CC BY
38
УДК 612.017.1:616.155.32:616.24-006.6-097
A.A. Savchenko1, P. V Lapeshin2, Yu.A. Dychno2
IMMUNE STATUS AND BLOOD LYMPHOCYTES METABOLIC ENZYME ACTIVITY ACCORDING TO LUNG CANCER STAGE
'State Enterprise Research Institute of North Medical Problems of Siberian Department of RAMS
2Krasnoyarsk State Medical Academy
ABSTRACT
96 males with lung cancer were examined to study immune status and lymphocytes metabolic enzymes activity according to lung cancer stage. Phenotypic composition of blood lymphocytes was tested by immune fluorescent method. Immune globulins concentration was tested by immune diffusion in gel method. Oxide reductase activity in lymphocytes was tested by bioluminescent method. It was revealed that patients with lung cancer I stage have disturbances in cell and humeral compartments of immune system. T dependent immune deficiency, combined with Ig A and Ig G plasma concentration changes developed in patients with lung cancer II stage and further stages. In patients with lung cancer I stage lymphocytes metabolism is characterized by depression of some reactions of mitochondrial compartment and NADPH - dependent Glutamate dehydrogenize activation. The most severe disturbances of enzyme reactions, which characterize plastic metabolism and aerobic reactions, are revealed in patients with lung cancer II and III stages. When the main reaction of lipid anabolism is activated, Malat dehydrogenize minima] activity is revealed in lymphocytes of patients with lung cancer IV stadium.
Key word: lung cancer, T-lymphocytes, B-lymphocytes, enzyme activity, Immune globulins, metabolism
А.А. Савченко1, П.В. Лапешин2, Ю.А. Дыхно2
ОСОБЕННОСТИ СОСТОЯНИЯ ИММУННОГО СТАТУСА И АКТИВНОСТЬ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СТАДИИ РАКА ЛЕГКОГО
‘ГУ НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН 2Красноярская государственная медицинская академия
РЕЗЮМЕ
С целью изучения особенности иммунного статуса и активности метаболических ферментов лимфоцитов крови в зависимости от стадии рака легкого обследовано 96 больных мужского пола с раком легкого. Фенотипический состав лимфоцитов крови исследовали с помощью иммунофлуоресцентного метода. Концентрацию иммуноглобулинов оценивали методом иммунодиффузии в геле. Активность оксвдоредуктаз в лимфоцитах определяли с помощью биолюминесцентного метода. Установлено, что уже у больных раком I стадии выявляется нарушения в системе клеточного и гуморального иммунитета, которые уже на II и последующих стадиях заболевания развиваются в Т-зависимое иммунодефицитное состояние с сохранением изменений уровней концентрации А и 1ё О в сыворотке крови. При исследовании особенностей метаболического статуса иммунокомпе-тентных клеток установлено, что у больных раком легкого I стадии метаболизм лимфоцитов характеризуется снижением ряда ферментативных реакций митохондриального компартмента и активацией НАДФН-зависимой глутаматдегидрогеназы. У пациентов при II и III стадиях рака выявляются наиболее выраженные нарушения со стороны ферментативных реакций, характеризующих пластический обмен и определяющих аэробные реакции. У больных раком легкого IV стадии в лимфоцитах крови при активации ключевой реакции липидного анаболизма выявляются наименьшая активность НАДН-зависимой реакции малатдёгидрогеназы.
Ключевые слова: рак легкого, Т-лимфоциты, В-лимфоциты, иммуноглобулины, активность ферментов, пластические процессы
ВВЕДЕНИЕ
Ежегодно в России заболевают раком легкого свыше 65000 человек, из них примерно 84 % мужчин. Более трети из них выявляются в IV стадии заболевания, а погибают от рака легкого свыше 60 000 человек в год, что составляет более 20 %всех умерших от злокачественных новообразований. В структуре онкологической заболеваемости мужчин России рак легкого занимает ранговое место и составляет 25 %, доля рака легкого среди женского населения - 4,3 % [2; 4].
