CC BY
21
: Особенности субпопуляционного состава мобилизованных Л стволовых кроветворных клеток у больных с опухолями з кроветворной системы и доноров: экспрессия антигенов
CD38, HLA-DR и С0143
CV CS
«V «V
м.л. канаева, и.в. Гальцева, Е.н. Иаровичникова, Ю.о. давыдова, т.в. Гапонова, Е.о. Грибанова, я.Б. Бальжанова, л.А. кузьмина, в.в. троицкая, с.к. кравченко, Е.Е. звонков, л.п. менделеева, в.Г. савченко
ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России; Россия, 125167Москва, Новый Зыковский проезд, 4
Контакты: Мадина Лечиевна Канаева [email protected]
Цель исследования — изучение особенностей субпопуляционного состава пула мобилизованных стволовых кроветворных клеток в периферической крови (ПК) и лейкоконцентратах (ЛК) у взрослых больных с онкогематологической патологией и доноров. Материалы и методы. Экспрессию CD38, HLA-DR и CD143 (ангиотензинпревращающий фермент) определяли в клетках CD34+CD45low ПК и ЛКу 80 больных гемобластозами. В контрольную группу включены 10 образцов ПК и 14 образцов ЛК здоровых доноров. Исследование ПК проводили до мобилизации стволовых кроветворных клеток (СКК) и в день лейкафереза до процедуры сбора СКК. Образцы ЛК исследовали в 1-й день сбора СКК.
Результаты. Показано, что CD143 экспрессируется на клетках CD34+CD45low как перед мобилизацией, так и после нее у всех пациентов и доноров, но количество клеток CD34+CD45lowCD143+различалось в зависимости от диагноза и режимов мобилизации. Экспрессия CD143+ на клетках CD34+CD45low была статистически значимо больше у больных, которым применяли режимы, сочетающие химиотерапию и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, чем у доноров и больных множественной миеломой, у которых использовали гранулоцитарный колониестимулирующий фактор в монорежиме. Наряду с повышением содержания клеток CD34+CD45low после стимуляции кроветворения увеличивалось количество клеток CD34+CD45lowCD143+. Показано, что среди мобилизованных СКК практически отсутствует фракция ранних клеток-предшественниц CD34+CD45low, не экспрессирующая CD38, HLA-DR. Перед стимуляцией кроветворения среди клеток крови CD34+CD45low преобладают фракции клеток CD38+HLA-DR -, тогда как после мобилизации увеличилось содержание клеток CD38- HLA-DR+. Не установлены различия между содержанием клеток CD34+CD45lowCD143+ у больных множественной миеломой в зависимости от статуса заболевания, пола, возраста и количества курсов химиотерапии, предшествующих мобилизации СКК.
Заключение. Выявлена экспрессия ангиотензинпревращающего фермента на клетках CD34+ в ПК до и после мобилизации СКК и в ЛК. Количество этих клеток различалось в зависимости от диагноза и режимов мобилизации.
Ключевые слова: стволовые кроветворные клетки, субпопуляция, экспрессия CD34, CD38, HLA-DR, ангиотензинпревращающий фермент (CD143)
Для цитирования: Канаева М.Л., Гальцева И.В., Паровичникова Е.Н. и др. Особенности субпопуляционного состава мобилизованных стволовых кроветворных клеток у больных с опухолями кроветворной системы и доноров: экспрессия антигенов CD38, HLA-DR и CD143. Онкогематология 2019;14(2):48-58.
DOI: 10.17650/1818-8346-2019-14-2-48-58
subpopulations of mobilized hematopoietic stem cells in patients with hematological malignances and donors: expression
of cD38, HLA-DR and cD143
M.L. Kanaeva, I.V. Galtseva, E.N. Parovichnikova, Yu.O. Davydova, T.V. Gaponova, E.O. Gribanova, Ya.B. Balzhanova, L.A. Kuzmina, V.V. Troitskaya, S.K. Kravchenko, E.E. Zvonkov, L.P. Mendeleeva, V.G. Savchenko
National Research Center for Hematology, Ministry of Health of Russia; 4 Novyy Zykovskiy Proezd, Moscow 125167, Russia
The study objective is to investigate the features of subpopulational composition of mobilized hematopoietic stem cells in peripheral blood (PB) and leukocyte concentrates (LC) in adult patients with oncohematological pathology and donors.
Materials and methods. In 80 patients with hemoblastoses, expression of CD38, HLA-DR and CD143 (angiotensin-converting enzyme) was measured in PB and LC CD34+CD45low cells. The control group included 10 PB and 14 LC samples from healthy donors. Analysis of PB was performed prior to mobilization of hematopoietic stem cells (HSC) and on the day of leukapheresis prior to HSC collection. LC samples were examined at day 1 after HSC collection.
Results. CD143 is expressed on CD34+CD45low cells both prior to mobilization and after it in all patients and donors, but CD34+CD45lowCD143+ cell counts varied depending on diagnosis and mobilization regimen. CD143+ expression on CD34+CD45low cells was significantly higher in patients who received combination of chemotherapy and granulocyte colony-stimulating factor compared to donors and patients with multi-
ple myeloma who received only granulocyte colony-stimulating factor. Along with elevated CD34+CD45low cell count after hematopoiesis stimulation, CD34+CD45lowCD143+ cell counts also increased. It was shown that mobilized HSC almost completely lacks a fraction of early CD34+CD45owprogenitor cells not expressing CD38, HLA-DR. Prior to hematopoiesis stimulation among CD34+CD45low cells, CD38+HLA-DR- cellfractions are prevalent, but after mobilization CD38HLA-DR+ cell counts increased. No differences between CD34+CD45lowCD143+ cell counts in patients with multiple myeloma depending on disease status, sex, age or number of chemotherapy courses prior to HSC mobilization were observed.
Conclusion. Expression of angiotensin-converting enzyme on CD34+ cells in PB before and after HSC mobilization and in LC was observed. The cell counts varied depending on diagnosis and mobilization regimen.
Key words: hematopoietic stem cells, subpopulation, CD34, CD38, HLA-DR expression, angiotensin-converting enzyme (CD143)
For citation: Kanaeva M.L., Galtseva I.V., Parovichnikova E.N. et al. Subpopulations of mobilized hematopoietic stem cells in patients with hematological malignances and donors: expression of CD38, HLA-DR and CD143. Onkogematologiya = Oncohematology 2019;14(2):48-58.
cv cv
CS
Введение
Начало исследованиям по изучению иммунофе-нотипического профиля стволовых кроветворных клеток (СКК) было положено с момента открытия и подробного описания антигена CD34 [1], который является общим маркером СКК всех этапов диффе-ренцировки: от ранних до унипотентных. Количество клеток CD34+ в периферической крови (ПК) отражает эффект мобилизации СКК и считается наиболее точным критерием эффективности проведения процедуры сбора мобилизованных периферических стволовых клеток в целях дальнейшей трансплантации [2].
