CC BY
29
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 616.248:612.225:612.017.1
DOI: 10.12737/artide_5d09d1aff1f5f6.43795360
ОСОБЕННОСТИ ЦИТОКИНОВОГО ПРОФИЛЯ ИНДУЦИРОВАННОЙ МОКРОТЫ У БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ ПРИ ХОЛОДОВОМ ВОЗДЕЙСТВИИ
Д.Е.Наумов, Д.А.Гассан, Е.Ю.Афанасьева, О.О.Котова, Е.Г.Шелудько, Е.В.Ушакова
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания», 675000, г. Благовещенск, ул. Калинина, 22
РЕЗЮМЕ
Цитокины играют важную роль в организации хронического воспаления в дыхательных путях больных бронхиальной астмой (БА). Целью настоящего исследования было провести сравнительный анализ уровней цитокинов ГЬ-1Ь, ГЬ-5, ГЬ-8, !Ь-10, ГЬ-13, ГЬ-18, TNFa в индуцированной мокроте больных БА и хроническим необструктивным бронхитом (ХНБ), уточнить их взаимосвязь с гиперреактивностью дыхательных путей и определить динамику в ответ на холодовое воздействие. В исследование было включено 46 больных БА легкой и средней тяжести и 18 больных ХНБ. Холодо-вая гиперреактивность дыхательных путей (ХГДП) выявлялась спирометрически, при снижении ОФВ1 на 10% и более после выполнения пробы с 3-минутной изокапнической гипервентиляцией холодным воздухом (ИГХВ). Мокроту собирали и обрабатывали стандартным способом дважды - до и после пробы с ИГХВ. Концентрации цитокинов определяли с помощью мультиплексного анализа на проточном цитометре BD FACSCаnto II. Мы не обнаружили существенных различий в уровнях ци-токинов между больными БА и ХНБ. Среди больных БА наличие ХГДП было ассоциировано с более высокой исходной концентрацией !Ь-10 (7,1 (4,7; 8,7) пг/мл против 5,1 (2,9; 7,9) пг/мл, р=0,06). Кроме этого, ГЬ-10 негативно влиял на спирометрические показатели проходимости дыхательных путей (ОФВ1 R=-0,44, р=0,002) и реактивность на бронхо-литик (АОФВ1 R=0,52, р<0,001). В ответ на пробу с ИГХВ у больных БА отмечалось увеличение уровней всех цитокинов, в то же время при ХНБ их концентрации чаще снижались. Были найдены значимые различия в динамике концентраций !Ь-5 в ответ на ИГХВ между больными БА и ХНБ (31,2 (-21,7; 83,5)% против -29,9 (-50,5; 16,8)%, р=0,02).
Таким образом, холодовое воздействие действительно провоцирует воспалительный ответ в дыхательных путях большинства больных БА, однако его паттерн отличается гетерогенностью. Механизм влияния IL-10 на реактивность дыхательных путей требует дальнейшего изучения.
Ключевые слова: бронхиальная астма, хронический необструктивный бронхит, воспаление, цитокины, ин-терлейкины, функция внешнего дыхания, холодовая гиперреактивность дыхательных путей.
SUMMARY
PECULIARITIES OF THE CYTOKINE PROFILE OF INDUCED SPUTUM IN ASTHMA PATIENTS UNDER COLD EXPOSURE
D.E.Naumov, D.A.Gassan, E.Yu.Afanas'eva, O.O.Kotova, E.G.Sheludko, E.V.Ushakova
Far Eastern Scientific Center of Physiology and Pathology of Respiration, 22 Kalinina Str.,
Blagoveshchensk, 675000, Russian Federation
Cytokines play an important role in the organization of chronic inflammation in the airways of patients with asthma. The purpose of this study was to conduct a comparative analysis of IL-1b, IL-5, IL-8, IL-10, IL-13, IL-18 and TNFa cytokines levels in induced sputum of patients with asthma and chronic bronchitis (CB), to clarify their relationship with airway hyperresponsive-ness and to determine their dynamics in response to cold exposure. The study enrolled 46 patients with mild to moderate asthma and 18 patients with CB. Cold airway hyperresponsiveness (CAH) was detected spiro-metrically by 10% or more decrease in FEV1 after the test with 3-minute isocapnic cold air hyperventilation (ICAH). Induced sputum was collected and processed by the standard method twice - before and after the test with ICAH. Cytokines concentrations were determined by multiplex analysis on BD FACSCanto II flow cyto-
meter. We found no significant differences in the cytokines levels between patients with asthma and CB. Among patients with asthma, the presence of CAH was associated with a higher initial concentration of IL-10 (7.1 (4.7; 8.7) pg/ml vs. 5.1 (2.9; 7.9) pg/ml, p=0.06). In addition, IL-10 adversely affected the spirometric indices of the airway patency (FEV1 R=-0.44, p=0.002) and the airway response to bronchodilator (AFEVj R=0.52, p<0.001). There was an increase in the levels of all cytokines in response to ICAH in patients with asthma, while in CB their concentrations rather decreased. Significant differences were found in the dynamics of IL-5 concentrations in response to ICAH between asthma and CB patients (31.2 (-21.7; 83.5)% vs. -29.9 (-50.5; 16.8)%, p=0.02). Thus, the cold exposure indeed provokes an inflammatory response in the airways of the majority of asthma patients, however its pattern is heterogeneous. The mechanism of the observed effect of IL-10 on the airway reactivity requires further investigation.
