислот клеток У. р$еш1о1иЬегси1о$1з при выращивании на плотной питательной среде
12:0° 14:0 15:0 16:0 16:1 17:0 17:У2) 18:0 18:1 18:2 19Л7 14-ОН2) 20:0 Х,3)
3,0 1,5 2,7 39,8 11,3 3,6 8,9 1,5 8,5 0,2 1,1 8,2 4,3
22:0
3,5
Таблица 1
Хг 0,1
Примечания: 1) 12:0 ... 18:1 - первая цифра - длина углеродной цепи, вторая - количество двойных связей; 2) 1IV, 14-ОН - циклопропа-новые и гидрокислоты соответственно; 3) Х|, Хг - неидентифицированные ЖК.
«бромирования» исходных МЭЖК в гексане при комнатной температуре и хлороформе при 70 °С соответственно. Гидроксикислоту определяли после проведения.реакции силилирования [11].
Результаты и обсуждение
Выбор температуры выращивания объясняется попыткой моделирования условий существования микроба во внешней среде: 37 °С соответствует температуре тела теплокровных животных, величина 10 °С принята за температуру «окружающей среды» и 27 °С - температура, при которой наблюдаются наиболее интенсивные рост и размножение бактерий в лабораторных условиях. Кроме того, 27 °С - это температура тела блох-переносчиков чумного микроба, который, как считает большинство авторов, эволюционно произошел от У. р$еис!оШ-Ьегси1о51э [10]. Указанное выше время культивирования было принято нами исходя из того, что три выбранных режима, при прочих равных условиях, обеспечивали приблизительно одинаковый выход клеточной биомассы.
Определение ЖК-состава клеток У. р$еис1ош-Ьегси1оз1з показало наличие насыщенных, ненасыщенных и циклопропановых кислот с длиной углеродной цепи от 12 до 22 атомов, а также гидрокси-кислоты с 14 углеродными атомами (С 14-ОН). Полученные результаты качественного содержания жирных кислот в клетках исследованного штамма соответствуют данным литературы [4].
Результаты исследования ЖК-состава клеток возбудителя псевдотуберкулеза при температуре выращивания 27 °С представлены в табл. 1.
Поскольку полный ЖК-спектр клеток У. рзеи-с1ошЬегси1оз18 представлен 16 кислотами и оперировать таким количеством показателей довольно затруднительно, нами была разработана система [5] обобщающих показателей (индексов) для характеристики большинства грамотрицательных бактерий: 1а - индекс активности ЖК-пула, ТУ - суммарное содержание циклопропановых ЖК, К„ - коэффициент ненасыщенности, С 14-ОН - содержание гидро-ксикислоты. Предложенные показатели рассчитываются по следующим формулам:
[і 6 :1]2 _ [коА] [НАД(ф)н]
[16:0] • [18:1] [АцкоА] • [НАД(ф)] ’
у.е
■ И;
где' 16:1, 16:0, 18:1 - жирные кислоты; коА, АцкоА и т. д. - основные интермедиаты окислительно-восстановительных (метаболических) реакций.
IV = С17У + С19У, процент,
где 17У и 19V - циклопропановые ЖК с 17 и 19 углеродными атомами. ■
Кн =
£ЖК,
юо-Ежк,
где ЖК| - ненасыщенные кислоты; ЖК2 - насыщенные кислоты.
Расчет показателей проводится с использованием процентного содержания ЖК получаемых хроматограмм.
Экспериментальная проверка подтвердила, что такая система индексов показателей ЖК-состава достаточно полно характеризует состояние мембранных структур клеточной стенки и уровень метаболизма бактериальной популяции [1;> 5]. В табл. 2 приведены показатели ЖК-состава клеток возбудителя псевдотуберкулеза при заданных температурах выращивания популяции. <
I. Таблица 2
Показатели жирно-кислотного состава клеток У. ряеисІоіиЬегсиІоїії при разных температурах выращивания (Х±1»5, п=6)
Температура Показатели ЖК-состава
выращивания, °С 1...10—2, у. е. IV, % К,„ отн. ед. ■ С 14-ОН, %
10 230,6+47,2 2,5±0,6 0,584±0,106 ■6,4±0,8
27 36,3±3,4 8,2±1,2 0,200±0,046 9,9±0,9
37 12,0+1,0 13,2+1,2 0,122+0,038 13,3± 1,2 •
Анализ данных, представленных в табл. 2, показывает, что температура культивирования оказывает существенное влияние на содержание 'отдельных жирных кислот. Так, с возрастанием температуры выращивания отмечается закономерное снижение индекса активности ЖК-пула (~ в 20 раз) при сравнении крайних значений температуры. Снижение величины данного показателя наряду с повышением удельного количества циклопропановых ЖК (более Чем в 5 раз для 10 и 37 °С культур) и почти 5-кратным уменьшением количества ненасыщенных кислот (Кн) указывает на то, что исследуемые культуры обладают различной метаболической активностью и «структурированностью» клеточных мембран.
Обнаруженные закономерности влияния температуры выращивания на содержание жирных кислот клеток псевдотуберкулезного микроба характерны для большинства грамотрицательных бактерий и свидетельствуют о том, что 10 °С культуры характеризуются высокой метаболической активностью на момент окончания культивирования и «не-сформированностью» клеточной стенки: Такие показатели, как правило, характерны для культур, находящихся в логарифмической фазе развития. 37 °С культуры отличаются минимальной метаболической активностью, низким содержанием ненасыщенных и значительным - циклопропановых ЖК. Указанный ЖК-спектр присущ культурам, находя-
щимся в .стационарной фазе роста. Культуры, выращенные при 27 °0, занимают промежуточное положение.