Независимо от плотности экспрессии CD34 на мембране клеток-предшественниц, именно суммарный пул клеток CD34+ определяет сроки восстановления кроветворения после аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток [3]. В качестве минимальной дозы клеток CD34+, способных обеспечить восстановление гемопоэза после вы-сокодозной химиотерапии (ХТ), установлено 2 х 106 клеток на 1 кг массы тела больного [4].
Экспрессия общелейкоцитарного антигена CD45 характерна для всех гемопоэтических клеток, включая ранние, морфологически незрелые формы. Исключением являются зрелые эритроциты, тромбоциты и плазматические клетки [5]. Известно, что интенсивность экспрессии панлейкоцитарного антигена CD45 представлен на всех СКК по-разному, по мере диффе-ренцировки клеток его экспрессия нарастает от практически отрицательной до слабой, соответствующей уровню экспрессии антигена на гранулоцитах. В основу стандартных цитометрических протоколов для подсчета абсолютного количества стволовых гемопоэти-ческих клеток положена оценка клеток CD34+ в пределах популяции со слабой или очень слабой экспрессией CD45 [6].
На основании экспрессии ряда антигенов на мембране клеток CD34+ можно судить о субпопуляцион-ном составе СКК, т. е. о присутствии среди них поли-потентных и линейно коммитированных клеток. Не существует однозначных маркеров для оценки ранних СКК. Для определения этой малой клеточной субпопуляции было использовано сочетание
антигенов CD38 и HLA-DR. Отсутствие экспрессии CD38 и HLA-DR на популяции клеток CD34+ характеризует субпопуляцию наиболее ранних кроветворных клеток с неограниченным потенциалом пролиферации и дифференцировки. При снижении плотности антигена CD34 отмечается увеличение плотности антигена CD38 [7—9]. Наряду с этим большинство клеток популяции CD34+CD38- является HLA-DR+ и, напротив, большинство клеток CD34+HLA-DR- экс-прессирует антиген CD38. Функционально данные популяции СКК также являются различными. Клетки CD34+CD38HLA-DR+ демонстрируют свойства истинно СКК с высоким потенциалом пролиферации и дифференцировки.
В настоящее время активно исследуется влияние ренин-ангиотензиновой системы на пролифератив-ную активность клеток костного мозга. Ангиотензин-превращающий фермент (АПФ) CD143 играет ключевую роль в классической ренин-ангиотензиновой системе, в которой ренин запускает продукцию ангио-тензина I из ангиотензиногена, а затем АПФ расщепляет ангиотензин I до ангиотензина II [10]. При оценке методом полимеразной цепной реакции АПФ был обнаружен во всех протестированных 72 тканях человеческого организма с самой высокой распространенностью в эндотелии [11]. V.J. Jokubaitis и соавт. в 2008 г. подтвердили, что АПФ экспрессиру-ется на человеческих эмбриональных клетках и клетках взрослых гемопоэтических органов, включая аорту, печень плода и пуповинную кровь. В человеческом организме до формирования СКК и сосудистой стенки аорты на некоторых клетках эмбриона CD34 -CD45- обнаружена экспрессия АПФ. Также в результате трансплантации мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (NOD/ SCID) было продемонстрировано, что печеночные и костномозговые клетки-предшественницы, экспрессирующие CD34+CD143+, обладают более длительным пролифе-ративным потенциалом в отличие от клеток CD34+, не экпрессирующих CD143 [12].
В ряде случаев трансплантация адекватного количества клеток CD34+ не приводит к полноценному трехростковому восстановлению кроветворения.
CV CV
сч сч
ев
сч cv
Иногда после восстановления гемопоэза отмечаются повторные отсроченные цитопении, приводящие к серьезным инфекционным осложнениям. Примерно 10 % случаев трансплантаций сопровождается длительными тромбоцитопениями (30 дней и более) [13].
При более детальном изучении субпопуляционно-го состава трансплантируемых мобилизованных СКК, возможно, удастся ответить на ряд вопросов, касающихся посттрансплантационного восстановления кроветворения.
Цель исследования — изучение особенностей суб-популяционного состава пула мобилизованных СКК в ПК и лейкоконцентратах (ЛК) у взрослых больных с онкогематологической патологией и доноров.
Материалы и методы
Исследование субпопуляций СКК проведено в ПК и ЛК у 80 больных гемобластозами. В исследование были включены 53 больных множественной миеломой (ММ) в возрасте 19—67 лет (медиана 54 года), 20 больных лимфомой Ходжкина и неходжскин-скими лимфомами в возрасте 19—67 лет (медиана 43 года), 7 больных острым Т-лимфобластным лейкозом (Т-ОЛЛ) в возрасте 19—62 лет (медиана 34 года). В контрольную группу вошли 24 здоровых донора. Изучили 14 образцов ЛК доноров для неродственной аллогенной трансплантации и 10 образцов ПК добровольцев. Мобилизацию и сбор СКК всем больным проводили в НМИЦ гематологии.
Перед сборами СКК пациентам проводили курс стимуляции кроветворения. В большинстве случаев использовали сочетание ХТ с последующим введением ростовых факторов кроветворения в дозировке 5—10 мкг на 1 кг массы тела больного. Во всех случаях для мобилизации СКК был использован гранулоци-тарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ). Введение препарата продолжали в течение 3—12 дней до завершения сбора СКК. Перед процедурой лейка-фереза определяли количество клеток CD34+, циркулирующих в ПК, и при содержании 10 клеток CD34+ и более в 1 мкл выполняли сбор СКК. Проводили от 1 до 5 сеансов лейкафереза в зависимости от эффективности стимуляции кроветворения и мобилизации СКК. Количество собранных за все процедуры лей-кафереза клеток CD34+ варьировало от 0,7 х 106 до 33,5 х 106 на 1 кг массы тела, в среднем — (7,99 ± 0,64) х 106 на 1 кг массы тела.