Key words: asthma, chronic bronchitis, inflammation, cytokines, interleukins, lung function, cold, airway hyper-responsiveness.
Бронхиальное воспаление, наряду с гиперреактивностью дыхательных путей, является краеугольным камнем патогенеза бронхиальной астмы (БА). Его особенности могут во многом определять клинический фенотип заболевания, влияя на его течение и эффективность базисной терапии. Цитокины - небольшие сигнальные молекулы, играющие ключевую роль в организации хронического воспаления при БА, за счет влияния на процессы привлечения различных типов клеток в очаг воспаления, их активации, дифференци-ровки и выживаемости. Традиционно принято считать, что при БА в большинстве случаев обнаруживается Th2-воспаление, названное в соответствии с типом преобладающих лимфоцитов (Th2 клетки), и характеризующееся увеличенным образованием таких цито-кинов, как IL-4, IL-5 и IL-13. Данный тип воспаления также характеризуется относительным преобладанием в клеточных инфильтратах дыхательных путей эозино-филов и тучных клеток, атопией и аллергическими реакциями, но и, как правило, хорошим ответом на терапию глюкокортикоидами. Тем не менее, учитывая большую патогенетическую гетерогенность самого заболевания, воспалительная реакция при БА не всегда соответствует Th2-паттерну - также выделяют «не-Th2» эндотипы, при которых преобладают цитокины IL-1, IL-6, IL-8, IL-17A, TNFa, IFNg, а уровень секреции Th2 цитокинов, напротив, снижен. Как правило, в данных случаях характер воспаления нейтрофильный, а клиническое течение осложняется плохим контролем заболевания, поскольку ответ на глюкокортикоидную терапию недостаточный [15]. Существуют и переходные эозинофильно-нейтрофильные эндотипы воспаления, точные механизмы формирования которых еще предстоит выяснить [11]. Предположительно, они могут возникать у предрасположенных больных с «классической» эозинофильной БА при действии раз-
личных внешних факторов (курение, терапия ингаляционными глюкокортикоидами, неблагоприятные климатические условия, персистирующая бактериальная инфекция дыхательных путей), изолированно либо в комбинации.
К настоящему времени было установлено, что хо-лодовое воздействие способно провоцировать воспалительную реакцию, опосредованную активацией катионных каналов TRPM8, что подтверждается в экспериментах in vitro. В частности, в бронхиальном эпителии было зафиксировано увеличение экспрессии IL-1a, IL-1b, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, GM-CSF и TNFa при охлаждении клеток до 18°C [14]. Аналогичные наблюдения in vivo проводились на лошадях -после тренировок при температуре -5°C в клетках бронхоальвеолярного лаважа у животных отмечалась повышенная экспрессия IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, однако экспрессия IL-1a, IL-1b, IL-8, IFNg и TNFa существенно не изменялась. У больных БА бронхопровокационная проба с изокапнической гипервентиляцией холодным воздухом сопровождалась увеличением концентраций IL-4 и IL-5, но снижением уровня IFNg в сыворотке крови [2].
Как можно судить на основании вышесказанного, динамика цитокинового профиля в дыхательных путях у больных БА в ответ на холодовое воздействие должным образом не исследовалась, чем и была продиктована цель настоящей работы.
Материалы и методы исследования
В исследовании приняли участие 46 больных БА и 18 пациентов с хроническим необструктивным бронхитом (ХНБ). Средний возраст обследованных составил 38,9±1,52 лет, в выборке преобладали лица женского пола (61%). В структуре БА наибольшую долю составляли пациенты с заболеванием средней тяжести (52%), за ними следовали больные с легким пер-систирующим течением (41%) и интермиттирующей БА (7%). При проведении исследования руководствовались принципами Хельсинкской декларации «Этические принципы проведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов исследования» с поправками 2013 г. и нормативными документами «Правила надлежащей клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом №200 от 01.04.2016 МЗ РФ. Больные подписывали информированное согласие на участие в исследовании в соответствии с протоколом, одобренным локальным Комитетом по биомедицинской этике.
Исследование функции внешнего дыхания проводили методом спирографии при форсированном выдохе с анализом кривой поток-объем на аппарате FlowScreen (Erich-Jaeger, Германия). Параметры функции внешнего дыхания, определяемые при спирометрии, включали объем форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ1), форсированную жизненную емкость легких (ФЖЕЛ), индекс Тиффно (ИТ), пиковую объемную скорость (ПОС), мгновенную объёмную скорость после выдоха 50% ФЖЕЛ (МОС50) и
75% ФЖЕЛ (МОС75), а также параметр МОС25-75, дающий интегральную оценку проходимости средних и мелких бронхов. Спирометрическое исследование выполняли исходно, а также после проведения бронхо-провокационной пробы с 3-минутной изокапнической гипервентиляцией холодным воздухом (ИГХВ). Гипервентиляцию воздушной смесью с температурой -20°С, содержащей 5% СО2, проводили на уровне 60% от должной максимальной вентиляции. На основании полученных данных о проходимости дыхательных путей вычисляли процентное отношение изменения (А, %) для параметров ФЖЕЛ, ОФВр ПОС, МОС50 и МОС75, а также ИТ. При снижении ОФВ! на 10% и более или снижении МОС50 на 25% и более по отношению к исходному диагностировали холодовую гиперреактивность дыхательных путей (ХГДП). Обратимость бронхиальной обструкции выявляли спирометрически через 15 мин после ингаляции бронхолитика (сальбу-тамол 400 мкг). Прирост ОФВ! на 12% и более в ответ на ингаляцию расценивался как положительная брон-ходилатационная проба.
