CC BY
128
© коллектив авторов, 2014
удк 616.33-006.04-089-059:616.411-089.87]-078.33
гривцова Л.Ю., глухов Е.В., Чулкова С.В., Безнос о.А., Фомина А.В., Неред С.Н., Стилиди и.С., Тупицын Н.Н.
особенности в-клеточного звена иммунитета у больных раком желудка после спленэктомии
ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН», 115478, г Москва
Иммунофенотип и субпопуляции В-клеток периферической крови охарактеризованы методом проточной цитоме-трии на основании оценки экспрессии на мембране антигенов CD20, CD21, CD23, CD38, HLA-DR, CD71, CD10, CD95, CD25, CD5, CD56 и легких цепей иммуноглобулинов Л и к у 50 больных раком желудка до оперативного вмешательства и в динамике через 3 мес после операции. В зависимости от объема оперативного вмешательства выделено две анализируемые группы - больные, перенесшие гастрэктомию со спленосохранной D2-лимфодиссекцией, и больные, которым выполнена гастрэктомия со стандартной D2-лимфодиссекцией и спленэктомией. В дооперационном периоде выявлено нарушение иммунологического репертуара зрелых клеток - большинство В-клеток демонстрировали низкие уровни экспрессии антигена CD21 (CD21low), среди них установлено присутствие выраженного количества CD23+ В-клеток, отмечены 3 случая клональных В-клеток и присутствие достаточно выраженной (17,7%) пропорции CD19+CD5+ В-клеток.
В динамике после операции у больных со спленэктомией отмечена тенденция к снижению количества CD19+CD21+-клеток (p = 0,08) и суммарного количества В-лимфоцитов, тогда как количество CD19+CD5+-клеток, напротив, достоверно возрастало (p = 0,013). Содержание CD19+CD5+-клеток в данной группе больных оказалось достоверно более высоким (p = 0,049) в сравнении с пациентами, у которых селезенка в ходе операции была сохранена.
Ключевые слова: В-клетки; клетки маргинальной зоны селезенки; тимуснезависимые антигены; гуморальный иммунитет; рак желудка; спленэктомия; D2-лимфодиссекция; спленосохранная D2-лимфодиссекция.
Grivtsova L.Yu., Glukhov E.V., Chulkova S.V., Beznos O.A., Fomina A.V., Nered S.N., Stilidy I.S.,Tupitsyn N.N.
ROLE OF SPLENECTOMY IN PECULIARITIES OF PERIPHERAL BLOOD B-CELL SUBPOPULATIONS IN PATIENTS WITH GASTRIC CANCER
Federal State Budgetary Institute «N.N.Blokhin Russian Cancer Research Center», 115478, Moscow
Peripheral blood B-cell subpopulations have been studied in 50 patients with gastric cancer undergone surgical treatment (D2) with or without splenectomy. The following membrane markers on B-cells (CD19+) were studied in 3-color flow cytometry: CD20, CD21, CD23, CD38, HLA-DR, CD71, CD10, CD95, CD25, CD5, к- and Л-light chains of Ig. In pre-operation period there were some peculiarities in B-cell repertuar in patients: low levels of CD21, prominent proportion of CD23+ cells, 3 clonal B-cell cases, and prominent proportion of CD5+ B-cells. 3 months after operation in patients with splenectomy it was noted tendency of diminution of CD19+CD21+ cells (p=0,08), while the number of CD19+CD5+ cells significantly increases (p=0,013). In this group of patients number of CD5+CD19+ cells was significantly higher than in patients whose spleen was not removed during operation.
Keywords : B-cells, cells of the marginal zone of the spleen, templatevalue antigens, humoral immunity, stomach cancer, splenectomy, D2-dissection, splenomegaly D2-dissection.
Введение. Селезенка является одним из наиболее значимых органов, обеспечивающих постоянство В-клеточного
звена иммунитета. Селезенка имеет сложное строение, включающее тимусзависимые, тимуснезависимые зоны и макрофагальные элементы. Высокая концентрация в селезенке иммунокомпетентных клеток, в том числе супрес-сорных, хелперных и части эффекторных, макрофагов, дендритных клеток, обеспечивает благоприятные условия для их кооперации в ходе иммунных ответов. Активное ан-тителообразование и продукция гуморальных медиаторов, происходящие в селезенке, позволяют считать, что одной из основных функций селезенки является участие ее в формировании полноценного иммунного ответа. Селезенка - это периферический лимфоидный орган, где осуществляется селекция наивных В-лимфоцитов и пополняется рециркулирующий пул В-клеток. Кроме того, именно селезенка является местом локализации особой популяции зрелых В-клеток, которые не циркулируют в организме, возобновление которых возможно только в селезенке [1].
Для коррежонденции: Гривцова Людмила Юрьевна, e-mail: [email protected]
For correspondence: Grivtsova Lyudmila Yur'evna, e-mail: [email protected]
Это так называемые клетки маргинальной зоны, окружающие участки периартериолярной лимфоидной (белой) пульпы.
В литературе имеются данные о том, что спленэктомия с целью адекватной лимфодиссекции при раке желудка вызывает выраженные и длительные нарушения функции различных звеньев иммунитета. Так, установлено, что у больных, подвергшихся спленэктомии, отмечается длительная имму-носупрессия [2].
В ряде экспериментальных работ выявлено, что нарушения иммунитета после спленэктомии затрагивают в первую очередь В-клеточный иммунный ответ, в том числе на тимуснезависимые (ТН) антигены 2-го типа, который обеспечивается популяцией В1а-лимфоцитов, которая имеет фенотип CD19+CD21 lowCD23 -CD5+IgM++ [3, 4]. Популяция В-клеток маргинальной зоны селезенки не является рецир-кулирующей, тем самым спленэктомия может привести к увеличению частоты развития бактериальных и вирусных инфекций.