Химиотерапевтические режимы, предшествующие введению ростовых факторов, различались в зависимости от диагноза больного. При мобилизации СКК у 40 больных ММ использовали циклофосфамид в дозе 4 мг/м2 с последующим введением Г-КСФ, у 9 больных СКК были мобилизованы с помощью Г-КСФ в монорежиме (в эту группу вошли больные ММ с почечной недостаточностью), 4 пациентам проводили различные курсы ХТ с последующим введением Г-КСФ. Всем пациентам с Т-ОЛЛ
мобилизацию СКК проводили с помощью Г-КСФ, на фоне предшествующей терапии по протоколу 0ЛЛ-2009 после курса консолидации III или IV на не сниженных показателях ПК. При лимфоме Ходжкина использовали схемы R-DHAP (ритукси-маб, дексаметазон, высокодозный цитарабин, ци-сплатин) и циклофосфамид. При неходжскинских лимфомах у большинства больных применяли протокольный режим ХТ, включающий комбинацию нескольких химиопрепаратов (циклофосфамид, DHAP, R-DHAP, R-DA-EPOCH, R-NHL-BFM-90, TL-REZ, R-HMA) с последующим введением Г-КСФ.
Варианты мобилизации и сбора образцов представлены на рис. 1.
Среднее количество курсов ХТ до момента сбора СКК у больных ММ составило 8 (3—16), у больных лимфомами — 6 (1—9), у больных Т-ОЛЛ — 6 (5—6).
На момент начала лейкафереза у большинства больных был достигнут положительный ответ на проведенную терапию. Клинико-диагностическая характеристика больных представлена в табл. 1.
Образцы ПК больных исследовали до мобилизации, перед введением химиопрепаратов и/или Г-КСФ и в день лейкафереза до процедуры сбора СКК. Образцы ЛК исследовали в 1-й день сбора СКК. Анализировали следующие субпопуляции СКК: CD34+CD45lowCD38 - HLA-DR - , CD34+CD45lowCD38-HLA-DR+, CD34+CD45lowCD38+HLA-DR-, CD34+CD45lowCD38+HLA-DR+, CD34+CD45lowCD143+. Суммарно выполнено 252 исследования ПК и ЛК.
ХТ / CT „ Снижение Le-клеток / V Decreased Le-cells
С момента агранулоцитоза Г-КСФ
5 мг/кг/сут, 9-12 дней / Since agranulocytosis G-CSF 5 mg/kg/day, 9-12 days
1-й день лейкафереза / 1st day of leukapheresis
L.
5-10 дней / 5-10 days
10 клеток CD34+ и более на 1 мкл в ПК / 10 or more CD34+ cells per 1 ¡l of PB
С момента агранулоцитоза Г-КСФ _
5 мг/кг/сут, 4-6 дней / Since agranulocytosis деньлейкафереза ' ХТ / CT G-CSF5 mg/kg/day 4-6days 1dayof leukaPheress
Снижение Le-клеток / Decreased Le-cells
5-10 дней / 5-10 days
10 клеток CD34+ и более на 1 мкл в ПК / 10 or more CD34+ cells per 1 ¡.¡l of PB
Консолидация III-IV по протоколу _
0ЛЛ-2009 / Consolidation III-IV per Г-КСФ, 10 мг/кг/сут, 3-6 дней / 1 -и день лейкафереза / the ALL-2009 protocol G-CSF, 10 mg/kg/day, 3-6 days 1 day of leukapheresis
mw
10-20 клеток CD34+ на 1 мкл в ПК / 10-20 CD34+ cells per 1.l ofPB
рис. 1. Варианты мобилизации и сбора стволовых кроветворных клеток. ХТ — химиотерапия; Le — лейкоциты; Г-КСФ — гранулоци-тарный колониестимулирующий фактор; ПК — периферическая кровь; Т-ОЛЛ — острый Т-лимфобластный лейкоз
Fig. 1. Types of hematopoietic stem cell mobilization and collection. CT — chemotherapy; Le — leukocytes; G-CSF — granulocyte colony-stimulating factor; PB — peripheral blood; T-ALL — T-cell acute lymphoblastic leukemia
Таблица 1. Общая характеристика больных Table 1. Patient characteristics
Соотношение мужчин n и женщин
Множественная миелома Multiple myeloma
53
27/2б
Средний возраст (диапазон),
54 (35-б7)
Полная
пампгрия и
Очень хороший частичный ответ, n
Very good partial response, n
Частичная ремиссия, n
12
25
15
Прогрессия, рецидив, n
cv cv
es
Лимфома Ходжкина и неходжскинские лимфомы Hodgkin's lymphoma and non-Hodgkin lymphomas
20
9/11
44,5 (22-б4)
12
Т-лимфобластный лейкоз T-cell acute lymphoblastic leukemia 7 4/3 33 (19-62) 7 - - -
cv cv
Определение экспрессии исследуемых популяций клеток проводили на проточном цитофлуориметре FACS Canto II (Beckton Dikinson, США) с использованием моноклональных антител к антигенам CD34 (8G12 - PE), CD45 (2D1 - FITC), CD38 (HIT2 -PerCP-Cy5.5), HLA-DR (L243 - PE-Cy7), CD143 (BB9 - APC) производства Beckton Dikinson (США). Перед окраской клеточной суспензии с помощью моноклональных антител клетки ПК и ЛК освобождали от эритроцитов методом лизиса и отмывки. Лизис проводили с помощью лизирующего раствора ParmLyse (Becton Dikinson, США) в течение 5-7 мин.
Статистический анализ данных проводили с помощью GraphPad Prism 6. Проверку нормальности распределения выполняли с использованием критерия Шапи-ро-Уилка. Данные представляли в виде среднего ± стандартная ошибка среднего. Для сравнения значений
доли субпопуляций СКК применяли критерий Краске-ла—Уоллиса (для ненормальных распределений). Для множественных сравнений использовали поправку Данна. Наличие корреляции субпопуляций стволовых клеток с возрастом, количеством предшествующих курсов ХТ оценивали с помощью расчета коэффициента Пирсона (для нормально распределенных величин) или Спир-мена (для ненормально распределенных величин).
Результаты
Нами было оценено количество клеток CD34+CD45low и CD34+CD45lowCD143+ в ПК перед мобилизацией и после нее и в ЛК у всех больных, включенных в исследование (табл. 2).
Больные ММ были разделены на 2 группы:
1-я группа с режимом мобилизации «ХТ + Г-КСФ»,
2-я — «Г-КСФ в монорежиме».
Таблица 2. Количество клеток CD34+CD45low и CD34+CD45lowCD143+ в периферической крови перед мобилизацией и после нее и в лейкоконцент-ратах у больных гемобластозами
Table 2. CD34+CD45low and CD34+CD45lowCD143+ cell counts in peripheral blood before and after mobilization and in leukocyte concentrates of patients with hemoblastoses
Периферическая кровь, %
Клетки Peripheral blood, % Лейкоконцентраты, %
cells перед мобилизацией после мобилизации Leukocyte concentrates, %
prior to mobilization
CD34+CD45low 0,04 i 0,01 0,65 ± 0,09* 1,40 i 0,18**
CD34+CDCD45lowCD143+ 10,44 i 1,21 45,70 ± 1,76* 45,52 i 1,85
*Наличие достоверных различий в периферической крови до мобилизации и после нее.