Сбор индуцированной мокроты осуществляли по стандартному протоколу в день, предшествующий дню проведения бронхопровокационной пробы с ИГХВ и непосредственно после пробы. За 12 часов перед процедурой исключалось использование препаратов базисной терапии, а также контакт с потенциальными экзогенными триггерами, способными повлиять на функциональное состояние дыхательных путей, включая секреторный ответ. До начала процедуры больным выполняли ингаляцию сальбутамола в общей дозе 400 мкг для предотвращения реакции бронхоспазма. Секрецию мокроты индуцировали путем последовательных ингаляций 3% и 4% гипертонического солевого раствора сеансами по 7 мин через небулайзер. Процедуру проводили под контролем функции внешнего дыхания. При снижении показателя ОФВр более чем на 10% концентрацию раствора не повышали, а при снижении ОФВр более чем на 20% или при появлении респираторных симптомов ингаляцию гипертонического раствора прекращали. После каждого этапа ингаляции больные получали инструкцию тщательно прополоскать рот и пытаться откашлять мокроту. Полученную мокроту собирали в стерильные контейнеры и немедленно доставляли в лабораторию для обработки. После пробы с ИГХВ мокроту собирали без дополнительной стимуляции гипертоническим раствором.
Доставленные образцы мокроты взвешивали, после чего к образцу добавлялся 4-х кратный объем 0,1% ди-тиотреитола (БТТ). Образец инкубировали с DTT в течение 15 минут при 4°С с периодической ажитацией содержимого. По окончанию инкубации образец фильтровали через фильтр с диаметром пор 45 мкм и центрифугировали при 3500 об/мин 5 минут. После этого супернатант переносили в новую пробирку и хранили при -80°С до момента проведения анализа. Концентрации цитокинов Ш-5, ^-13, Ш-1Ь, ТОТа, Ш-8, ГЬ-10 и ГЬ-18 определяли на проточном цитометре ВБ
FACSCanto II (BD, США) с использованием набора для мультиплексного анализа LEGENDPlex (BioLegend, США) согласно инструкции производителя. Окончательные концентрации цитокинов вычислялись с учетом фактора разведения.
Для цитологического исследования из полученной индуцированной мокроты также готовили мазки на чистых предметных стёклах. Для этого образец полученной мокроты смешивали в равных порциях с 0,1% раствором трипсина, суспендировали в течение 10 минут. Затем отмывали в солевом растворе Хенкса, фильтровали, центрифугировали в течение 10 минут при 1000 об/мин. В камере Горяева считали количество клеток. Для уточнения клеточного состава 50 мкл препарата наносили на предметные стекла, нагретые до 37°С. Мазки высушивали в течение 5-10 минут при температуре 37°С путем помещения в вентилируемый термостат. После фиксации в течении 10 минут в парах 40% раствора формальдегида мазки окрашивали в 45% водном красителе Романовского-Гимза при рН 6,8. Далее полученные препараты изучали при помощи светооптической иммерсионной микроскопии, с подсчётом не менее 400 клеток в 100 полях зрения. Подсчитанное количество клеток выражали в процентах.
Статистические расчеты выполняли в программном пакете Statistica 10.0 (StatSoft, Inc., 2011) с использованием параметрических и непараметрических методов. Анализ количественных переменных с нормальным распределением проводили методом t-Стьюдента. В случае распределения, отличного от нормального, использовали U критерий Манна-Уитни. Корреляционный анализ проводили с использованием непараметрического R критерия Спирмена. Для ассоциативного анализа номинальных переменных использовали критерий х2 Пирсона или точный критерий Фишера. Данные представлены в виде M±m для нормально распределенных переменных и Me (Q1; Q3) -для переменных с распределением, отличным от нормального. Уровень значимости равный 0,05 принимали в качестве критического.
Результаты исследования и их обсуждение
Краткая сравнительная характеристика обследованного контингента больных приведена в таблице 1. В зависимости от диагноза пациенты имели значимые отличия в показателях вентиляционной функции легких и реактивности дыхательных путей в ответ на бронхолитик и ИГХВ, но в то же время были сопоставимы по полу, возрасту, анамнезу курения и клеточному составу индуцированной мокроты.