В настоящее время резкое снижение противомикробной резистентности после спленэктомии подтверждено экспериментально и обозначается в зарубежной литературе термином «Overwhelming Post-splenectomy infections» (OPSI)
Рис. 1. Пример цитометрической оценки субпопуляции CD19+ В-клеток в периферической крови. Метод тройной флюоресцентной окраски.
На рисунке представлен цитометрический анализ субпопуляций В-клеток в образце периферической крови одного пациента. Клетки окрашивались одномоментно тремя монокло-нальными антителами, меченными различными флюорохромами. Анализ субпопуляции В-клеток проводился в пределах изолированного гейта СБ19+-клеток. а - общее количество СБ19+ В-клеток в образце. По оси абсцисс - экспрессия пан-В-клеточного антигена СБ19+; по оси ординат - параметр бокового светорассеяния лазерного луча, отражающий рабочее цитометрическое понятие - гранулярность клетки; б - клетки, попавшие только в область СБ19+, т. е. В-клетки, накопившиеся в ходе сбора образца; в, г - СБ19+-клетки, попавшие в изолированную область анализа рис. 1, б. Таким образом дальнейший анализ экспрессии антигенов проводился только в пределах В-клеток (СБ19+); в - количество СБ21+ В-клеток, которые, как правило, отсутствовали или были представлены единичными клетками. По оси абсцисс - область R2 - СБ19+СБ21+-клетки и количество В-клеток, экспрессирующих молекулу МСАМ СБ56; по оси ординат - область R3 - СБ19+СБ56+-клетки; г - присутствие в образце СБ23+ активированных СБ19+СБ20+ В-клеток.
В данном образце количество С023+СВ20+СБ19+ В-клеток было незначительным - 19% (область R2), тогда как большинство СБ19+СБ20+ В-клеток образца были отрицательными в отношении экспрессии антигена СБ23 (область R3).
[5-7]. Аналогом этого названия является термин «пост-спленэктомический гипоспленизм», признаками которого являются снижение иммунологической резистентности, возможность развития «молниеносных постспленэктоми-ческих инфекций», а также увеличение заболеваемости острыми и хроническими вирусными и бактериальными инфекциями на протяжении всей дальнейшей жизни больного [7, 8].
С целью оценки особенностей В-клеточного гуморального звена иммунитета у больных, страдающих раком желудка, проанализирован субпопуляционный состав В-лимфоцитов периферической крови. Дополнительно с целью оценки возможного влияния спленэктомии на субпопуляционный состав В-лимфоцитов проведено исследование В-клеточного звена лимфоцитов периферической крови в динамике (спустя 3 мес после операции).
В исследование включены 2 группы больных, оперированных по поводу рака желудка. В 1-ю группу вошли больные, которым была проозведена гастрэктомия со спле-носохранной Б2-лимфодиссекцией, 2-я группа включала больных, которым выполнена гастрэктомия со стандартной Б2-лимфодиссекцией и спленэктомией. Это позволило оценить особенности В-клеточного звена иммунной системы у больных после гастрэктомии со спленэктомией.
Материал и методы. Проанализировано 50 образцов периферической крови (ПК) до операции и 29 образцов ПК
спустя 3 мес после операции.
В исследование включено 50 больных с диагнозом рака желудка. В соответствии с классификацией TNM отдаленные метастазы отсутствовали (М0). В целом по группе преобладали больные с III стадией процесса (Ша - 12 больных, III6 - 6 больных), у 16 больных установлена I стадия (1а - 8 больных и 1б - 8 больных), у 12 пациентов установлена II стадия заболевания и у 4 больных - IV стадия.
Для оценки влияния спленэктомии на В-клеточное звено субпопуляционный состав В-клеток периферической крови после оперативного вмешательства оценен как у больных после гастрэктомии со стандартной фодиссекцией (спленэктомия) (14 человек), так и у больных после гастрэктомии со спленосох-ранной D2-лимфодиссекцией (12 человек).
Среди больных незначительно преобладали женщины (29 человек), средний возраст пациентов составил 59 лет (от 31 года до 79 лет), половину группы составили пациенты 60 лет и старше (25 человек).
Оценка субпопуляционного состава В-кле-ток периферической крови проводилась им-мунологически в реакции прямой иммуноф-луоресценции с использованием тройной флуоресцентной метки.
Результаты реакции учитывались на проточных цитометрах (FacsCan, программа Lysys II и FacsCanto II, программа Facs Diva). Обработка полученных данных проводилась на персональных компьютерах с использованием приложений WinMDI 2.8 и FCS 3.0.
Иммунофенотип В-клеток и их субпопуляции были охарактеризованы на основании оценки экспрессии на мембране следующих антигенов: CD20, CD21, CD23, CD38, HLA-DR, CD71, CD10, CD95, CD25, CD5, CD56 и легких цепей IgG-A, и IgG-к. Экспрессия указанных выше антигенов выявлялась моноклональны-ми антителами, напрямую меченными различными флуорохромами. Уровни неспецифического связывания определялись на основании изотипических контролей с соответствующей флуорохромной меткой.
Оценка экспрессии антигенов проводилась в гейте CD19+ В-клеток (рис. 1). При этом на первом этапе анализа цитоме-трически оценивалось количество CD19+ В-клеток в пределах лимфоцитов (рис. 1, а). Далее, в пределах только В-клеток (гейт CD19+, рис. 1, б) проводился анализ экспрессии двух антигенов, ассоциированных с В-клетками. В приведенных образцах это оценка антигенов CD56 одновременно с CD21 и CD20 одновременно с CD23 (рис 1, в, г соответственно).
В 42 образцах периферической крови до операции и 23 после операции на гематологическом анализаторе Micros 60 была подсчитана гемограмма, что позволило оценить абсолютное количество В-клеток.
В табл. 1 приведены изучаемые в работе антигены и использованные моноклональные антитела.
