CC BY
21doi: 10.17116/terarkh2015871259-65 © Коллектив авторов, 2015
Особенности состава микробиоты кишечника у пациентов с алкогольным циррозом печени
н.в. ШАЛИКИАНИ1, И.Г. БАКУЛИН1, В.Б. ДУБИНКИНА2, Д.С. ИШЕНКО2, 3, Д.Г. АЛЕКСЕЕВ2, 3, А.В. ТЯХТ2, 3, А.В. ПАВЛЕНКО2, 3, Е.Н. ИЛЬИНА3, Е.С. КОСТРЮКОВА2-4, А.Е. ТАРАСКИНА3, Л.О. СКОРОДУМОВА3, И.В. МАЕВ5, В.М. ГОВОРУН3' 2
'ГБУЗ «Московский клинический научно-практический центр» Департамента здравоохранения города Москвы, Москва, Россия; 2ФГАОУ ВПО «Московский физико-технический институт (государственный университет), Долгопрудный, Россия; 3ФГБУН «НИИ физико-химической медицины ФМБА России, Москва, Россия; 4ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия; 5ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России, Москва, Россия
Specific features of the enteric microbiota composition in patients with alcoholic liver cirrhosis
N.V. SHALIKIANI1, I.G. BAKULIN1, V.B. DUBINKINA2, D.S. ISHCHENKO2, 3, D.G. ALEXEEV2, 3, A.V. TYAKHT2,3, A.V. PAVLENKO2, 3, E.N. ILYINA3, E.S. KOSTRYUKOVA2—4, A.E. TARASKINA3, L.O. SKORODUMOVA3, I.V. MAEV5, V.M. GOVORUN2, 3
'Moscow Clinical Research and Practical Center, Moscow Healthcare Department, Moscow, Russia; 2Moscow Institute of Physics and Technology, Dolgoprudnyi, Russia; 3Research Institute of Physicochemical Medicine, Federal Biomedical Agency of Russia, Moscow, Russia; 4Kazan (Volga) Federal University, Kazan, Russia; 5A.I. Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry, Ministry of Health of Russia, Moscow, Russia
резюме
Цель исследования. Установление особенностей таксономического и функционального состава микробиоты кишечника у пациентов с циррозом печени (ЦП) алкогольной этиологии.
Материалы и методы. С помощью метагеномного анализа исследован таксономический состав и функциональный потенциал микробиоты кишечника у 20 пациентов с ЦП алкогольной этиологии. Из образцов кала пациентов выделена тотальная ДНК, после чего проведено полногеномное секвенирование. В ходе анализа метагеномных данных получены результаты по относительной таксономической и функциональной представленности микробных видов в исследуемых образцах. Проведен сравнительный анализ с ранее опубликованными наборами метагеномных данных по когортам здорового населения Российской Федерации, а также Дании, Китая и США.
результаты. У большинства пациентов преобладающая часть кишечного сообщества представлена бактериальными видами, составляющими нормофлору кишечника человека. В то же время у ряда пациентов идентифицирован аномальный состав микробиоты кишечника, свидетельствующий о выраженном дисбактериозе. Дополнительно совокупный анализ данных позволил идентифицировать ряд видов со статистически значимо повышенной и пониженной относительной представленностью по сравнению с контрольными группами. Так, в микробиоте кишечника пациентов с ЦП алкогольной этиологии наблюдается повышенное содержание бактерий, характерных для ротовой полости. Анализ совокупного метаболического потенциала микробиоты таких пациентов продемонстрировал повышенную представленность генов ферментов, участвующих в метаболизме этанола (алкоголя).
Заключение. Идентифицированные по отдельным бактериальным видам изменения состава микробиоты у пациентов с алкогольным ЦП могут быть связаны с сопутствующими заболеваниями желудочно-кишечного тракта, таких как хронический эрозивный гастрит, хронический панкреатит и язвенная болезнь желудка. Изменения, происходящие при алкогольном циррозе, способствуют проникновению и размножению в кишечнике человека микроорганизмов, характерных для ротовой полости. Это может быть потенциальным биомаркером для диагностики заболеваний печени. Бактериальные гены ферментов, участвующие в метаболизме этанола, обладают повышенной представленностью как в группе пациентов с алкогольным ЦП, так и у здоровых добровольцев из Российской Федерации.