Анализ данных табл. 2 показывает, что отмечается корреляция между' температурой выращивания и содержанием гидроксикислоты (С14-ОН), наличие которой вносит вклад в проявление пирогенных свойств грамотрицательных микроорганизмов [6].
Таким образом, увеличение содержания цикло-пропановых ЖК, снижение количества ненасыщенных кислот, а также индекса активности ЖК-пула в клетках У. рзеи<1ошЬегси1о515 с увеличением температуры культивирования свидетельствуют об адаптационном механизме метаболизма жирных кислот, обеспечивающем оптимальное структурно-функциональное состояние клеточных мембран к окружающим условиям существования микробов. Это характерно для большинства энтеробактерий [4].
Отмеченное увеличение содержания гидроксикислоты с возрастанием температуры культивирования и связь с пирогенными свойствами возбудителя нуждается в дальнейшей экспериментальной проверке. ■ • . ’
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Андреев Л.В. // Докл. II Всесоюзн. конф. - М., 1982. - С. 75-106. - 2.'Варбанец Л.Д. // Микробиол. журн. -1994. - Т. 56, №3. - С. 76т-97. - 3. Васюре.нко З.П. Жирно-
кислотный состав патогенных микроорганизмов как таксономический признак: Автореф. дис........... д-ра мед. наук. - Киев,
1982. - 46 с. - 4. Васюренко З.П., Знаменский В.Si.it Микробиол. журн. - 1980. - Т. 42, № 4. - С. 462-469. - 5. Еременко Ю.Д., Смирнов С.Г., Чернядьев А.В. и др. // Биопрепараты. - 2002. - № 1. - С. 21-23; - 6. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К.//Биохимия. - 1993. - Т. 58, вып. 2. - С. 166— 181. - 7. Конюхов В.Ф., Мальцева Л. А., Лейман М.Д. и др. //ЖМЭИ. - 1986. -№ 10.-С. 25-27.- 8. Синяк К. М., Рудиченко В.Ф. //Изв. АН СССР. Сер. биол. - 1980. -№ 1. -С. 62-72. - 9. Bligh E.G., Dyer W!J. // Can. J. Biochem. Physiol. - 1959. - № 37. - P. 911-916. - 10. Carniel E. // Adv. Exp. Med. Biol. - 2003. - Vol. 529.,- P. 3-12. - 11. Mayberry W.P. // J. Bacteriol. - 1981. - Vol. 147, N 2. - P. 373-381. -12. Sandhu' K.K. // Diss. PH: D. John'S University. - New York, 1981. -87 p. :
Yu.D.Yeremenko, A.A.Byvalov, E.V.Pimenov
■ Peculiarities of Fatty-Acid Composition • of Yersinia pseudotuberculosis Cells Grown on Solid Nutritional Medium at Different Temperatures
Microbiology Research Institute of the Ministry of Defense of the Russian Federation, Kirov; Physiology Research Institute of the Komi SC,
Ural Division, RAS, Syktyvkar,
Investigations, into the effects of cultivation temperature’upon fatty acids content within Y. pseudotuberculosis cells showed that growth temperature of 37 °C, as compared to 10 °C, resulted in increased quantities of 17-carbon atoms cyclopropane acid and of 14-carbon-atoms hydroxy-acid as well as to reduced volumes of non-saturated fatty acids. .
■ ' . Поступила'01.12.04
УДК 616.932 - ;
Н.Д.Исаев, Ю.ВЛозовский, С.ПЗаднова, Н.И.Смирнова
ПОПУЛЯЦИОННАЯ НЕОДНОРОДНОСТЬ ПРИРОДНЫХ ШТАММОВ VIBRIO CHOLERAE КЛАССИЧЕСКОГО БИОВАРА: КООРДИНИРОВАННОЕ ИЗМЕНЕНИЕ МОРФОЛОГИИ КОЛОНИЙ, ПОДВИЖНОСТИ, ТОКСИГЕННОСТИ И ФЕРМЕНТАТИВНЫХ СВОЙСТВ
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
При изучении популяционного состава 76 природных штаммов V. cholerae классического биовара было выявлено 20 штаммов, формирующих типичные прозрачные и атипичные мутные колонии. Среди последних выявили 5 штаммов, вариабельность морфологии которых коррелировала с изменением продукции экзополисахарида, холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы и подвижности.
й функции генома Vibrio cholerae классического биовара позволит лучше понять механизм формирования патогенных клонов холерных вибрионов с новыми свойствами.'
Несмотря на глубокие исследования возбудителя холеры, многие свойства этого патогена остаются неизученными. В частности, до сих пор отсутствуют данные о возможности присутствия в гетерогенной популяции природных штаммов клонов с одновременным изменением ряда признаков, связанных с вирулентностью, а также о Механизме этого события. Более высокий уровень продукции холерного токсина, токсин-корёгулируемых пилей адгезии и других факторов вирулентности у холерных вибрионов классического биовара по сравнению с вибрионами эльтор делают'их наиболее удобным модельным объектом для исследования многих вопросов регуля-
Введение
. Холерные вибрионы классического биовара, возбудитель, по крайней мере 5-й и 6-й пандемий азиатской холеры, до сих пор сохранились в эндемичных по холере районах - Индии и Бангладеш [1, 4]. Несмотря на утрату ими в настоящее время пандемического потенциала, штаммы этого возбудителя являются, по-видимому, одним из природных резервуаров генов вирулентности. Об этом свидетельствует выделение в 1991-1994 гг. в Бангладеш клинических штаммов холерного вибриона биовара эльтор, которые в результате горизонтального переноса генетической информации приобрели ряд генов возбудителя азиатской холеры - ген ІсрА из острова патогенности УРІ-1 и ген ш/? из профага СТХф [4, 12]. В этой связи исследование структуры