Статистический анализ проводился с использованием пакета SPSS 17 версии для Windows на основании анализа частот переменных, сравнения средних (Г-критерий для независимых выборок) и анализа корреляций по Пирсону.
Результаты и обсуждение. Основные показатели образцов периферической крови как до хирургического вмешательства, так и после приведены в табл. 2.
В целом по группе до оперативного вмешательства в сопоставлении с физиологической нормой средние показатели как относительного количества, так и абсолютного содержания В-клеток укладывались в границы нормы. Однако у 33% (16 из 48) больных относительное количество В-лимфоцитов
Таблица 1
Характеристика использованных моноклональных антител к изученным антигенам
Антиген Клон антител Изотип антител Производитель Флуо-рохром
CD19 4G7, HIB19 IgG1-K BD Biosciences PerCP
CD20 2H7 IgG1-K BD Biosciences PE
CD23 LT23 IgG1-K Сорбент, Россия FITC
CD5 L17F12 IgG2a-K BD Biosciences PE
CD21 BL13 IgG1-K BD Biosciences FITC
CD10 HL10a IgG2a-K BD Biosciences PE
CD71 L01.1 IgG2a-K BD Biosciences FITC
CD95 DX2 IgG1-K BD Biosciences PE
CD25 2A3 IgG1-K BD Biosciences FITC
CD56 NCAM 16.2 IgG2a-K BD Biosciences PE
CD3 SK7 IgG1-K BD Biosciences FITC
IgG-A/IgG-K - - BD Biosciences PE/FITC
было снижено и составило менее 5%, также у 38% больных (18 из 48) оказалось сниженным и абсолютное количество В-клеток в 1 мкл крови (менее 100 клеток в 1 мкл).
Спустя 3 мес после операции относительное количество В-клеток крови оказалось сниженным по сравнению с физиологической нормой у 52% (15 из 29) больных, тогда как низкое абсолютное содержание В-клеток периферической крови оказалось выявлено в 31% случаев (9 больных из 29 обследованных).
Среднее относительное количество В-клеток, так же как и их среднее абсолютное содержание в 1 мкл периферической крови, спустя 3 мес после оперативного вмешательства оказалось незначительно повышенным по сравнению с данными показателями при оценке до операции. Средний процент В-лимфоцитов крови после операции был несколько ниже, чем до оперативного вмешательства. Вместе с тем данные различия оказались статистически недостоверными (Г-тест при сопоставлении двух независимых переменных). Это может объясняться значительным разбросом анализируемых показателей как у больных до оперативного вмешательства, так и после.
Субпопуляционный состав лимфоцитов крови у больных раком желудка до оперативного вмешательства представлен в табл. 3.
В большинстве изученных образцов В-клетки были по-ликлональными с преобладанием Ig-к.
В одном случае В-лимфоциты оказались моноклональ-ны по легким цепям иммуноглобулинов (IgK++, рис. 2, а). Из особенностей иммунологического фенотипа в данном случае следует отметить низкий процент CD19+CD38+-клеток (рис. 2, б). Большинство В-клеток демонстрировали слабую экспрессию антигена CD21- CD21low (рис. 2, в), вместе с тем присутствовало достаточно выраженное количество клеток популяции CD19+CD21++, составляющих 25% от В-клеток. Также у данной больной установлено присутствие достаточ-
но выраженной пропорции CD19+CD5+-лимфоцитов (17,7%) (рис. 2, г). Экспрессия антигена CD5 была более слабой в сопоставлении с уровнями экспрессии данного антигена на Т-клетках. Количество В-лимфоцитов у данной больной составляло 4,6% (близко к нижней границе физиологической нормы, составляющей 5%) Еще у 3 пациенток выявлена тенденция к клональности В-клеток, при этом соотношение легких цепей IgG-K+/IgG-X+ составило 2,62-3,17-3,4 соответственно.
В отношении субпопуляционного состава В-клеток больных раком желудка на дооперационном этапе нами установлено следующее.
Все В-клетки демонстрировали иммунофенотип CD19+CD20+HLA-DR+CD10-CD21low/+, что в целом соответствует иммунофенотипу наивных зрелых, так называемых В2 В-клеток, прошедших вариант положительной селекции в костном мозге и вовлеченных в формирование адаптивного гуморального иммунного ответа на тимусзависимые антигены в присутствии активированных тем же антигеном Т-хелперов 2-го типа.
У части пациентов данная субпопуляция коэкспрессиро-вала выраженное количество CD23.
В условиях нормы положительную селекцию в процессе В-клеточного онтогенеза проходит CD19++CD21low CD23-В-клетка (Т1-транзиторная стадия). Данные клетки получают сигнал, обеспечивающий их выживание через В-клеточный рецептор без участия каких-либо антигенов. Положительная селекция осуществляется в костном мозге с участием клеток костномозговой стромы, но может также осуществляться и в периферических лимфоидных органах, в том числе и в селезенке. Конечным этапом процесса является выход незрелых В-лимфоцитов в кровь [9, 10].
Транзиторные В-клетки Т2- и Т3-стадии, характеризующиеся выраженной экспрессией CD23- и CD21-антигенов и иммуноглобулинов D класса, подвержены отрицательной селекции. Данный этап селекции В-клеток происходит без участия клеток стромы костного мозга и осуществляется, как правило, в периферических лимфоидных органах - лимфатических узлах, селезенке. Экспрессия CD23-антигена более характерна для В-клеток зародышевых центров фолликулов.
В 40% случаев (20 образцов из 49 оцененных) количество cD23+ В-клеток составляло более 25% от В-клеток и у 11 (22,4%) больных их число превышало 40% от В-клеток.
При этом, как правило, CD23+ В-клетки имели более слабую экспрессию антигена зрелых В-клеток cD20, что отчетливо видно в случае их выраженного количества (см. рис. 1, г, 3, в). Также несколько более слабыми в популяции CD19+CD23+ были уровни экспрессии пан-В-клеточного CD19 по сравнению с CD23-негативными клетками (рис. 3, г, д).