Ключевые слова: алкогольный цирроз, микробиота кишечника, микробиом, сообщество микроорганизмов кишечника, ме-тагеном.
Aim. To establish the specific features of the taxonomic and functional composition of the enteric microbiota in patients with alcoholic liver cirrhosis (LC).
Subjects and methods. Metagenomic analysis was used to study the taxonomic composition and functional potential of the enteric microbiota in 20 patients with alcoholic LC. Total DNA was isolated from the patients' fecal samples; thereafter full genome sequencing was carried out. The metagenomic analysis yielded the results of the relative taxonomic and functional abundance of microbial species in the test samples. These were comparatively analyzed with the previously published metagenomic datasets of healthy population cohorts in the Russian Federation, as well as in Denmark, China, and the USA.
Results. In the majority of patients, the dominant part of the intestinal community represented bacterial species constituting the normal human intestinal flora. At the same time, abnormal gut microbiota composition, which was suggestive of marked dysbacteriosis, was identified in a number of patients. In addition, pooled analysis of the data could identify a number of species with a statistically significantly increase and decrease in the relative abundance as compared to the control groups. Thus, the enteric microbiota of the patients with alcoholic LC showed a high proportion of bacteria characteristic of the oral cavity. Analysis of the pooled metabolic potential of the microbiota in these patients demonstrated the higher abundance of enzyme genes involved in alcohol metabolism.
Conclusion. In the patients with alcoholic LC, the microbiota composition changes identified in individual bacterial species may be associated with gastrointestinal comorbidities, such as chronic erosive gastritis, chronic pancreatitis, and gastric ulcer. The alterations occurring in alcoholic cirrhosis promote the penetration and generation of oral cavity-specific microorganisms in the human intestine. This may a potential biomarker for the diagnosis of liver diseases. The bacterial enzyme genes involved in alcohol metabolism have an increased abundance in patients with alcoholic LC and healthy volunteers from the Russian Federation.
Keywords: alcoholic cirrhosis, enteric microbiota, microbiome, intestinal microbial community, metagenome.
КО — номенклатура КБОО ОгШок^у ГГТП — "у-глутамилтранспептидаза
АБП — алкогольная болезнь печени МБ — микробиота
АЦП — алкогольный цирроз печени ЦП — цирроз печени
Россия, по данным ВОЗ, занимает четвертое место по уровню потребления алкоголя, измеряемого в литрах чистого этилового спирта (этанола) на душу населения [1]. Алкоголь является вторым по частоте этиологическим фактором (20—25%) цирроза печени (ЦП) после вирусного гепатита С, служа причиной около 50% всех госпитализаций среди пациентов с ЦП. Следовательно, выявление дополнительных прогностических маркеров развития ЦП на фоне хронического употребления алкоголя со временем приобретает все большую актуальность.