Вне зависимости от диагноза преобладающим ци-токином индуцированной мокроты был IL-8 - значения его концентраций в большинстве случаев отличались от концентраций других цитокинов на несколько порядков и составляли единицы и десятки нг/мл. За ним следовали провоспалительные цитокины IL-1b и IL-18 (сотни и тысячи пг/мл). Наконец, IL-5, IL-13, IL-10 и TNFa обнаруживались в мокроте в наименьших концентрациях (единицы и десятки пг/мл). По результатам
корреляционного анализа в общей выборке, все цито-кины возможно было разделить на два кластера. Первый кластер составили цитокины ГЬ-5, ГЬ-13 и ГЬ-10, иногда условно характеризуемые, как противовоспалительные - концентрации данных цитокинов тесно коррелировали между собой (ГЬ-5 с ГЬ-13 R=0,66, р<0,001; ГЬ-5 с IL-10 R=0,64, р<0,001; IL-10 с IL-13 R=0,9, р<0,001). Во второй кластер вошли провоспалительные
цитокины IL-1b, IL-8, ГЬ-18 и ТОТа, уровни которых также были существенно взаимосвязаны (ГЬ-1Ь с ГЬ-8 R=0,82, р<0,001; ГЬ-1Ь с ГЬ-18 R=0,64, р<0,001; ГЬ-1Ь с ТОТа R=0,42, р<0,001; ГЬ-8 с ГЬ-18 R=0,44, р<0,001; ГЬ-8 с ЮТа R=0,28, р=0,02). Обратные взаимосвязи между представителями двух кластеров обнаруживались лишь для ГЬ-8 с интерлейкинами ГЬ-10 ^=-0,28, р=0,02) и ГЬ-13 (Я=-0,3, р=0,01).
Таблица 1
ванного контингента
Параметр БА ХНБ Р
Возраст, лет 39,6±1,84 37,1±2,66 >0,05
Пол: мужской / женский, % 39 / 61 39 / 61 >0,05
Индекс курильщика не курящие, % 68 83 >0,05
до 10 пачка-лет, % 15 11
10 и более пачка-лет, % 17 6
Функция легких ОФВ1, % 96,2±2,25 105,9±3,11 0,02
ФЖЕЛ, % 105,3±2,18 108,8±3,94 >0,05
ИТ, % 92,5±1,32 100,0±1,28 0,001
Реакция на бронхолитик (ДОФВ1), % 8,0 (4,0; 14,0) 5,0 (2,0; 6,0) 0,01
Реакция на холодовую бронхопровокацию (ДОФВ1), % -8,0 (-12,9; -4,0) -1,0 (-4,0; 2,0) <0,001
Клеточный состав индуцированной мокроты (исходно) Макрофаги, % 20,6 (17,4; 28,2) 21,6 (17,7; 24,2) >0,05
Нейтрофилы, % 56,0 (51,0; 60,8) 57,0 (46,9; 64,8) >0,05
Эозинофилы, % 2,2 (1,4; 5,2) 2,6 (1,7; 2,9) >0,05
Несмотря на то, что среди больных ХНБ медианные концентрации большинства цитокинов были несколько выше, чем при БА, значимых отличий обнаружено не было. При этом уровни противовоспалительных цитокинов демонстрировали обратную корреляцию с показателями функции легких при БА. В частности, для ГЬ-5 отмечалась обратная корреляция с ОФВ1 ^=-0,3, р=0,04), для ГЬ-13 - с ОФВ1 ^=-0,37, р=0,01), с ПОС (Я=-0,45, р=0,001), и с МОС50 (R=-0,35, р=0,02). Однако наиболее сильные и значимые корреляции с параметрами вентиляционной функции легких были найдены для ГЬ-10 (ОФВ1 R=-0,44, р=0,002; ФЖЕЛ R=-0,3! р=0,04; ПОС R=-0,51, р<0,001; МОС50 R=-0,38! р=0,009).
В ответ на пробу с ИГХВ у больных БА для всех цитокинов отмечался прирост концентраций различной степени выраженности - наиболее заметные тенденции определялись для ГЬ-5 и ГЬ-1Ь, в меньшей степени - для ГЬ-8 и ГЬ-18 (табл. 2). В отличие от БА, при ХНБ концентрации цитокинов после пробы с ИГХВ чаще, напротив - снижались, что в наибольшей степени прослеживалось для ГЬ-5 (табл. 3). Различия в относительной динамике изменения концентраций между больными БА и ХНБ были значимы только для ГЬ-5 (р=0,02), хотя тенденция отмечалась также для ТОТа (р=0,08). В общем, как можно заметить по меж-квартильному размаху, реакции в каждой из подгрупп были гетерогенными - вне зависимости от диагноза на-
правленность изменения концентрации каждого из ци-токинов могла быть различной, что говорит о наличии дополнительных неучтенных факторов, влияющих на цитокиновый баланс.
Аналогично исходным концентрациям, динамика уровней цитокинов в кластерах в ответ на холодовое воздействие также была согласованной, и особенно высоко коррелированной при ХНБ. Не было обнаружено обратных взаимосвязей динамики противовоспалительных и провоспалительных цитокинов. При этом, при рассмотрении зависимости направленности изменений концентрации от исходного уровня для всех ци-токинов была характерна значимая обратная корреляция. Таким образом, чем более высоким был исходный уровень медиатора, тем с большей вероятностью он снижался в ответ на бронхопровокацион-ную пробу с ИГХВ. По всей видимости, данная зависимость является результатом наличия в клетках физиологического механизма отрицательной обратной связи, сдерживающего концентрацию цитокинов в определенном диапазоне значений, и препятствующего их неконтролируемому выбросу, несмотря на внешние воздействия.