Исследования последних лет показывают значимость различного рода факторов в возникновении ракового процесса. По современным представлениям, появление злокачественного процесса, в том числе и рака легкого, неразрывно связано с нарушениями в системе иммунологической защиты [5; 16]. Между тем доказано, что уровень иммунореактивности определяется не только морфологическим составом иммуно-компетентных клеток и концентрацией иммуноглобулинов в сыворотке крови, но и уровнем метаболических процессов в иммунокомлетентных клетках, которые в значительной степени определяют их функциональную активность [3; 6; 11].
Целью исследования явилось изучение особенностей иммунного статуса и активности метаболических ферментов лимфоцитов крови в зависимости от стадии рака легкого.
В качестве показателей внутриклеточного метаболизма выбраны НАД(Ф)-зависимые дегидрогеназы в связи с тем, что, во-первых, основными переносчиками электронов в клетках являются пиридиновые нуклеотиды, а отсюда - активное участие оксидоредуктаз в биоэнергетических процессах; во-вторых, НАД(Ф)-за-висимые дегидрогеназы, участвуя в направленной координации сопряженных метаболических потоков, в значительной степени обусловливают адаптивные изменения клеточного обмена веществ [1; 13; 14].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
На базе торакального отделения Красноярского краевого онкологического диспансера обследовано 96 больных мужского пола в возрасте 30 - 55 лет, страдающих раком легкого. У 9 пациентов диагностирована I стадия рака легкого, у 31 - И; у 32 - III; у 24 -IV. Кровь для исследования забирали при поступлении больных в стационар. В качестве контроля обследовано 108 здоровых мужчин аналогичного возраста.
Выделение общей фракции лимфоцитов осуществляли по общепринятому методу в градиенте плотности фиколл-верографина с последующей очисткой от прилипающих клеток. Популяционный и субпопуляцион-ный состав лимфоцитов крови оценивали с помощью метода непрямой иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител CD3, CD4, CD8, CD16, HLA-DR и CD72. Для дополнительной характеристики Т-клеточного звена иммунной системы вычисляли иммунорегуляторный индекс (CD4+/CD8+) и индекс активацииТ-лимфоцитов (HLA-DR+/CD72+). Концентрацию иммуноглобулинов класса А, М, G определяли методом иммунодиффузии по Манчини.
Определение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови проводили биолюминес-
центным методом [6]. Данным методом определялась активность следующих ферментов: глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (номер шифр 1.1.1.49) (Г-6-ФДГ), малик-фермента (номер шифр 1.1.1.38 ) (НАДФМДГ), НАД- и НАДН-зависимой реакции лактатдегидрогеназы (номер шифр 1.1.1.27) (НАД-ЛДГ иНАДН-ЛДГ), НАД- и НАДН-зависимой реакции малатдегидрогеназы (1.1.1.37) (НАД-МДГ и НАДН-МДГ), НАД(Ф)- и НАД(Ф)Н-зависимой глутаматдегидрогеназы (номер шифр 1.4.1.2) (НАД(Ф)-ГДГ иНАД(Ф)Н-ГДГ), НАД-и НАДН-зависимой глутаматдегидрогеназы (номер шифр 1.4.1.2) (НАД-ГДГ и НАДН-ГДГ), НАД- и НАД(Ф)-зависимых изоцитратдегидрогеназ (номер шифр 1.1Л .41) (НАД-ИЦДГ и НАД(Ф)-ИЦЦГ) и глу-татионредуктазы (номер шифр 1.6.4.2) (ГР). Активность дегидрогеназ выражали в ферментативных единицах (1 Е=1 мкмоль/мин [1]) на 10* клеток.