На рис. 1, 3 продемонстрированы образцы периферической крови с незначительным количеством CD23+В-клеток (см. рис. 1, г, 3, а, б) и их выраженной пропорцией (рис. 3, в).
Экспрессия CD21-антигена, как уже отмечено выше, была характерна для большего количества В-клеток и в среднем составляла 82%. Уровни экспрессии данного антигена были достаточно гетерогенными от выраженной (ми-
Таблица 2
Характеристика образцов периферической крови общей анализируемой группы больных
Показатель До операции После операции
M±m медиана разброс n M±m медиана разброс n
Лейкоциты ПК, • 103/мкл 6,3±0,34 5,9 2,5-16,4 43 6,8±0,47 6,4 1,3-11,7 25
Лимфоциты ПК, % 30,1±1,8 30,0 6,0-59,0 43 37,7±3,02 37,0 13,0-78,9 25
В-клетки среди лимфоцитов (CD19+), % 6,44±0,5 5,5 1,7-20,6 48 6,23±0,6 4,9 2,88-14,3 29
В-клетки среди лейкоцитов (CD19+), % 2,12±0,2 2,04 0,38-5,4 42 2,7±0,44 1,92 0,84-8,8 23
Абсолютное количество В-клеток (CD19+) в 1 мкл ПК 122,5±10,8 110,0 26,0-273,0 42 173±27 131,0 14,0-554,0 23
Таблица 3
субпопуляции в-лимфоцитов периферической крови у больных раком желудка до оперативного вмешательства
Антиген Процент коэкспрессии антигена в пределах СD19+ В-лимфоцитов
М±т медиана разброс п
СD5 14,2±1,91 9,8 1,0-60,0 46
СD23 24,6±2,4 20,5 1,4-70,9 49
СD20 97,2±0,4 97,5 85,9-100 48
СD71 9,6±1,1 7,7 0,0-38,0 48
СD10 0,48±0,09 0,2 0,0-35,0 45
СD38 19,8±2,9 11,1 1,1-77,3 45
НЬЛ-ЭИ 98,6±0,3 99,1 89,4-100,0 48
СD25 2,1±0,82 0,5 0,0-24,0 40
СD95 9,6±1,96 7,8 0,0-42,0 31
СD21 80,6±1,43 82,1 60,0-96,8 43
СD56 2,7±2,0 0,15 0,0-81,6 40
Соотношение легких цепей иммуноглобулинов 1,5-2,0 1,0-1,3 29 12
нимальное незначительное количество СБ19+СВ21+' в образцах) до слабой экспрессии. Преобладающая часть В-клеток экспрессировала данный антиген достаточно слабо, на уровне фона гранулоцитов (рис. 4, а), т. е. В-клетки были СБ19+СБ2110* (область Я2; рис. 1, в, рис. 4, а, б) и соответствовали Т1-транзиторной стадии развития В-клеток. В ряде случаев все СБ19+СБ21+ были СБ2110*, тогда как популяция СБ19+СБ21+ практически отсутствовала (менее 1%; рис. 4, б).
Таким образом, у больных, страдающих раком желудка, отмечено нарушение иммунологического репертуара наивных зрелых В2-клеток, выражающееся в присутствии значительного количества В-клеток со слабой экспрессией антигена СБ21 и выраженного количества СБ23+ В-клеток, отмечены случаи клональных В-клеток. Тем самым, вероятно, снижение функции антителобра-зования в случае основного пути развития антителоопродуцентов в ответ на тимусзави-симые антигены.
Однако существует альтернативный путь, когда В-клетка может быть активирована без участия Т-лимфоцита так называемыми ТН. ТН-антигены, представляющие собой, как правило, поливалентные липополисахари-ды, полисахариды или белки, разделяют на антигены I и II типа, которые по-разному обеспечивают полноценное развитие В-клеток до антителопродуцирующих форм. ТН-антигены вызывают преимущественно синтез ^М и индуцируют иммунный ответ, который не сопровождается формированием клеток памяти [11-13]. Специфический ответ на ТН II типа связывают в настоящее время с особой субпопуляцией лимфоцитов В1а [14], которая была описана впервые у мышей как уникальная популяция СБ5+ В-клеток [15], демонстрирующая фенотип СВ19+СВ211отСВ23-СБ5+^М++, в отличие от нее В1Ь-клет-ки являются СБ5-негативными.
Обе субпопуляции В1-клеток способны дифференцироваться в антителопродуценты без стимуляции антигеном. Естественные антитела, продуцируемые В1а-лимфоцитами, часто специфичны к микробным агентам и опсонизируют патогены, опосредуя врожденный иммунитет [16]. В1Ь-лимфоциты обеспечивают реализацию адаптивного иммунного ответа [14].
В норме у здоровых взрослых индивидуумов популяция СБ19+СБ5+ В-клеток составляет около 10% от В-лимфоцитов крови.
Среди В-лимфоцитов периферической крови больных раком желудка наблюдалось присутствие достаточно выраженной доли СБ19+СБ5+ В-клеток, в среднем составляющее 17,7% в пределах В-клеток. У 9 (19,5%) больных количество СБ5+ В-лимфоцитов было минимальным (менее 5% в пределах В-клеток), тогда как у 23% больных (11 из 46) СБ19+СБ5+-лимфоциты составляли более 20%, у 3 больных количество данных клеток составило более 40%. На рис. 5 приводятся примеры как минимального, так и выраженного количества СБ19+СБ5+ В-клеток в периферической крови больных раком желудка.
Следует отметить, что уровни экспрессии антигена СБ5 на В-клетках оказались значительно более слабыми (область Я3, рис. 5, д) по сравнению с экспрессией антигена СБ5 на периферических СБ3+ Т-клетках (область Я4, рис. 5, д).