ХГДП, как качественный признак, не была достоверно связана с особенностями уровней проанализированных цитокинов ни до, ни после пробы. Динамика уровней цитокинов также была не значима. Тем не менее, отмечалась тенденция к исходно более высокой
концентрации ГЬ-10 у больных БА с ХГДП (7,1 (4,7; 8,7) пг/мл против 5,1 (2,9; 7,9) пг/мл, р=0,06). При корреляционном анализе амплитуды реакции на ИГХВ и концентраций цитокинов, взаимосвязь прослеживалась для ГЬ-10 (АОФВ1 R=-0,29, р=0,05; АФЖЕЛ R=-0,28! р=0,05; АПОС R=-0,32, р=0,02; АМОС25-75 R=-0,3, р=0,03) и IL-13 (АОФВ1 R=-0,28, р=0,06; АФЖЕЛ R=-
0,29, p=0,05; АПОС R=-0,27, p=0,05; АМОС25-75
R=-
0,31, р=0,03). Не исключено, что истинной являлась лишь взаимосвязь реакции на ИГХВ с ГЬ-10, а корреляция с ГЬ-13 была опосредованной, за счет высокой степени связи между ГЬ-10 и ГЬ-13, о чем упоминалось выше.
Таблица 2
Динамика концентраций цитокинов в ответ на пробу с ИГХВ у больных БА
Цитокин Концентрация до пробы с ИГХВ Концентрация после пробы с ИГХВ Относительная динамика (%) p
IL5, пг/мл 1,06 (0,80; 1,39) 1,22 (0,92; 1,67) 31,2 (-21,7; 83,5) 0,09
IL13, пг,мл 6,83 (4,76; 9,62) 7,47 (4,01; 10,38) 6,1 (-33,7; 89,8) 0,5
IL1b, пг/мл 428,33 (231,74; 800,06) 712,02 (244,23; 1201,76) 42,7 (-34,7; 200,0) 0,09
TNFa, пг/мл 4,24 (3,39; 8,04) 5,67 (3,39; 10,04) 0 (-57,8; 136,8) 0,99
IL8, нг/мл 9,83 (4,50; 15,40) 11,32 (4,69; 21,46) 8,4 (-29,0; 132,1) 0,14
IL10, пг/мл 5,41 (3,29; 7,94) 6,31 (3,35; 9,47) 19,2 (-46,5; 147,4) 0,4
IL18, пг/мл 406,21 (245,68; 838,87) 599,59 (241,90; 918,01) 23,8 (-37,5; 94,3) 0,11
Таблица 3
Динамика концентраций цитокинов в ответ на пробу с ИГХВ у больных ХНБ
Цитокин Концентрация до пробы с ИГХВ Концентрация после пробы с ИГХВ Относительная динамика (%) p
IL5, пг/мл 1,23 (1,01; 1,74) 1,08 (0,61; 1,39) -29,9 (-50,5; 16,8) 0,07
IL13, пг,мл 9,04 (4,01; 13,98) 7,84 (5,50; 10,90) -31,2 (-47,4; 73,9) 0,3
IL1b, пг/мл 459,41 (191,95; 1207,70) 627,40 (179,45; 1119,78) -26,4 (-43,4; 96,1) 0,6
TNFa, пг/мл 6,24 (3,95; 18,14) 3,39 (1,54; 10,48) -42,2 (-78,4; 189,2) 0,14
IL8, нг/мл 5,47 (2,75; 20,48) 12,90 (2,73; 19,56) 0,9 (-38,4; 189,2) 0,6
IL10, пг/мл 6,61 (2,05; 9,39) 6,43 (4,34; 8,66) -18,9 (-57,2; 97,8) 0,6
IL18, пг/мл 393,90 (234,33; 623,32) 531,19 (281,17; 668,89) 25,7 (-48,2; 77,5) 0,3
Примечательно, что исходная концентрация ГЬ-10 также коррелировала с реактивностью дыхательных путей на бронхолитик (АОФВ1 R=0,52, р<0,001; АФЖЕЛ R=0,33, р=0,02; АПОС R=0,32, р=0,02; АМОС50 R=0,44, р=0,002; АМОС25-75 R=0,32, р=0,02). При этом, чем выраженнее была реакция на сальбута-мол, тем больше было относительное снижение уровня ГЬ-10 (АОФВ1 R=-0,35, р<0,01). Также в группе больных БА с положительной реакцией отмечались более высокие исходные концентрации ГЬ-10 и ГЬ-13, по сравнению с пациентами без гиперреактивности на сальбутамол (ГЬ-10: 7,8 (4,9; 8,8) пг/мл против 4,7 (2,9; 6,5) пг/мл, р=0,008; ГЬ-13: 8,6 (6,3; 11,3) пг/мл против 5,5 (3,7; 8,3) пг/мл, р=0,01).
Нам не удалось обнаружить согласованных изменений уровня цитокинов и клеточного состава мокроты при холодовом воздействии, однако у больных БА величина относительного прироста нейтрофилов в ответ на ИГХВ имела прямую взаимосвязь с исходными концентрациями ГЬ-1Ь ^=0,33, р=0,03), ЮТа (R=0,44, р=0,007) и ГЬ-8 (R=0,41, р=0,006).