Для всех полученных данных определяли среднее арифметическое значение (М) и ошибку средней арифметической (т). Гипотезы о статистической достоверности величин исследуемых показателей несвязанных выборок проверяли с помощью критерия Манна-Уитни. Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью пакета прикладных программ ЗРББ 8.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Показатели иммунного статуса в зависимости от стадии рака легкого представлены в таблице. Обнаружено, что только у больных III стадией рака легкого повышено содержание лейкоцитов в крови. Последовательно повышению стадии опухолевого процесса изменяется относительная концентрация лимфоцитов. Так, у больных II стадией рака легкого содержание лимфоидных клеток значительно снижено. Дальнейшее снижение концентрации данного пула клеток крови выявляется у больных III стадией рака, тогда как у больных IV стадией выявляется статистически достоверное понижение содержания лимфоцитов только относительно контрольных показателей. Независимо от стадии рака легкого в периферической крови больных, выявляется снижение процентного содержания С04+-клеток и повышение концентрации НЪА-ОЬ1+-лимфоцитов. В периферической крови больных II; III и IV стадиями рака легкого снижается относительная концентрация СБЗ+-лимфоцитов и повышается содержание СТ)12+-клегок. Кроме того, у данных больных выявляется снижение величин иммунорегуляторного индекса и индекса активации Т-лимфоцитов. Только у больных I; III и IV стадиями рака легкого повышается относительная концентрация С1)16+-лимфоцитов.
При исследовании состояния гуморального иммунитета обнаружено, что, независимо от стадии рака легкого, повышается сывороточная концентрация 1§ А и снижается содержание ^ О. Только у больных II и III стадиями рака повышена концентрация ^Мв сыворотке крови.
Анализ показателей иммунного статуса позволил установить значительные изменения в системе иммунитета уже у больных I стадией рака легкого. Иммунный статус у больных данной группы характеризуется снижением концентрации хелперной фракции Т-лимфоцитов приповышении содержания 'ЫК-клегок и лим-
________ БИОМАРКЕРЫ ШШт
Состояние иммунного статуса у больных раком легкого в зависимости от стадии (М ± т)
Показатели Контроль N=108 1 Больные
I стадия N=9 2 II стадия N=31 3 III стадия N=32 4 IV стадия N=24 5
Лейкоциты, (109/л) 6,40±0,16 5,63+0,64 6,67±0,29 8,3б±0,62 Р1<0,001 Рг,з<0,05 6,69±0,38 Р4<0,05
Лимфоциты, (%) 38,5±0,8 36,3+1,6 30,5±1,3 Р1<0,001 ?2<0М 26,4±2,5 Р1<0,001 Р2,з<0,05 29,7±2,7 Р1<0,01
СБЗ+, (%) 66,6±0,6 59,0±4,4 60,б±1,8 Р1<0,05 59,2±2,7 Р1<0,05 57,2±3,3 РК0,05
СБ4+, (%) 41,5±0,8 32,5±4,8 Р1<0,05 35,2±1,7 Р1<0,01 31,6+1,9 Р1<0,001 31,2±2,8 Р1<0,001
СБ8+, (%) 26,6+0,7 27,2+3,2 28,6±1,2 27,1±1,0 24,2±1,4 Рз<0,05
С016*, (%) 19,5+0,5 25,5±6,5 Р1<0,05 19,8±1,7 26,2+1,6 Р1<0,001 Рз<0,01 25,3±1,4 Р1<0,001 Рз<0,01
СБ72+, (%) 13,0+0,5 15,5±2,7 18,0±1,1 Р1<0,001 17,2±1,5 Р1<0,01 21,2±2,7 Р1<0,01
НЬА-Б^, (%) 15,8±0,5 22,0+3,2 Р1<0,05 21,4±1,1 РК0,001 24,4±1,6 Р1<0,001 21,4±1,5 Р1<0,001
СВ4+/СБ8+ 1,49±0,05 1,32±0,30 1,26±0,09 Р1<0,05 1,17±0,07 Р1<0,01 1,08+0,11 Р1<0,01