При сравнении субпопуляционного состава В-лимфоци-тов в группах с содержанием СБ5+ В-клеток менее 15% и более 15% в пределах В-клеток с использованием Г-критерия непарных выборок установлено следующее.
Рис. 2. Образец периферической крови с клональными В-клетками. На рисунке представлен образец клональных В-клеток периферической крови больной раком желудка. В-лимфоциты ПК - 4,6%. На всех цитограммах только СБ19+ В-клетки. а - собственно экспрессия легких цепей иммуноглобулинов.
По оси абсцисс ^-к - большинство В-клеток (90,3%) АГ+; по оси ординат - Ig-1ambda (единичные В-клетки АГ+).
На последующих цитограммах особенности иммунофенотипа В-лимфоцитов данной больной. б - мономорфная (88,4%) экспрессия HLA-DR (ось ординат) и практически полное отсутствие среди В-клеток СD38+-популяции (ось абсцисс - СD19+СD38+ В-клетки составили 11,6%). Большинство В-клеток данного образца были СD21l0wСD56" (3В, по оси ординат -экспрессия В-клетками антигена СD56; по оси абсцисс - СD19+СD21+-клетки, большинство которых (область R2, 2В) экспрессировали СD21 достаточно слабо). Среди В-клеток данного образца присутствовала популяция СD19+СD5+ В-клеток, составляющая 17,7% (область R3, 2Г, по оси ординат -экспрессия СD5; по оси абсцисс - СD19PE-cy5).
Рис. 3. Экспрессия антигена CD23 на периферических В-клетках у больных раком желудка.
Рисунок демонстрирует характер экспрессии В-клетками периферической крови антигена СБ23 у 5 различных больных, на всех цитограммах только СБ19+-клетки. а, б, в - характер коэкспрессии В-клетками антигенов СБ20 и СБ23. По оси абсцисс -СБ23+-клетки; по оси ординат - СБ20+-клетки. В первом и во втором случае (цитограммы а, б) количество СБ23+ В-клеток незначительное - 10% и менее, в третьем случае (цито-грамма в) популяция СБ20+СБ23+ составляет большинство (59%) от В-клеток и представлена в виде отдельной дискретной популяции.
г, д - факт экспрессии СБ23 на В-клетках с более слабой экспрессией СБ19. По оси абсцисс - экспрессия СБ23; по оси ординат - СБ19+-клетки.
Среди В-клеток группы с более высоким содержанием CD19+CD5+ В-лимфоцитов (более 15%) достоверно более высоким оказался процент CD25+- и СВ21+-клеток, близки к достоверным оказались различия в количестве CD38+ В-клеток, однако разброс значений для 1-й группы образцов в отношении данного антигена был более высоким.
Данные представлены в табл. 4.
На циркулирующих периферических В-клетках экспрессия антигенов CD38 и CD25 может свидетельствовать об их активации (активированные В2, наивные зрелые В-клетки CD19+CD20+CD21+). На данном этапе возможна коэкспрессия СБ23-антигена.
По нашим данным, в группе с выраженным количеством CD5+ В-клеток количество CD19+CD23+ также было несколько более высоким (27,4% против 22,4%) по сравнению с группой образцов, содержащих меньшее количество CD5+ В-лимфоцитов, однако различия были статистически недостоверными.
В группе образцов, содержащих более 25% CD5+
В-лимфоцитов установлена высокая вероятность присутствия среди В-клеток популяции СВ19+СБ23+СВ38+СБ5+ (наличие достоверной корреляционной взаимосвязи для В-клеток с экспрессией СБ38- и СВ23-антигенов, R = 0,885; р = 0,008) и популяции СВ19+СБ5+СБ25+ (достоверная корреляционная взаимосвязь для СВ19+СБ5+СВ19+СБ25+ В-клеток, R = 0,879; р = 0,05).
Вместе с тем в большей части образцов (65% - 32 случая из 49 оцененных) количество СБ19+СБ38+ В-клеток было незначительным -менее 15,0% (см. рис. 3, б). Только в 11 (22,4%) случаях количество этих клеток превысило 25%.
При анализе субпопуляционного состава образцов с выраженным числом СБ38+ В-клеток получено подтверждение возможности циркуляции в периферической крови у больных раком желудка СВ19+СВ5+СБ38+ В-клеток (достоверная корреляционная зависимость для количества СБ38+ и СБ5+ В-клеток ^ = 0,919; р < 0,001), тогда как вероятность коэкспрессии антигенов СБ38 и СБ25 оказалась низкой (достоверная отрицательная корреляционная связь для числа СБ19+СБ38+ и СБ19+СБ25+ В-клеток ^ = -0,731; р = 0,011).
Таким образом, у больных раком желудка в периферической крови отмечается присутствие СБ19+СБ5+ В-клеток (В1а-клетки), часть из которых экспрессирует активационные антигены СБ38 и СБ23, незначительная часть СБ5+ В-клеток является СБ25+СБ38-. Учитывая мембранный репертуар циркулирующих в периферическом русле В-клеток, у больных раком желудка вероятно осуществление альтернативного ТН2-ответа на патогены.