**Наличие достоверных различий в периферической крови после мобилизации и в лейкоконцентратах.
*Significant differences in peripheral blood before and after mobilization.
**Significant differences in peripheral blood after mobilization and in leukocyte concentrates.
1
3
5
Процент клеток CD34+ от клеток CD45+ в ПК до мобилизации / Percentage of CD34+ among CD45+ cells in PB prior to mobilization
Процент клеток CD143+ от клеток CD34+ в ПК до мобилизации / Percentage of CD143+ among CD34+ cells in PB prior to mobilization
cv cv
ев
cv cv
60
40
20
a
I
I «ДА I
0,0003
В ММ (Г-КСФ в монорежиме) / MM (G-CSFin monoregimen)
I-1 ММ (ХТ + Г-КСФ) / MM (CT + G-CSF)
I I Лимфомы / Lymphomas
Т-ОЛЛ / T-ALL [ .i Доноры / Donors
рис. 2. Количество клеток CD34+CD45lowCD143+ в периферической крови (ПК) до мобилизации стволовых кроветворных клеток у больных множественной миеломой (ММ), лимфомами, острым Т-лимфобласт-ным лейкозом (Т-ОЛЛ), доноров. Звездочками указано наличие достоверных различий между группами пациентов (*p <0,05; **p <0,01; ***p <0,001; ****p <0,0001). Г-КСФ — гранулоцитарныйколониестимулирующий фактор; ХТ — химиотерапия
fig. 2. CD34+CD45lowCD143+ cell counts in peripheral blood (PB) prior to mobilization of hematopoietic stem cells in patients with multiple myeloma (MM), lymphoma, T-cell acute lymphoblastic lymphoma (T-ALL), donors. Asterisks denote significant differences between the patient groups (*p <0.05;
**p <0.01; ***p <0.001; ****p <0.0001). G-CSF — granulocyte colony-stimulating factor; CT — chemotherapy
Выявлены достоверно значимые различия в количестве клеток CD34+CD45lowCD143+ у больных ММ в зависимости от режима мобилизации. У больных с режимом мобилизации «ХТ + Г-КСФ» количество клеток CD34+CD45lowCD143+ было больше, чем у больных с мобилизацией «Г-КСФ в монорежиме» в ПК перед мобилизацией (рис. 2).
В ПК перед мобилизацией не выявлено существенных различий в количестве клеток CD34+CD45low у больных ММ, лимфомами, Т-ОЛЛ и доноров (рис. 3). У больных Т-ОЛЛ количество клеток CD34+CD45low было незначительно больше, чем у других групп больных и доноров, однако статистически значимых различий не получено. Выявлены различия экспрессии АПФ на клетках CD34+CD45low. Количество клеток CD34+CD45lowCD143+ перед мобилизацией было достоверно больше у больных лимфомами, чем у больных ММ, Т-ОЛЛ и у доноров.
В образцах ПК перед мобилизацией не определено существенных различий в числе клеток CD34+CD45lowCD38+/-, CD34+CD45lowHLA-DR+/-у больных ММ, лимфомами, Т-ОЛЛ и у доноров.
В табл. 3 представлена динамика количества клеток CD34+CD45low и субпопуляций СКК в ПК перед
0,1
0,01
0,001
0,0001
4
0,2011
Н ММ (Г-КСФ в монорежиме) / MM (G-CSFin monoregimen)
□ ММ (ХТ + Г-КСФ) / MM (CT + G-CSF)
I Лимфомы / Lymphomas в Т-ОЛЛ / T-ALL _j Доноры / Donors
рис. 3. Количество клеток CD34+CD45bw в периферической крови (ПК) до мобилизации стволовых кроветворных клеток у больных множест -венной миеломой (ММ), лимфомами, острым Т-лимфобластным лейкозом (Т-ОЛЛ), доноров. Г-КСФ — гранулоцитарный колониестимули-рующий фактор; ХТ — химиотерапия
fig. 3. CD34+CD45low cell counts in peripheral blood (PB) prior to mobilization of hematopoietic stem cells in patients with multiple myeloma (MM), lymphoma, T-cell acute lymphoblastic lymphoma (T-ALL), donors. G-CSF — granulocyte colony-stimulating factor; CT — chemotherapy
мобилизацией и после нее и в ЛК у больных ММ, лимфомами, Т-ОЛЛ, доноров.
Количество клеток CD34+CD45low у больных ММ (ХТ + Г-КСФ) и лимфомами было статистически значимо меньше в ПК перед мобилизацией, чем в ПК после мобилизации, в отличие от больных ММ (Г-КСФ в монорежиме), Т-ОЛЛ и доноров. В ЛК содержание клеток CD34+CD45+ было статистически значимо больше, чем в ПК перед мобилизацией у больных ММ (ХТ + Г-КСФ), лимфомами и Т-ОЛЛ.
У всех больных и у доноров содержание клеток CD34+CD45lowCD143+ статистически значимо ниже в ПК перед мобилизацией, чем в ПК после мобилизации и в ЛК. Выявлены достоверные различия в количестве клеток CD34+CD45lowCD38+HLA-DR-перед мобилизацией и после нее у больных ММ (ХТ + Г-КСФ) и лимфомами. Так, содержание этих клеток статистически значимо больше в ПК перед мобилизацией, чем в ПК после мобилизации и в ЛК. Поскольку соотношение субпопуляций СКК (CD34+CD45lowCD38+/HLA-DR+/-, CD34+CD45lowCD143+/ ) в ПК после мобилизации и в ЛК было сопоставимым, дальнейшую оценку результатов проводили только в ЛК.