НЬА-ОИ+/0)12+ 1,23±0,05 1,51+0,19 1,12±0,12 Рг<0,05 1,01±0,05 Р1,2<0,01 1,29±0,10 Р4<0,01
^ А, (г/л) 2,41±0,11 3,49±0,72 Р1<0,05 3,21±0,31 Р1<0,01 3,41±0,21 Р1<0,001 3,26±0,3б Рк0,01
^ М, (г/л) 1,32±0,07 1,73±0,35 2,13±0,16 Р1<0,001 1,66±0,18 Р1,з<0,05 1,44±0,24 Рз<0,01
^ в, (г/л) 11,9б±0,43 7,7910,99 ?1<0,05 7,73±0,91 Р1<0,01 7,70±0,58 Р1<0,001 7,39±0,70 Р]<0,001
Примечания: Р1 - статистически достоверные различия относительно показателей контрольной группы; Рг - статистически достоверные различия относительно показателей больных I стадией заболевания; Рз - статистически достоверные различия относительно показателей больных II стадией заболевания; Р4 - статистически достоверные различия относительно показателей больных III стадией заболевания.
фоцитов с фенотипом НГА-БКЛ Необходимо отметить, что НЬЛ-БЯ-редептор экспрессируется как на В-лимфоцитах, так и на активированных Т-лимфоци-тах [15]. Так как количество В-лимфоцитов в периферической крови больных I стадией рака не изменяется, можно предположить, что повышенное содержание НЬА-Б11+-1<леток определяется активированными Т-лимфоцитами, но при отсутствии увеличения величины индекса активации Т-лимфоцитов.
Иммунный статус у больных II, III и IV стадиями рака легкого характеризуется снижением концентрации общих лимфоцитов, Т-лимфоцнгов иТ-лимфоцитов-хелперов с понижением величины иммунорегуляторно-го индекса при повышении содержания В-лимфоцитов и клеток, экспрессирующих рецептор НХАЛЖ. Особенностью клеточного иммунитета у больных раком легкого III и IV стадий является повышение концентра-
ции ]Ж.-клеток. Однако у больных 1П стадией рака изменение концентраций В-лимфоцитов и НЬА-ЭЯ+-кле-ток сопровождается снижением величины индекса активации Т-лимфоцитов, что отражает понижение содержания активированных Т-лимфоцитов.
Состояние гуморального иммунитета на всех стадиях рака легкого характеризуется дисбалансом концентраций 1§ А и 1§ в с одновременным увеличением содержания сывороточного ^ М у больных раком легкого II и III стадий.
При исследовании уровней активности метаболических ферментов в лимфоцитах крови у больных в зависимости от стадии рака легкого обнаружено, что у больных II стадией рака активность Г-6-ФДГ значительно ниже контрольного диапазона, тогда как при 1П стадии уровень фермента превышает контрольные значения (рис. А). Только в лимфоцитах крови у больных
раком легкого III и IV стадий повышается активность НАДФМДГ (рис. Б) и снижается уровень НАДН-МДГ (рис. В). При всех стадиях рака в лимфоцитах крови снижается активность НАДФ-ИЦДГ (рис. Г) и повышается уровень ГР (рис. Д). Установлено, что активность НАД-ГДГ в лимфоцитах крови у больных I стадией снижается, тогда как у больных II и III стадиями рака легкого повышается (рис. Е). Кроме того, обнаружено, что если активность НАДН-ГДГ статистичес-
ки достоверно снижается только у больных раком легкого III и IV стадий (соответственно 0,01±0,001 мкЕи 11,83±3,99 мкЕ, Р<0,001, по сравнению с контролем: 55,39+7,04 мкЕ), то активность НАДФН-ГДГ достоверно повышена на всех стадиях рака легкого. Уровни активности НАД-ЛДГ, НАДН-ЛДГ, НАД-МДГ, НАДФ-ГДГ и НАД-ИЦЦГ в лимфоцитах крови у больных раком легкого соответствуют диапазону нормы.