Коэкспрессия антигенов СБ38 и СБ25 может наблюдаться в пределах популяции В-клеток маргинальной зоны селезенки (ВМЗ). Это особая субпопуляция В-клеток с признаками как наивных В-клеток, так и В-клеток памяти, также участвующая в осуществлении ТН-иммунного ответа на инкапсулированные патогены [16]. Данная субпопуляция В-клеток локализуется исключительно на границе белой пульпы в так называемой маргинальной зоне. Иммунофенотипически ВМЗ сходны скорее с активированными В2-клетками, отличием является лишь более выраженная экспрессия IgM (++). В пределах данной субпопуляции клеток, как уже сказано выше, отмечена экс_ прессия активационных антигенов СБ25 и СБ38,
возможна экспрессия СБ23 на незначительной части ВМЗ [1]. Данная субпопуляция не участвует в рециркуляции, а осуществляет челночные миграции до лимфоидных фолликулов и обратно, получая информацию об антигенах, поступающих в селезенку с кровью. Срок жизни клеток данного пула сопоставим со сроком жизни организма, а возобновление
Таблица 4
Значимые популяции В-клеток в группах больных раком желудка с выраженным содержанием В1а (CD5+)-лимфоцитов (1-я группа > 15%) и их нормальным содержанием (2-я группа < 15%)
Популяция Показатель
1-я группа (M±m) 2-я группа (M±m) Количество 1-я группа/2-я группа f-критерий Значимость
CD21 85,3±1,6 79,1±1,9 13/27 2,436 0,02
CD25 3,9±2,0 0,7±0,1 11/26 2,435 0,02
CD38 27,7±6,5 16,1±2,9 16/38 1,858 0,07
Таблица 5
Содержание В-лимфоцитов и их субпопуляций у больных раком желудка после гастрэктомии со спленосохранной D2-лимфодиссекцией в динамике (М±т)
Показатель Количество В-клеток, % п
до операции после операции
В-лимфоциты (СЭ19+) 5,36±0,65 6,1±0,94 12
В-лейкоциты (СЭ19+) 2,41±0,57 2,27±0,57 7
В-клетки (СЭ19+) в мкл крови 134,3±25,3 121,8±30,4 7
Лимфоциты:
СЭ19+С05+-лимфоциты 11,8±4,56 14,6±2,8 12
СЭ19+С023+-лимфоциты 21,2±4,62 24,4±6,5 14
СЭ19+С020+-лимфоциты 96,9±0,8 95,2±1,2 14
С019+СЭ71 +-лимфоциты 11,1±3,1 9,8±1,6 12
СЭ19+С010+-лимфоциты 0,8±0,32 0,5±0,18 11
СЭ19+С038+-лимфоциты 16,0±4,4 22,8±6,1 14
СЭ19+НЬАта+-лимфоциты 98,6±0,3 97,6±0,99 14
СЭ19+С025+-лимфоциты 1,4±0,84 3,84±2,22 12
СЭ19+С095+-лимфоциты 8,3±2,3 8,0±1,4 10
С019+СЭ21 +-лимфоциты 73,1±3,2 77,3±4,3 12
СЭ19+С056+-лимфоциты 1,0±0,3 1,6±1,2 12
Таблица 6
сопоставление состава в-лимфоцитов у больных раком желудка после гастрэктомии со стандартной D2-лимфодиссекцией и спле-нэктомией в динамике (М±т)
Показатель Количество В-клеток, % п
до операции после операции
В-лимфоциты (СЭ19+) 6,9±1,2 5,9±0,81 14
В-лейкоциты (СЭ19+) 1,9±0,35 2,73±0,7 12
В-клетки (СЭ19+) в 1 мкл крови 126.3±24,6 172,9±33,7 12
Лимфоциты:
СЭ19+С05+-лимфоциты 12,9±2,1 21,8±2,7 14
СЭ19+С023+-лимфоциты 19,2±3,2 21,4±4,3 15
СЭ19+С020+-лимфоциты 97,5±0,51 96,7±0,56 14
С019+СЭ71 +-лимфоциты 11,7±1,7 9,4±2,26 15
СЭ19+С010+-лимфоциты 0,47±0,1 0,74±0,15 14
СЭ19+С038+-лимфоциты 28,7±6,0 33,2±6,1 15
СЭ19+НЬАта+-лимфоциты 97,4±0,86 98,4±0,3 16
СЭ19+С025+-лимфоциты 3,86±2,98 1,35±0,7 8
СЭ19+С095+-лимфоциты 17,2±5,1 13,1±4,8 7
С019+СЭ21 +-лимфоциты 83,6±2,0 73,9±5,0 9
СЭ19+С056+-лимфоциты 0,3±0,13 0,65±0,28 7
популяций ВМЗ и В1а-клеток возможно только в селезенке [4, 14, 16, 17].
С целью оценки возможных последствий спленэктомии нами детально проанализирован субпопуляционный состав В-лимфоцитов на основании иммунологического фенотипа CD19+-клеток в группе больных, которым выполнена гастрэк-томия со спленосохранной D2-лимфодиссекцией и больных после гастрэктомии со стандартной D2-лимфодиссекцией и спленэктомией.
Состав В-клеток в динамике до операции и после среди пациентов с раком желудка после гастрэктомиии и сплено-сохранной D2-лимфодиссекции оценен у 14 человек и у 16 больных раком желудка после гастрэктомии и стандартной D2-лимфодиссекции со спленэктомией.
Основные показатели В-клеточного звена иммунитета в спленосохранной группе представлены в табл. 5.
При попарном сопоставлении (Г-критерий для парных переменных) средних величин оцененных показателей крови до операции и после в группе пациентов со спленосохранной операцией нами получены достоверные корреляционные связи между относительным (доля на лимфоциты и на лейкоциты) и абсолютным (клетки в 1 мкл крови) количеством CD19+ В-клеток (р = 0,015; р = 0,04 и р = 0,05 соответственно), также достоверно коррелировало до и после операции количество клеток популяции CD19+CD21+ (р = 0,034).
Показатели В-клеток в группе больных раком желудка после гастрэктомии со стандартной D2-лимфодиссекцией и спленэктомией представлены в табл. 6.
При попарном сопоставлении (Г-критерий для парных переменных) средних величин оцененных показателей до операции и после в группе больных после гастрэктомии со стандартной D2-лимфодиссекцией и спленэктоми-ей нами получены достоверные корреляционные связи между относительным количеством В-лимфоцитов (р = 0,018), количеством CD5+
В-лимфоцитов (р = 0,012) и числом CD19+CD38+-клеток (р = 0,035).