При исследовании СКК после мобилизации в ЛК выявлены различия в процентном содержании клеток CD34+CD45low у различных больных и доноров. Так, у доноров их количество составило 0,17 ± 0,08 %
***
*
Таблица 3. Динамика количества клеток CD34+CD45low и субпопуляций стволовых кроветворных клеток в периферической крови перед мобилизацией и после нее и в лейкоконцентратах у больных ММ, лимфомами, Т-ОЛЛ, доноров
Table 3. Dynamics of CD34+CD45low cell counts and hematopoietic stem cell subpopulations in peripheral blood before and after mobilization and in leukocyte concentrates in patients with MM, lymphomas, T-ALL, donors
Стволовые
кроветворные клетки,% Субпопуляции стволовых кроветворных клеток, %
Группа Материал исследова- Hematopoietic stem cell subpopulations, %
пациентов ния stem cell, %
Patients group Studied material 1
CD34+CD45low CD34+CD45low CD38 - HLA-DR- CD34+CD45low CD38 - HLA-DR+ CD34+CD45low CD38+HLA-DR - CD34+CD45low CD38+HLA-DR+ CD34+CD45low CD143+
_ ММ (ХТ + ПК перед мобилизацией PB before mobilization 0,03 ± 0,01* 0 0,02 ± 0,02 9,12 ± 1,2* 88,21 ± 2,38 10,25 ± 1,18*
Г-КСФ) MM (CT+G-CSF) ПК после мобилизации PB after mobilization 0,8 ± 0,15* 0 0,12 ± 0,04 2,63 ± 0,44* 97,08 ± 0,43 53,7 ± 1,62*
ЛК LC 1,47 ± 0,22** 0 0,2 ± 0,07 3,13 ± 0,7** 96,05 ± 0,92 53,11 ± 1,62**
ММ (Г-КСФ в монорежиме) MM (G-CSF monoregimen) ПК перед мобилизацией PB before mobilization 0,05 ± 0,03 0 0 5,22 ± 1,9 94,78 ± 1,9 1,57 ± 0,93*
ПК после мобилизации PB after mobilization 0,19 ± 0,1 0 0 4,59 ± 1,04 95,39 ± 1,05 28,53 ± 6,19*
ЛК LC 0,37 ± 0,15 0 0 3,17 ± 0,93 96,84 ± 0,3 23,1 ± 6,21**
ПК перед мобилизацией PB before mobilization 0,03 ± 0,01* 0,08 ± 0,04 0,47 ± 0,22 8,43 ± 1,14* 91,16 ± 1,17 8,65 ± 1,49*
Лимфомы Lymphomas ПК после мобилизации PB after mobilization 0,78 ± 0,22* 0,05 ± 0,02 0,84 ± 0,28 3,81 ± 0,94* 95,13 ± 0,97 39,6 ± 3,04*
ЛК LC 1,84 ± 0,46** 0,07 ± 0,03 0,73 ± 0,2 3,26 ± 0,67** 95,94 ± 0,78 41,5 ± 3,5**
ПК перед мобилизацией PB before mobilization 0,15 ± 0,07* 0 0 7,47 ± 2,01 92,4 ± 2,0 26,3 ± 5,67*
Т-ОЛЛ T-ALL ПК после мобилизации PB after mobilization 0,37 ± 0,13 0,09 ± 0,04 0,33 ± 0,15 4,13 ± 0,65 95,67 ± 0,68 39,8 ± 2,28*
ЛК LC 1,28 ± 0,07** 0,36 ± 0,22 0,33 ± 0,13 5,29 ± 1,41 94,03 ± 1,72 43,7 ± 3,29**
Доноры Donors ПК перед мобилизацией PB before mobilization 0,03 ± 0,01 0 0 7,23 ± 1,36 92,77 ± 1,36 6,13 ± 0,57*
ЛК LC 0,17 ± 0,08 0,11 ± 0,07 0,41 ± 0,23 10,92 ± 1,9 88,55 ± 1,94 20,4 ± 3,22**
*Наличие достоверных различий в периферической крови до мобилизации и после нее.
**Наличие достоверных различий в периферической крови перед мобилизацией и в лейкоконцентратах.
*Significant differences in peripheral blood before and after mobilization.
**Significant differences in peripheral blood before mobilization and leukocyte concentrates.
Примечание. ММ — множественная миелома; ХТ — химиотерапия; Г-КСФ — гранулоцитарный колониестимулирующий фактор; ПК — периферическая кровь; ЛК — лейкоконцентраты; Т-ОЛЛ — Т-лимфобластный лейкоз. Note. MM — multiple myeloma; CT — chemotherapy; G-CSF — granulocyte colony-stimulating factor; PB — peripheral blood; LC — leukocyte concentrate; T-ALL — T-cell acute lymphoblastic leukemia.
cv cv
CS
cv cv
Процент клеток CD34+ от клеток CD45+ в ЛК после мобилизации / Percentage ofCD34+ among CD45+ cells in LC after mobilization
cv cv
CS
cv cv
1
0,1 I
0,01 -.
i
<0,0001
lääSl ММ (Г-КСФ в монорежиме) / MM (G-CSFin monoregimen) H ММ (ХТ + Г-КСФ) / MM (CT+G- CSF) \ I Лимфомы / Lymphomas H Т-ОЛЛ / T-ALL I [ Доноры / Donors
Рис. 4. Количество клеток CD34+CD45low в лейкоконцентратах (ЛК) у больных множественной миеломой (ММ), лимфомами, острым Т-лимфобластным лейкозом (Т-ОЛЛ), доноров. Звездочками указано наличие достоверных различий между группами пациентов (*p <0,05;
**p <0,01; ***p <0,001; ****p <0,0001). ЛК — лейкоконцентраты; Г-КСФ — гранулоцитарный колониестимулирующий фактор; ХТ — химиотерапия
Fig. 4. CD34+CD45low cell counts in leukocyte concentrates (LC) in patients
with multiple myeloma (MM), lymphoma, T-cell acute lymphoblastic lymphoma (T-ALL), donors. Asterisks denote significant differences between the patient groups (*p <0.05; **p <0.01; ***p <0.001; ****p <0.0001). LC — leukocyte concentrates; G-CSF — granulocyte colony-stimulating factor; CT — chemotherapy
и было статистически значимо ниже, чем у больных лимфомами, Т-ОЛЛ, ММ (ХТ + Г-КСФ) - 1,84 ± 0,46; 1,28 ± 0,51 и 1,47 ± 0,22 % соответственно (p <0,05). Вероятно, эти различия обусловлены отсутствием у доноров цитостатического воздействия, предшествующего введению ростовых факторов. Достоверно значимых различий в содержании клеток CD34+CD45low у доноров и больных ММ с мобилизацией «Г-КСФ в монорежиме» не выявлено (рис. 4).
Количество клеток CD34+CD45lowCD143+ в ЛК было меньше у доноров и больных ММ с мобилизацией «Г-КСФ в монорежиме», чем у больных лимфомами, Т-ОЛЛ и ММ (ХТ + Г-КСФ) (p <0,005).