Исследуемые ферменты находятся на разных ме-
А
14 ■
~ 12-Ї
£ 10 •
і 8-£
е «-
I 4--§ 2 -0 ■
рд3<0,05
Р«<0,01
Ри<0,01
Д....
12. 10 ■
£ 4.
§
а
В 2 ■
Рі<0,05
Рз<(Ш
Ї
і
60
І
& 50 С
і*40
І"30 £ 20
0
§
1 10
0
Рі<0,01 Рі<0,01 Рі<0,01 Рі<0,01
сдь Ґ*! Г*-|
і!і
Е
їв
14
12
10
8
б
4
2
*
Рі<0,05
р2<0,01
Рі<0,01
Рі<0,05
рг<0,01
Рі<0,01
В
300
1 250
0
її §200 И150
1 100 §
І 50 о
ж
Рі.з<0,05
р13<0,05
4
д
300
250
І
В 200 150 100 50 0
%
Є
і
рг<0,001 Рі<0,001
Р!<0,001 Рі<0,00]
Рі<0,05
і
Рис. Зависимость уровней активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови от стадии рака легкого:
1 - контроль; 2-І стадия заболевания; 3 - II стадия заболевания; 4 - III стадия заболевания; 5 - IV стадия заболевания
табояических путях иммунокомпетентных клеток, где занимают ключевые позиции. Следовательно, их анализ позволяет не только оценить уровни активности отдельных ферментов, но и определить интенсивность метаболических путей или циклов, а также реактив-ность метаболических процессов в целом. Так, Г-6-ФДГ является ключевым и инициализирующим ферментом пентозофосфатного цикла, основные продукты которого (рибозо-5-фосфат и НАДФН) определяют широкий ряд реакций макромолекулярного синтеза [1]. Другим исследуемым ферментом, характеризующим анаболические процессы, является НАДФМДГ-ключевой фермент липидного анаболизма. Активность данного фермента в лимфоцитах крови у больных раком легкого III и IV стадий повышена, что позволяет предположить увеличение интенсивности реакций синтеза липидов. Необходимо отметить, что уровни активности НАДН-ГДГ и НАДФН-ГДГ также характеризуют отток интермедиатов цикла три-карбоновых кислот на реакции аминокислотного обмена [I; 12]. При этом повышение активности НАДФН-ГД Г в лимфоцитах крови больных раком при пониженном уровне НАДН-ГДГ у больных раком 1П и IV стадий отражает активацию НАДФН-зависимых реакций в системе митохондриального компартмента, но при ингибировании НАДН-зависимых реакций, причем ингибирование НАДН-МДГ в лимфоцитах крови у больных раком легкого III и IV стадий также подтверждает недостаточность НАДН-зависимых процессов, что в целом может привести к снижению интенсивности аэробного дыхания.
Недостаточность метаболических реакций митохондриального компартмента в лимфоцитах крови у больных раком легкого подтверждается снижением активности НАДФ-ИЦДГ, осуществляющей вспомогательную дегидрогеназную реакцию, активность которой направлена на повышение интенсивности субстратного потока по циклу трикарбоповых кислот [10]. По-видимому, повышение активности НАД-ГДГ в лимфоцитах у больных раком II и III стадий и направлена на активацию субстратного потока цикла трикарбоновых кислот.
Известно, что при развитии рака повышается интенсивность перекисных процессов [8; 9]. По-видимому, повышение активности ГР у больных раком легкого, практически не зависящее от стадии заболевания, отражает компенсаторную активацию глутати-он-зависимой антиоксидантной системы, направленную на ингибирование перекисных процессов.