Изучение цитокинов в условиях in vivo является достаточно сложной задачей. Учитывая большое количество различных клеток, секретирующих цитокины, многообразие представителей данного класса сигнальных молекул, а также наличие тесных функциональных взаимосвязей между ними, необходимо рассматривать состояние и реакции не отдельных представителей, а цитокиновой сети в целом. Очевидно, что эффекты цитокинов в значительной степени зависят от молекулярного контекста, общего фона воспалительной реакции, а поскольку точная характеристика данного фона возможна лишь с применением современных методов транскриптомики и протеомики, к интерпретации результатов, полученных в ходе настоящей работы, необходимо подходить с определенной осторожностью.
Среди всех исследованных цитокинов, в аспекте негативного влияния на функцию легких и гиперреактивность дыхательных путей наше внимание привлек IL-10. IL-10 - цитокин, экспрессируемый практически всеми лейкоцитами, преимущественно моноцитами,
макрофагами, дендритными клетками, T-хелперами, но также Treg клетками, B лимфоцитами, NK и цитоток-сическими T клетками, тучными клетками, нейтрофи-лами и эозинофилами [7]. Помимо лейкоцитов, эпителиальные клетки респираторного тракта также способны секретировать IL-10 [3]. Наиболее заметный эффект IL-10 заключается в подавлении функциональной активности антигенпрезентирующих клеток, благодаря чему предотвращается Th1 поляризация иммунного ответа и синтез соответствующих цитоки-нов. При этом в том же эксперименте IL-10 не нарушал способности антигенпрезентирующих клеток стимулировать продукцию Th2 цитокинов [5]. Однако в более поздних работах была показана возможность не только опосредованного, но и прямого влияния IL-10 на Treg, Th17 и Th2 лимфоциты, за счет экспрессии на них IL10R рецепторов. В частности установлено, что IL-10 способствует выработке гранзима B в Th2 клетках, что негативным образом отражается на их выживаемости [4]. Таким образом, согласно приведенным данным, полученным преимущественно in vitro и в экспериментах на лабораторных животных, IL-10 действительно является противовоспалительным цитокином, подавляющим функцию антигенпрезенти-рующих клеток и T лифоцитов, независимо от подтипа. Тем не менее, исследования, выполненные на больных БА, отличаются противоречивостью и не всегда соответствуют экспериментальным данным. Часть исследователей отмечает, что уровень IL-10 снижен в различных биологических пробах у больных БА, по сравнению со здоровым контролем. Так, снижение IL-10 было найдено в сыворотке больных БА [13], а также в бронхоальвеолярном лаваже детей, страдающих тяжелой резистентной к терапии БА [6]. В то же время, другими авторами было обнаружено увеличение концентрации IL-10 в плазме крови больных БА, по сравнению со здоровыми лицами [16].
Мы не нашли различий в концентрации IL-10 в индуцированной мокроте больных БА и ХНБ, однако IL-10 был заметно взаимосвязан с концентрацией других противовоспалительных цитокинов, прежде всего, IL-13, и демонстрировал наиболее существенные ассоциации с исходными показателями бронхиальной обструкции и реактивностью бронхов в ответ на брон-холитик и холодовое воздействие. Интересно, что сделанные нами наблюдения косвенно подтверждаются экспериментальными данными - у животных, нокаут-ных по гену IL-10, при сенсибилизации овальбумином гиперреактивность дыхательных путей не развивалась, тогда как восстановление экспрессии IL-10 сопровождалось появлением гиперреактивности. Кроме того, нокаут IL-10 в среднем на 20% снижал количество эозинофилов в бронхоальвеолярном лаваже, однако не влиял на уровень IL-4, IL-5, IL-13 и IFNg [10].
В ответ на охлаждение у больных БА преимущественно происходило увеличение уровней IL-5 и IL-1b, а при ХНБ концентрации данных медиаторов и прочих цитокинов, напротив, снижались. При этом ответ по IL-5 значимо отличался в зависимости от диагноза. Как
известно, IL-5 является цитокином, продуцируемым Th2 лимфоцитами, тучными клетками, ILC2 и NK клетками, а также эозинофилами, и играющим важную роль в росте, дифференцировке, миграции и активации последних [8]. Таким образом, холодовое воздействие теоретически способно стимулировать эозинофильное воспаление дыхательных путей, что подтверждается данными А.Б.Пирогова и соавт. [1]. IL-1b - один из основных цитокинов, вовлеченных в индукцию и поддержание воспаления. В респираторном тракте его основным источником являются макрофаги и моноциты, хотя он продуцируется и другими клетками, включая бронхиальный и альвеолярный эпителий, фибробласты, T лимфоциты и нейтрофилы [9]. В отличие от IL-5, эффект IL-1b может быть направлен на многие клетки, и, как правило, сопровождается их активацией. Так, в эпителии и эндотелии IL-1b индуцирует экспрессию IL-6, IL-8, TNFa и молекул адгезии. Кроме того, он может способствовать активации тучных клеток и секреции Th2 цитокинов [12]. Таким образом, увеличение уровня IL1b может способствовать общему нарастанию воспалительной инфильтрации дыхательных путей лейкоцитами различных типов.