От 69,9 до 100 % мобилизованных стволовых клеток CD34+CD45low экспрессировали CD38, HLA-DR. Процент клеток CD38+HLA-DR- был статистически значимо больше в ПК до мобилизации СКК. После мобилизации увеличилось содержание CD38 HLA-DR+ (рис. 5).
Наиболее ранние клетки-предшественницы CD34+CD45low, не экспрессирующие CD38 и HLA-DR, практически не выявлялись до мобилизации СКК и после нее. В ЛК у 1 больного Т-ОЛЛ обнаружено 1,5 % клеток CD34+CD45lowCD38 - HLA-DR - .
Найдены различия в субпопуляции клеток CD34+CD45lowCD38-HLA-DR+ после мобилизации СКК в зависимости от диагноза. Так, содержание этой популяции клеток у больных лимфомами статистически достоверно больше, чем у больных ММ и Т-ОЛЛ (p <0,005).
Для выявления связи полноты ответа на терапию (полная ремиссия, очень хороший частичный ответ,
****
***
10
Процент клетокCD34+HLA-DR-от всех клетокCD34+/ Percentage of CD34+HLA-DR- among all CD34+ cells
40-
30-
20-
10
<0,0001
1Г
i f I
I-i До мобилизации / Prior to mobilization
. После мобилизации в периферической крови / After mobilization in peripheral blood
I- После мобилизации в лейкоконцентратах / After mobilization
in leukocyte concentrates
Процент клеток CD34HLA-DR+ от всех клеток CD34+ / Percentage of CD34-HLA-DR+ among all CD34+ cells
5 и
0,0002 1 ' 0,6589 '
[ j До мобилизации / Prior to mobilization
_ После мобилизации в периферической крови / After mobilization
— in peripheral blood
I-1 После мобилизации в лейкоконцентратах / After mobilization
in leukocyte concentrates
б
а
4
3
2
0
0
Рис. 5. Количество клеток CD34+CD45°wCD38+HLA-DRr (а) и CD34+CD45iowCD38-HLA-DR+ (б) до мобилизации и после нее у больных и доноров Fig. 5. CD34+CD45lcmCD38+HLA-DR— cell counts (а) and CD34+CD45lowCD38-HLA-DR+ cell counts (б) before and after mobilization in patients and donors
30
20
10
r = 0,14 P = 0,33
I •
-г-«-" -- -г-1-
5 10 15
Количество курсов ХТ/Number of CT courses
20
80
60
40
20
• * ш *
r = 0,08 p = 0,56
cv cv
ев
—г-т-г-
5 10 15
Количество курсов ХТ/Number of CT courses
-i
20
30
20
20
r = 0,17 P = 0,23
—г
40
60
Возраст, лет/Age, years
—1
80
80
60
40
20
r = 0,23 P = 0,1
cv cv
-
40
Возраст, лет/ Age, years
"I-
60
80
Рис. 6. Динамика количества клеток CD34+CD45lowCD143+ в периферической крови (ПК) до мобилизации (а, в) и в лейкоконцентратах (ЛК) (б, г) в зависимости от числа курсов химиотерапии (ХТ) и возраста у больных множественной миеломой
Fig. 6. Dynamics of CD34+CD45lowCD143+ cell counts in peripheral blood (PB) prior to mobilization (а, в) and in leukocyte concentrates (LC) (б, г) depending on the number of chemotherapy (CT) courses and age in patients with multiple myeloma
а
0
0
0
0
в
г
10
0
0
20
частичная ремиссия) с количеством клеток CD34+CD45low и CD34+CD45lowCD143+ была рассмотрена группа больных ММ. Число этих клеток в зависимости от полноты ответа достоверно не различалось как до мобилизации СКК, так и после нее. Также не выявлено статистически значимых различий содержания клеток CD34+CD45lowCD143+ у больных этой группы в зависимости от пола, возраста и количества курсов ХТ (рис. 6).
Обсуждение
Характеристика гемопоэтических клеток-предшественниц, которая необходима для выявления субпопуляций с наибольшим пролиферативным и диффе-ренцировочным потенциалом, является одним из современных направлений в исследовании СКК.
Имеется достаточный объем данных о влиянии отдельных популяций стволовых клеток на скорость восстановления того или иного ростка кроветворения. Тем не менее до сих пор четко не определено, какая субпопуляция циркулирующих гемопоэтических клеток-предшественниц является значимой для раннего
и/или позднего посттрансплантационного восстановления кроветворения.
Антиген CD34 экспрессируется на всех этапах дифференцировки СКК. Показано, что при достаточной морфологической однородности клетки CD34+ гетерогенны по функциональным свойствам и пролиферативной активности. Репопулирующая способность и потенциал пролиферации снижаются по мере дифференцировки клетки от истинно стволовой до унипотентной [6]. Наиболее ранние СКК с неограниченным потенциалом пролиферации и дифференцировки были обнаружены в популяции клеток CD34+CD38HLA-DR-, однако с учетом сложности их выделения многие исследователи изучали отдельно популяции CD34+CD38- и CD34+HLA-DR-[7-9, 14, 15].
Результаты исследований L. S. Rusten и соавт. показали, что субпопуляции клеток костного мозга как CD34+CD38-, так и CD34+HLA-DR- являются примитивными гемопоэтическими клетками-предшественницами. Причем фракция клеток CD34+CD38-содержит большее количество клеток ранних этапов
сч см
ев
сч сч
дифференцировки (популяция клеток, инициирующих рост долгосрочных клеточных культур костного мозга) с высоким потенциалом пролиферации, тогда как клетки CD34+HLA-DR- содержат более выраженное количество эритроидных предшественниц [16]. Было показано, что эмбриональные костномозговые предшественницы CD34+CD38-HLA-DR+ обладают свойствами истинно столовых кроветворных клеток и обеспечивают длительное и устойчивое восстановление как лимфоидных, так и миелоидных линий кроветворения, в отличие от популяции CD34+CD38+HLA-DR- [17, 18].
Поскольку клетки CD34+CD38-HLA-DR- являются наиболее ранней субпопуляцией СКК, следовательно, их пролиферация и дифференцировка требуют большего времени, чем пролиферация коммитирован-ных клеток-предшественниц.
Аналогично предыдущим исследованиям [19] в нашей работе практически не выявлена фракция клеток CD34+CD45low, не экспрессирующих CD38 и ^А^К Только у 1 больного количество клеток CD34+CD45lowCD38 - HLA-DR- было более 1 %. Однако показано, что до мобилизации и после нее меняется субпопуляционный состав СКК. После мобилизации преобладают клетки CD34+CD45lowCD38-HLA-DR+, т. е. с большим пролиферативным потенциалом, тогда как до мобилизации преобладают клетки CD34+CD45lowCD38+HLA-DR- Были выявлены различия в количестве клеток CD34+CD45lowCD38+HLA-DR-в зависимости от диагноза: описываемая популяция клеток была больше у пациентов с лимфомами, чем у пациентов с ММ и Т-ОЛЛ. Наиболее вероятным объяснением представляется отсутствие поражения костного мозга у большинства больных лимфомами, у 15 из 20 пациентов отсутствовало специфическое поражение костного мозга в дебюте заболевания.