Таким образом, исследованы особенности иммунного статуса и активность метаболических ферментов лимфоцитов крови у больных раком легкого в зависимости от стадии заболевания. Установлено, что уже у больных раком I стадии выявляются нарушения в системе клеточного и гуморального иммунитета, которые уже на II и последующих стадиях заболевания развиваются в Т-зависимое иммунодефицитное состояние с
сохранением изменений уровней концентрации Ig А и Ig G в сыворотке крови. При исследовании особенностей метаболического статуса иммунокомпетентных клеток установлено, что у больных раком легкого I стадии метаболизм лимфоцитов характеризуется снижением ряда ферментативных реакций митохондриального компартмента, активацией ГР и НАДФН-зави-симого оттока интермедиатов на реакции аминокислотного обмена. На II и Ш стадиях рака выявляются наиболее выраженные нарушения со стороны ферментативных реакций, характеризующих пластический обмен и определяющих аэробные реакции. В то же время у больных раком IV стадии в лимфоцитах крови при активации ключевой реакции липидного анаболизма выявляется наименьшая активность НАДН-за-висимой реакции малатдегидрогеназыпри сохранении повышенного уровня ГР и нарушений в митохондриальном компартменте. Выявленные особенности иммунного статуса и метаболизма иммунокомпетентных клеток в зависимости от стадии рака легкого необходимо учитывать при разработке методов иммуномета-болической терапии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. - М.: Медицина, 1998. - 704 с.
2. Давыдов М.И., Акселъ Е.М. Злокачественные новообразования в России и странах СНГ в 2001г. - М.: издательская группа РОНЦ, 2003. - 263 с.
3. KypmacoeaJI.M., Савченко А.А., Манчук В. Т. Метаболические аспекты иммунных нарушений у детей с заболеваниями органов дыхания. - Новосибирск: СО РАМН, 2001.
4. Мерабишвили В. М., Дятченко О. Т. II Практическая онкология. - 2000.- № 3. - С. 3-7.
5. Олейник Е.К. Олейник В.М. Бахлаев И.Е. Агеенко А.И. I / Вопросы онкологии. - 2001.- Т. 47, № 4. - С. 436-439.
6. Савченко А.А., СунцоваЛ.Н. //Лаб. дело. -1989.-№ 11. - С.23-25.
7. Труфакин В.А., Шурпыгина А.В., Дергачева Т.И., Литвиненко Г.И. И Бюлл. эксперим. биол. и мед. -1995. - Т. 119, №2.~С. 181-183.
8. Abushamaa A.M., Sporn Т.А„ Folz R.J. II Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. - 2002. - Vol. 283, № 2. - P. L336-L345.
9. Allen R. G„ Balin A.K. // Exp. Cell. Res. - 2003. - Vol. 289, №2.-P. 307-316.
10. Chan М., Sim T.S. II Exp. Parasitol. -2003. - Vol. 103, № 3-4.-P. 120-126.
11. Be Azevedo R.B., Rosa L.F., Lacava Z.G., Curi R. // Cell Biochem. Funct. - 1997. - Vol. 15, № 4. - P. 293-298.
12. Herrero-Yraola A., Bakhit S.M., Franke P. // EMBO J. -2001.-Vol. 20, № 10.-P. 2404-2412.
13. Matsubara S., Matsubara D„ Ishibashi Т., Takizawa Т. H Eur. J. Histochem. - 2003. - Vol. 47, № 2. - P. 173-176.
14. McCammon M.T., Epstein C.B., Przybyla-Zawislak B. et al. II Mol. Biol. Cell. - 2003. - Vol. 14, № 3. - P. 958-972.
15. Nakamura H., Idiris A., Kato Y., Kato H. П Oncol. Rep. -2004. - Vol. 11, № 3. - P. 673-676.
16. Sotiropoulou P.A., Perez S.A., Voelter V. et al. H Cancer Immunol. Immunother. - 2003. - Vol. 52, № 12. -P. 771-779.