С учетом полученных результатов, дальнейшие исследования могут быть направлены на функциональную характеристику роли катионных каналов TRPM8 в индукции цитокинового ответа при охлаждении in vivo, уточнение механизма формирования гиперреактивности дыхательных путей с участием IL-10, а также оценку модулирующих эффектов базисной терапии БА на особенности динамики цитокинового профиля при холодовом воздействии.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 16-3460189 моладк.
ЛИТЕРАТУРА
1. Пирогов А.Б., Приходько А.Г., Перельман Ю.М., Ушакова Е.В. Комплексная характеристика эозино-фильного звена воспаления у больных бронхиальной астмой при холод-индуцированном бронхоспазме // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2019. Вып.71. С.8-15. doi: 10.12737/article_5c88b467dfc6f9. 85091704
2. Щеглова М.Ю., Чжоу С.Д., Колосов В.П. Характеристика холодовой гиперреактивности дыхательных путей с клинико-иммунологических позиций // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2011. Вып.42. С.13-17.
3. Bonfield T.L., Konstan M.W., Burfeind P., Panuska J.R., Hilliard J.B., Berger M. Normal bronchial epithelial cells constitutively produce the anti-inflammatory cytokine interleukin-10, which is downregulated in cystic fibrosis // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1995. Vol.13, №3. P.257-261.
4. Coomes S.M., Kannan Y., Pelly V.S., Entwistle L.J., Guidi R., Perez-Lloret J., Nikolov N., Müller W., Wilson M.S. CD4+ Th2 cells are directly regulated by IL-10 during allergic airway inflammation // Mucosal Immunol.
2017. Vol.10, №1. P. 150-161. doi: 10.1038/mi.2016.47
5. Fiorentino D.F., Zlotnik A., Vieira P., Mosmann T.R., Howard M., Moore K.W., O'Garra A. IL-10 acts on the antigen-presenting cell to inhibit cytokine production by Th1 cells // J. Immunol. 1991. Vol.146, №10. P.3444-3451.
6. Gupta A., Dimeloe S., Richards D.F., Chambers E.S., Black C., Urry Z., Ryanna K., Xystrakis E., Bush A., Sa-glani S., Hawrylowicz C.M. Defective IL-10 expression and in vitro steroid-induced IL-17A in paediatric severe therapy-resistant asthma // Thorax. 2014. Vol.69, №6. P.508-515. doi: 10.1136/thoraxjnI-2013-203421
7. Iyer S.S., Cheng G. Role of interleukin 10 transcrip-tional regulation in inflammation and autoimmune disease // Crit. Rev. Immunol. 2012. Vol.32, №1. P.23-63.
8. Kita H. Eosinophils: multifaceted biological properties and roles in health and disease // Immunol. Rev. 2011. Vol.242, №1. P.161-177. doi: 10.1111/j.1600-065X. 2011.01026.x
9. Lappalainen U., Whitsett J.A., Wert S.E., Tichelaar J.W., Bry K. Interleukin-1beta causes pulmonary inflammation, emphysema, and airway remodeling in the adult murine lung // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2005. Vol.32, №4. P.311-318.
10. Makela M.J., Kanehiro A., Borish L., Dakhama A., Loader J., Joetham A., Xing Z., Jordana M., Larsen G.L., Gelfand E.W. IL-10 is necessary for the expression of airway hyperresponsiveness but not pulmonary inflammation after allergic sensitization // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. Vol.97, №11. P.6007-6012.
11. Moreira A., Delgado L., Palmares C., Lopes C., Jacinto T., Rytila P., Silva J.A., Castel-Branco M.G., Haahtela T. Competitive swimmers with allergic asthma show a mixed type of airway inflammation // Eur. Respir. J. 2008. Vol.31, №5. P.1139-1141. doi: 10.1183/09031936. 00175207
12. Nambu A., Nakae S. IL-1 and Allergy // Allergol. Int. 2010. Vol.59, №2. P.125-135. doi: 10.2332/allergolint. 10-RAI-0190
13. Raeiszadeh Jahromi S., Mahesh P. A., Jayaraj B.S., Madhunapantula S.R., Holla A.D., Vishweswaraiah S., Ra-machandra N.B. Serum levels of IL-10, IL-17F and IL-33 in patients with asthma: a case-control study // J. Asthma. 2014. Vol.51, №10. P. 1004-1013. doi: 10.3109/02770903. 2014.938353
14. Sabnis A.S., Reilly C.A., Veranth J.M., Yost G.S. Increased transcription of cytokine genes in human lung epithelial cells through activation of a TRPM8 variant by cold temperatures // Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2008. Vol.295, №1. P.L194-200. doi: 10.1152/ajplung. 00072.2008
15. Wenzel S.E. Asthma phenotypes: the evolution from clinical to molecular approaches // Nat. Med. 2012. Vol.18, №5. P.716-725. doi: 10.1038/nm.2678
16. Wong C.K., Ho C.Y., Ko F. W., Chan C.H., Ho A.S., Hui D.S., Lam C.W. Proinflammatory cytokines (IL-17, IL-6, IL-18 and IL-12) and Th cytokines (IFN-gamma, IL-4, IL-10 and IL-13) in patients with allergic asthma // Clin. Exp. Immunol. 2001. Vol.125, №2. P.177-183.