Как уже было неоднократно ранее показано [20], статистически значимо большее количество клеток CD34+CD45low в ПК после мобилизации и в ЛК было у больных, которым применялись режимы, сочетающие ХТ и Г-КСФ.
В 1996 г. 1.С. Haznedaroglu и соавт. предположили, что в костном мозге есть локальная РАС, влияющая на рост, продукцию, пролиферацию и дифференци-ровку кроветворных клеток и участвующая в регуляции как нормального, так и патологического гемопо-эза [21]. Это участие РАС в регуляции кроветворения может осуществляться либо с помощью прямого воздействия на гемопоэтические стволовые клетки, либо через стимуляцию высвобождения факторов роста и цитокинов из стромальных клеток [22].
Компоненты РАС присутствуют даже в эмбриональном кроветворении. Изучение культур человеческих эмбриональных стволовых клеток показало,
что часть эндотелиальных и лимфогемопоэтических стволовых клеток с иммунофенотипом CD143+CD34+/ CD45- является гемангиобластами. После дифференцировки из гемангиобластов гемопоэтические клетки-предшественницы экспрессируют АПФ на всех стадиях гемопоэтического онтогенеза [23].
Нами была впервые изучена экспрессия АПФ на клетках CD34+CD45low в ПК перед мобилизацией СКК и после нее и в ЛК. Показано, что CD143 экс-прессируется на клетках CD34+CD45low до и после мобилизации у всех пациентов и доноров, но количество клеток CD34+CD45lowCD143+ различалось в зависимости от диагноза и режимов мобилизации. После стимуляции кроветворения количество клеток CD34+CD45lowCD143+ увеличивалось, наряду с повышением количества клеток CD34+, что может говорить об участии АПФ в пролиферации СКК.
Как количество клеток CD34+CD45+, так и экспрессия CD143+ на клетках CD34+CD45low были статистически значимо больше у больных, которым применяли режимы, сочетающие ХТ и Г-КСФ, чем у доноров и больных ММ с мобилизацией «Г-КСФ в монорежиме».
В нашем исследовании не выявлено корреляции статуса заболевания (полная ремиссия, очень хороший частичный ответ, частичная ремиссия) с количеством клеток CD34+CD45low и CD34+CD45lowCD143+ у больных ММ. Не установлены различия между количеством клеток CD34+CD45lowCD143+ у этой группы больных в зависимости от пола, возраста и числа курсов ХТ, предшествующих мобилизации СКК.
Заключение
Таким образом, показано увеличение содержания клеток CD34+CD45low, экспрессирующих АПФ (CD143) в ПК и ЛК у больных гемобластозами после мобилизации СКК. Подтверждено достоверно большее увеличение клеток CD34+CD45lowCD143+ у пациентов после мобилизации СКК с применением ХТ и Г-КСФ в отличие от мобилизации «Г-КСФ в монорежиме».
Среди мобилизованных СКК присутствует субпопуляция стволовых клеток с иммунофенотипом CD34+CD45lowCD38-HLA-DR+, т. е. популяция клеток ранних этапов дифференцировки с высоким потенциалом пролиферации. Наиболее ранние клетки CD34+CD45low, не экспрессирующие CD38, HLA-DR, практически не были выявлены как до мобилизации, так и после нее.
Дальнейшее изучение иммунофенотипа популяций гемопоэтических СКК и сопоставление с клиническими данными, темпами и полнотой восстановления кроветворения позволят оценить роль каждой отдельной субпопуляции при трансплантации СКК.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Civin C.I., Strauss L.C., Brovall C. et al. Antigenic analysis of hematopoiesis III. A hematopoietic progenitor cell surface antigen defined by a monoclonal antibody raised against KG-1a cells. J Immunol 1984;133(1):157-64.
2. Shpall E.J., Champlin R., Glaspy J.A. Effect of CD34+ peripheral blood progenitor cell dose on hematopoietic recovery. Biol Blood Marrow Transplant 1998;4(2): 84-92. DOI: 10.1053/bbmt.1998.v4.
3. Siena S., Bregni M., Brando B. et al. Circulation of CD34+ hematopoietic stem cells in the peripheral blood of high dose cyclophosphamide treated patients: enhancement by intravenous recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor. Blood 1989;74:1905-14.
4. Allan D.S., Keeney M., Howson-Jan K. et al. Number of viable CD34+ cells rein fused predicts engraftment in autologous hematopoietic stem cell transplantation. Bone Marrow Transpl 2002;29:967-72. DOI: 10.1038/sj.bmt.1703575.
5. Thomas M.L. The leukocyte common antigen family. Rev Immunol 1989;7:339-69. DOI: 10.1146/annurev.iy.07.040189.002011.
6. Allan D.S., Keeney M., Howson-Jan K. et al. Number of viable CD34+ cells rein-fused predicts engraftment in autologous hematopoietic stem cell transplantation. Bone Marrow Transpl 2002;29;967-72. DOI: 10.1038/sj.bmt.1703575.
7. Brandt J., Baird N., Lu L. et al. Characterization of a human hematopoietic progenitor cell capable of forming blast cell containing colonies in vitro. Clin Invest 1988;82(3):1017-23. DOI: org/10.1172/ JCI113658.
8. Issaad C., Croisille L., Katz A. et al.
A murine stromal cell line allows the proliferation of very primitive human CD34++/CD38- progenitor cells in long-term cultures and semisolid assays. Blood 1993;81(11):2916-24.
9. Srour E.F., Brandt J.E., Briddell R.A. et al. Human CD34' HLA-DR-bone marrow
cells contain progenitor cells capable of self-renewal, multilineage differentiation, and long-term in vitro hematopoiesis. Blood Cells 1991;17(2):287-95.
10. Paul M., Mehr A.P., Kreutz R. Physiology of local renin-angiotensin systems. Physiol 2006;86(3):787-803. DOI: 10.1152/phys-rev.00036.2005.
11. Harmer D., Gilbert M., Borman R., Clark K.L. Quantitative mRNA expression profiling of ACE 2, a novel homologue
of angiotensin converting enzyme. FEBS Lett 2002;532(1—2):107—10.