При этом достоверно более высоким после операции в сравнении с показателями до операции у больных раком желудка после стандартной D2-лимфодиссекции и спленэктомии оказался процент CD5+ В-клеток ( = -6,015 sig. < 0,0001, р = 0,013). Отмечена тенденция к снижению относительного суммарного количества В-лимфоцитов CD19+ (6,9% против 5,9%) и количества CD19+CD2l+ В-клеток - до операции их количество составляло 83,6%, а после - 73,9%, различия близки к достоверным (р = 0,08).
При сравнении количества В-клеток различных субпопуляций после оперативного вмешательства в группе больных раком желудка после гастрэктомии со спленосохранной
Рис. 4.Экспрессия антигена СЭ21 на В-клетках крови больных раком желудка. На рисунке представлены два образца периферической крови разных больных. а - характер экспрессии антигена СБ21 на В-клетках СБ19+.
По оси абсцисс - экспрессия СБ21; по оси ординат - экспрессия СБ19, на рисунке все клетки образца, включая гранулоциты. Область R2 - СБ19+СБ21+-клетки, данная область располагается над гранулоцитами, что свидетельствует о слабой экспрессии СБ21 В-клетками; б - только СБ19+-клетки.
По оси абсцисс - экспрессия СБ21; по оси ординат - экспрессия СБ56. Отмечено присутствие среди СБ19+СБ21+-клеток двух популяций, преобладающее количество В-клеток (70%) экспрессировали СБ21 слабо (область R2), однако присутствовала и минорная (0,5%) популяция (область R3) с достаточно яркой экспрессией СБ21.
случае реализации основного пути развития антителопродуцентов в ответ на тимусзависи-мые антигены.
Среди лимфоцитов периферической крови установлено присутствие CD19+CD5+В-клеток (В1а-клетки), часть из которых экспрессирует активационные антигены CD38 и CD23, незначительная часть cD5+ В-клеток является CD25+CD38-. Учитывая мембранный иммуно-фенотип циркулирующих в периферическом русле В-клеток, у больных раком желудка вероятно осуществление альтернативного ТН2-ответа на патогены.
В группе больных после оперативного вмешательства в обьеме гастрэктомии со стандартной D2-лимфодиссекцией и спленэктомией выявлена тенденция к снижению относительного суммарного количества В-лимфоцитов CD19+ и количества CD19+CD21+ В-клеток (различия близки к достоверным) по сравнению с показателями до операции. Тогда как количество CD19+CD5+-клеток после операции достоверно возрастало, что, учитывая данные в отношении В1 ВМЗ-популяций, может привести к ослаблению как общего, так и противоопухолевого иммунитета.
В группе больных раком желудка, перенесших гастрэктомию со стандартной D2-лимфодиссекцией и спленэктомией, количество CD19+CD5+ спустя 3 мес после операции оказалось достоверно более высоким по сравнению с пациентами, у которых селезенка в ходе операции была сохранена.
ЛИТЕРАТУРА
1. Тупицин Н.Н. Структура и функции иммунной системы человека. 2-е изд. М.: Медицина; 2007: 46-65.
Поступила 11.02.14
Рис. 5. Экспрессия СD5-антигена на В-клетках ПК у больных раком желудка. На рисунке образцы периферической крови трех больных, демонстрирующие особенности экспрессии антигена СБ5 на В-клетках.
а, в, д - по оси абсцисс - экспрессия СБ3; по оси ординат - экспрессия СБ5 в сопоставлении с изотипическими контролями (б, г, е).
а, д - образцы периферической крови с выраженным количеством СБ19+СБ5+ В-клеток (60 и 40% соответственно).
В образце цитограммы в СБ19+СБ5+-клетки практически отсутствуют (2,5% среди В-клеток). Уровень экспрессии СБ5 на В-клетках (область R3) в сопоставлении с СБ5+СБ3+ Т-лимфоцитами (область R4) наглядно демонстрирует цитограмма д.
Б2-лимфодиссекцией и группе больных после стандартной Б2-лимфодиссекии со спленэктомией достоверно более высоким (21,7% против 14,5%) оказалось только количество СБ19+СБ5+ В-клеток (р = 0,049) у больных, перенесших спленэктомию.
В отношении остальных субпопуляций В-клеток в группе больных раком желудка после стандартной Б2-лимфодиссекции со спленэктомией по сравнению с больными после спленосохранной Б2-лимфодиссекции достоверных различий нами не выявлено.
Заключение
Субпопуляционный анализ В-лимфоцитов периферической крови у больных раком желудка на дооперационном этапе позволил выявить нарушение иммунологического репертуара наивных зрелых В2-клеток. Большинство В-клеток периферической крови демонстрировали слабые уровни экспрессии антигена СD21(low), отмечены присутствие выраженного количества СБ23+ В-клеток и случаи клональных В-клеток. Тем самым вероятно снижение функции антителообразования в
3
REFERENCES
1. Tupitsin N.N. The structure and function of the human immune system. 2-nd edition. [Struktura i funktsii immunnoy sistemy cheloveka. 2-e izd.]. Moscow: Meditsina; 2007: 46-65. (in Russian)
2. Okuno K., Tanaka A., Shigeoka H., Hirai N., Kawai I., Kitano Y., Yasutomi M. Suppression of T-cell function in gastric cancer patients after total gastrectomy with splenectomy: implications of splenic autotransplantation. Gastric cancer. 1999; 2: 20-5.
Bouaziz J.D., Haas K.M., Poe J.C., Fujimoto M., Ted-
Yanaba K.,
der T.F. A regulatory B cell subset with a unique CD1dhiCD5+ phenotype controls T cell-dependent inflammatory responses. Immunity. 2008; 28: 639-50. PMID:1882568.
4. Hardy R.R., Hayakawa K. B cell development pa4thways. Ann. Rev. Immunol. 2001; 19: 595-621.
5. William B., Corazza G. Hyposplenism: a compherensive review. Part I: basic concepts and causes. Hematology. 2007; 12 (1): 1-13.