REFERENCES
1. Pirogov A.B, Prikhodko A.G., Perelman J.M., Usha-kova E.V. The complex characteristic of eosinophil level of inflammation in patients with asthma in the cold-induced bronchospasm. Bûlleten'fiziologii ipatologii dyha-niâ 2019; 71:8-15 (in Russian). doi: 10.12737/article_5c88b467dfc6f9.85091704
2. Shcheglova M.Yu., Zhou X.D., Kolosov VP. Characteristic of cold airway hyperresponsiveness from clinical and immunological positions. Bûlleten'fiziologii ipatologii dyhaniâ 2011; 42:13-17 (in Russian).
3. Bonfield T.L., Konstan M.W., Burfeind P., Panuska J.R., Hilliard J.B., Berger M. Normal bronchial epithelial cells constitutively produce the anti-inflammatory cytokine interleukin-10, which is downregulated in cystic fibrosis. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1995; 13(3):257-261.
4. Coomes S.M., Kannan Y., Pelly V.S., Entwistle L.J., Guidi R., Perez-Lloret J., Nikolov N., Müller W., Wilson M.S. CD4+ Th2 cells are directly regulated by IL-10 during allergic airway inflammation. Mucosal Immunol. 2017; 10(1): 150-161. doi: 10.1038/mi.2016.47
5. Fiorentino D.F., Zlotnik A., Vieira P., Mosmann T.R., Howard M., Moore K.W., O'Garra A. IL-10 acts on the antigen-presenting cell to inhibit cytokine production by Th1 cells. J. Immunol. 1991; 146(10):3444-3451.
6. Gupta A., Dimeloe S., Richards D.F., Chambers E.S., Black C., Urry Z., Ryanna K., Xystrakis E., Bush A., Sa-glani S., Hawrylowicz C.M. Defective IL-10 expression and in vitro steroid-induced IL-17A in paediatric severe therapy-resistant asthma. Thorax 2014; 69(6):508-515. doi: 10.1136/thoraxj nl-2013-203421
7. Iyer S.S., Cheng G. Role of interleukin 10 transcrip-tional regulation in inflammation and autoimmune disease. Crit. Rev. Immunol. 2012; 32(1):23-63.
8. Kita H. Eosinophils: multifaceted biological properties and roles in health and disease. Immunol. Rev. 2011; 242(1): 161-177. doi: 10.1111/j.1600-065X.2011.01026.x
9. Lappalainen U., Whitsett J.A., Wert S.E., Tichelaar J.W., Bry K. Interleukin-1beta causes pulmonary inflammation, emphysema, and airway remodeling in the adult murine lung. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2005; 32(4):311-318.
10. Mäkelä M.J., Kanehiro A., Borish L., Dakhama A., Loader J., Joetham A., Xing Z., Jordana M., Larsen G.L., Gelfand E.W. IL-10 is necessary for the expression of airway hyperresponsiveness but not pulmonary inflammation after allergic sensitization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000; 97(11):6007-6012.
11. Moreira A., Delgado L., Palmares C., Lopes C., Jacinto T., Rytilä P., Silva J.A., Castel-Branco M.G., Haahtela T. Competitive swimmers with allergic asthma show a mixed type of airway inflammation. Eur. Respir. J. 2008; 31(5):1139-1141. doi: 10.1183/09031936.00175207
12. Nambu A., Nakae S. IL-1 and Allergy. Allergol. Int. 2010; 59(2):125-135. doi: 10.2332/allergolint.10-RAI-0190
13. Raeiszadeh Jahromi S., Mahesh P.A., Jayaraj B.S., Madhunapantula S.R., Holla A.D., Vishweswaraiah S., Ra-machandra N.B. Serum levels of IL-10, IL-17F and IL-33
15. Wenzel S.E. Asthma phenotypes: the evolution from clinical to molecular approaches. Nat. Med. 2012; 18(5):716-725. doi: 10.1038/nm.2678
16. Wong C.K., Ho C.Y., Ko F. W., Chan C.H., Ho A.S., Hui D.S., Lam C.W. Proinflammatory cytokines (IL-17, IL-6, IL-18 and IL-12) and Th cytokines (IFN-gamma, IL-4, IL-10 and IL-13) in patients with allergic asthma. Clin. Exp. Immunol. 2001; 125(2):177-183.
Поступила 07.05.2019
Контактная информация Денис Евгеньевич Наумов, кандидат медицинских наук, заведующий лабораторией молекулярных и трансляционных исследований, Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания,
675000, г. Благовещенск, ул. Калинина, 22.
E-mail: [email protected] Correspondence should be addressed to Denis E. Naumov
MD, PhD, Head of the Laboratory of Molecular and Translational Research, Far Eastern Scientific Center of Physiology and Pathology of Respiration, 22 Kalinina Str., Blagoveshchensk, 675000, Russian Federation.
E-mail: [email protected]
in patients with asthma: a case-control study. J. Asthma 2014; 51(10):1004-1013. doi: 10.3109/02770903.2014. 938353
14. Sabnis A.S., Reilly C.A., Veranth J.M., Yost G.S. Increased transcription of cytokine genes in human lung epithelial cells through activation of a TRPM8 variant by cold temperatures. Am. J. Physiol. Lung CellMol. Physiol. 2008; 295(1):L194-200. doi: 10.1152/ajplung.00072.2008