12. Jokubaitis V.J., Sinka L., Driessen R. et al. Angiotensin converting enzyme (CD143) marks hematopoietic stem cells in human embryonic, fetal and adult hematopoietic tissues. Blood 2008;111(8):4055-63. DOI: 10.1182/blood-2007-05-091710.
13. Dercksen M.W, Rodenhuis S., Dirkson M.K. et al. Subset of CD34+ cells and rapid he-matopoietic recovery after peripheral blood stem cell transplantation. J Clin Oncol 1995;13:1922-32. DOI: 10.1200/ JCO.1995.13.8.1922.
14. Brandt J., Briddell R.A., Srour E.F. et al. Role of c-kit ligand in the expansion
of human hematopoietic progenitor cells. Blood 1992;79:634-41.
15. Won E.J., Kim H.R., Park R.Y. et al. Direct confirmation of quiescence
of CD34+CD38- leukemia stem cell populations using single cell culture, their molecular signature and clinicopatholog-ical implications. BMC Cancer 2015;15:217-21. DOI: 10.1186/s12885-015-1233-x.
16. Rusten L.S. Functional differences between CD38- and DR- subfractions of CD34+ bone marrow cells. Blood 1994;84(5):1473-81.
17. Huang S., Terstappen L.W. Formation
of haematopoietic microenvironment and haematopoietic stem cells from single human bone marrow stem cells. Nature 1992;360(6406):745-9. DOI: 10.1038/360745a0.
18. Huang S., Terstappen L.W. Lymphoid and myeloid differentiation of single human CD34+, HLA-DR-, CD38-hematopoietic stem cells. Blood 1994;83(6):1515—26.
19. Гривцова Л.Ю., Тупицын H.H. Субпопуляции трансплантируемых стволовых кроветворных клеток. Современная онкология 2006;1:43-8. [Grivtso-va L.Yu., Tupitsyn N.N. Subpopulations of transplantable hematopoietic stem cells. Sovremennaya onkologiya = Contemporary Oncology 2006;1:43-8.
(In Russ.)].
20. Гальцева И.В., Давыдова Ю.О., Гапоно-ва Т.В. и др. Абсолютное количество гемопоэтических стволовых клеток CD34+ в периферической крови перед процедурой лейкафереза как параметр, прогнозирующий эффективность сбора стволовых клеток. Терапевтический архив 2017;89(7):18-24. DOI: 10.17116/ terarkh201789718-24. [Galtseva I.V., Davydova Yu.O., Gaponova T.V. et al. The absolute number of CD34+ hemato-poietic stem cells in the peripheral blood before the leukapheresis procedure as a parameter predicting the efficiency of stem cell collection. Terapevticheskiy arkhiv = Therapeutic Archives 2017;89(7):18-24. (In Russ.)].
21. Haznedaroglu I.C., Tuncer S., Gttrsoy M. A local renin-angiotensin system
in the bone marrow. Med Hypotheses 1996;46(6):507-10.
22. Hubert C., Savary K., Gasc J.M. et al. The hematopoietic system: a new niche for the renin-angiotensin system. Nat Clin Pract Cardiovasc Med 2006;3(2):80-5. DOI: 10.1038/ncpcardio0449.
23. Zambidis E.T., Park T.S., Yu W. et al. Expression of angiotensin-converting enzyme (CD143) identifies and regulates primitive hemangioblasts derived from human pluripotent stem cells. Blood 2008;112(9):3601-14. DOI: 10.1182/ blood-2008-03-144766.
cv cv
CS
«V «V
Вклад авторов
М.Л. Канаева: разработка концепции и дизайна исследования, написание текста статьи, сбор и анализ данных литературы;
И.В. Гальцева: интерпретация данных, участие в написании текста статьи;
Е.Н. Паровичникова: разработка концепции, участие в написании текста статьи;
Ю.О. Давыдова: анализ полученных данных;
Т.В. Гапонова, Е.О. Грибанова, Л.А. Кузьмина, В.В. Троицкая, С.К. Кравченко, Е.Е. Звонков, Л.П. Менделеева: предоставление материалов для исследования;
Я.Б. Бальжанова: обзор публикаций по теме статьи;
В.Г. Савченко: научное редактирование, утверждение статьи.
Authors' contributions
M.L. Kanaeva: article concept and design development, article writing, collection and analysis of literature data; I.V. Galtseva: interpretation of data, participation in the writing of the article; E.N. Parovichnikova: article design development, participation in the writing of the article; Yu.O. Davydova: analysis of the obtained data;
T.V. Gaponova, E.O. Gribanova, L.A. Kuzmina, V.V. Troitskaya, S.K. Kravchenko, E.E. Zvonkov, L.P. Mendeleeva: providing materials for research; Ya.B. Balzhanova: reviewing of publications on the article's topic; V.G. Savchenko: article editing, article approval.
CV CV
ев
ORCID авторов/ORCID of authors
М.Л. Канаева/M.L. Kanaeva: https://orcid.org/0000-0001-6840-6152
И.В. Гальцева/I.V. Galtseva: https://orcid.org/0000-0002-8490-6066
Е.Н. Паровичникова/E.N. Parovichnikova: https://orcid.org/0000-0001-6177-3566
Ю.О. Давыдова/Yu.O. Davydova: https://orcid.org/0000-0001-5932-0285
Т.В. Гапонова/T.V. Gaponova: https://orcid.org/0000-0002-9684-5045
Е.О. Грибанова/E.O. Gribanova: https://orcid.org/0000-0002-4155-7820
Я.Б. Бальжанова/Ya.B. Balzhanova: https://orcid.org/0000-0001-8973-9407
Л.А. Кузьмина/L.A. Kuzmina: https://orcid.org/0000-0001-6201-6276
B.В. Троицкая/v.v. Troitskaya: https://orcid.org/0000-0002-4827-8947
C.К. Кравченко/S.K. Kravchenko: https://orcid.org/0000-0002-7721-2074 Е.Е. Звонков/E.E. Zvonkov: https://orcid.org/0000-0002-4223-2366
Л.П. Менделеева/L.P. Mendeleeva: https://orcid.org/0000-0002-4966-8146 В.Г. Савченко/V.G. Savchenko: https://orcid.org/0000-0001-8188-5557
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Исследование проведено без спонсорской поддержки. Financing. The study was performed without external funding.
Информированное согласие. Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании. Informed consent. All patients gave written informed consent to participate in the study.
cv cv
Статья поступила: 20.12.2018. Принята к публикации: 24.04.2019. Article received: 20.12.2018. Accepted for publication: 24.04.2019.