6. William B., Thawani, Sae-Tia S. Hyposplenism: a compherensive review. Part II: clinical manifestations, diagnosis, and management. Hematology. 2007; 12 (2): 89-98. Hansen K., Singer D. Asplenic-hyposplenic overwhelming sepsis: postsplenectony sepsis revisited. Pediatr. Devel. Pathol. 2001; 4: 105-21.
Sumaraju V., Smith L., Smith S. Infectious complications in as-plenic hosts. Infect. Dis. Clin. North Am. 2001; 15: 551-65. Schmidlin H., Diehl S.A., Blom B. New insights into the regulation of human B-cell differentiation. Trends Immunol. 2009; 30: 277-85.
DiLilo D.J., Hamaguchi Y., Ueda Y., Yang K., Uchida J., Haas
7
10
G., Kelsoe G., Tedder TY.F. Maintenance of long-lived plasma cells and serological memory despite mature and memory B-cell depletion during CD20 immunotherapy in mice. J. Immunol. 2008; 180: 361-71.
11. Radbruch A., Muehlinghaus G., Luger E.O. et al. Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell. Nat. Rev. Immunol. 2006; 6: 741-50.
12. McHeyzer-Williams L.J., McHeyzer-Williams M.G. Antigen-specific memory B cell development. Ann. Rev. Immunol. 2005; 23: 487-513.
13. Shapiro-Shelef M., Calame K. Regulation of plasma-cell development. Nat. Rev. Immunol. 2005; 5: 230-42.
14. Haas K.M., Poe J.C., Steeber D.A., Tedder T.F. B-1a and B-1b
cells exhibit distinct developmental requirementsand have unique functional roles ininnate and adaptive immunity to S. pneumo-niae. Immunity. 2005; 23: 7-18.
15. Hayakawa K., Hardy R.R., Parks D.R., Herzenberg L.A. The "Ly-1 B" cell subpopulation in normal immunodefective, and autoimmune mice. J. Exp. Med. 1983; 157: 202-18.
16. Pillai S., Cariappa A., Moran S.T. Marginal zone B cells. Annu Rev. Immunol. 2005; 23: 161-96.
17. LeBien T.W., Tedder T.F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 2008; 112: 1570-80; PMID:18725575; http:// dx.doi.org/10.1182/blood-2008-02-078071
Received 11.02.14
ИНФЕКЦИОННАЯ ИММУНОЛОГИЯ
© коллектив авторов, 2014 удк 615.276.2/.4:615.371].076.9
Пономарева Т.С.1, Дерябин П.Н.1, Каральник Б.В.2, Тугамбаев Т.и.1, Атшабар Б.Б.1, Денисова Т.г.2, Закарян С.Б.1, Мельникова Н.Н.1
влияние полиоксидония на иммуногенную и протективную активность живой чумной вакцины
1Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций (КНЦКЗИ) им. М. Айкимбаева, г Апматы, Казахстан; 2Научный центр гигиены и эпидемиологии им. Х. Жуматова, г Апматы, Казахстан
В модельных опытах иммунизации кроликов живой чумной вакциной EV изучено влияние полиоксидония на анти-генспецифические показатели иммунного ответа (содержание лимфоцитов с рецепторами (ЛфР) к F1 антигену Y. pestis и титр сывороточных антител к нему). Показано, что включение в схему иммунизации полиоксидония стимулирует как раннюю фазу антигенспецифического иммунного ответа, ускоряя появление и исчезновение ЛфР, так и его эффекторную фазу, усиливая антительный ответ. В экспериментах выявлена связь между ускорением первой фазы антигенспецифического ответа и общей интенсивностью эффекторной фазы иммунного ответа на вакцину EV. В опытах по заражению морских свинок, предварительно иммунизированных вакциной EV, вирулентным штаммом Y. pestis 231показано, что использование полиоксидония существенно повышает протективную и иммуногенную активность данной вакцины.
Ключевые слова: живая чумная вакцина EV; полиоксидоний; иммуномодуляция; антигенспецифический иммунный ответ; лимфоциты с рецепторами к F1; антитела; Y. pestis.
Ponomareva T.S.1, Deryabin P.N.1, Karal'nik B.V.2, Tugambaev T.I.1, Atshabar B.B.1, Denisova T.G.2, Zakaryan S.B.1, Mel'nikova N.N.1
THE IMPACT OF POLYOXIDONIUM ON IMMUNOGENIC AND PROTECTIVE ACTIVITY ALIVE PLAGUE VACCINE
1M. Aykimbaev Kazakskiy Scientific Center of Quarantine and Zoonotic diseases, Almaty, Kazakhstan; 2Kh. Zhumatov Scientific Center of Hygiene and Epidemilogy, Almaty, Kazakhstan
The effect of polyoxidonium on antigen-specific immune response (presence of lymphocytes with receptors to F1 antigen of Y. pestis (LR-F1) and titer of serum antibodies to the same antigen) were assessed in animal models involving immunization of rabbits with live plague vaccine produced from Y. pestis EV strain (EV vaccine). Results showed that polyoxidonium added to the vaccination scheme stimulated the early phase of the antigen-specific immune response by accelerating the appearance and disappearance of LR-F1 and its effector phase by enhancing antibody response. The experiments revealed a correlation between acceleration of the first phase of antigen-specific response and the overall intensity of the effector phase of the immune response to the EV vaccine. In experiments on guinea pigs vaccinated with EV vaccine and then challenged by inoculation of Y. pestis virulent 231 strain polyoxidonium significantly increased protective and immunogenic activity of the vaccine.
Keywords: live plague EV vaccine; polyoxidonium; immunomodulation; antigen-specific immune response; lymphocytes with receptors for F1; antibodies; Y. pestis.
Для корреспонденции: Пономарева Татьяна Сергеевна, e-mail: [email protected] For correspondence: Ponomareva Tat'yana Sergeevna, e-mail: [email protected]