Хроническое злоупотребление алкоголем является необходимым, но недостаточным фактором для развития алкогольной болезни печени (АБП). ЦП развивается у 10—15% больных, страдающих алкоголизмом [2]. Какую роль в патогенезе АБП играет кишечная микробиота (МБ)? Предполагается, что эндотоксины — части внешних мембран клеточных стенок грамотрицательных бактерий — участвуют в поражении печеночной ткани: уровень эндотоксина в сыворотке крови коррелирует с тяжестью АБП (наблюдается увеличение уровня эндотоксина у людей с АБП). В норме кишечная стенка препятствует попаданию эндотоксинов в кровоток, но ацетальдегид — промежуточный продукт метаболизма этанола увеличива-
Сведения об авторах:
Бакулин Игорь Геннадьевич — д.м.н., зав. отд. хронических заболеваний печени МКНЦ
Дубинкина Вероника Борисовна — инженер лаб. системной биологии МФТИ
Ищенко Дмитрий Станиславович — м.н.с. лаб. биоинформатики НИИ ФХМ ФМБА
Алексеев Дмитрий Глебович — к.б.н., зав. лаб. биоинформатики НИИ ФХМ ФМБА
Тяхт Александр Викторович — к.б.н., м.н.с. лаб. биоинформатики НИИ ФХМ ФМБА
Павленко Александр Владимирович — м.н.с. лаб. биоинформатики НИИ ФХМ ФМБА
Ильина Елена Николаевна — д.б.н., зав. лаб. молекулярной генетики микроорганизмов НИИ ФХМ ФМБА
Кострюкова Елена Сергеевна — к.б.н., зав. лаб. постгеномных исследований в биологии НИИ ФХМ ФМБА
Тараскина Анастасия Евгеньевна — с.н.с. лаб. постгеномных исследований в биологии НИИ ФХМ ФМБА
Скородумова Любовь Олеговна — лаборант-исследователь лаб. постгеномных исследований в биологии НИИ ФХМ ФМБА Маев Игорь Вениаминович — д.м.н., зав. каф. пропедевтики внутренних болезней и гастроэнтерологии МГМСУ, чл.-корр. РАН Говорун Вадим Маркович — д.б.н., зам. дир. по научной работе НИИ ФХМ ФМБА, чл.-корр. РАН
ет проницаемость кишечной стенки путем перераспределения белков плотного контакта (белок Zonula occludens 1-го типа) и белков адгезионного контакта (кадгерины, катенины) в результате приводит к эндотоксемии. Распознание эндотоксинов ТЬК.4-рецепторами на поверхности макрофагов и других клеток печени ведет к включению нисходящих сигнальных путей, отвечающих за активацию транскрипционных факторов, таких как ядерный фактор кВ и активатор протеина-1. Затем начинают усиленно синтезироваться провоспалительные цитокины и оксиданты, такие как а-фактор некроза опухоли, интер-лейкин-6, уровень которых прямо пропорционален воспалению и развитию фиброза. Снижение уровня эндотоксинов после антибиотикотерапии, приема пре- и пробио-тиков улучшает индуцированное этанолом поражение печени у крыс [3].
Развитие высокопроизводительных молекулярно-ге-нетических методов анализа микробных сообществ за последние годы позволило детально исследовать состав МБ человека. Одно из наиболее перспективных из них — ме-тагеномное ДНК-секвенирование, наиболее распространенным форматом которого является секвенирование последовательностей генов 16S рРНК. Данный подход позволяет количественно охарактеризовать таксономический состав МБ, включая некультивируемые виды. То, что более половины кишечных видов не поддаются традиционным методам культивирования, а также высокая производительность при умеренной стоимости сделало секвенирование последовательностей генов 16S рРНК важным инструментом биомедицинских исследований МБ человека при различных заболеваниях.
С помощью этого формата секвенирования, а также метода полимеразной цепной реакции в реальном времени в ряде исследований идентифицированы количественные и качественные изменения состава МБ, ассоциированные с алкоголизмом и нарушениями функций печени. Согласно одному из исследований хронический прием алкоголя сопровождается дисбактериозом, который заключается в увеличении числа протеобактерий (отдел Proteobacteria) по сравнению с бактероидами (отдел Bacteroidetes) [4]. Существуют данные о корреляции степени дисбактериоза и стадии АБП. В кале пациентов с ЦП выявлено преобладание патогенных Enterobacteriaceae, со-
Контактная информация:
Шаликиани Нино Важаевна — аспирант отд. хронических заболеваний печени МКНЦ; тел.: +7(929)669-0432; e-mail: nino_ [email protected]
провождающееся уменьшением числа представителей нормальной микрофлоры (семейства Clostridiales incertae sedis XIV, Ruminococcaceae, Lachnospiraceae); последние являются важными производителями короткоцепочеч-ных жирных кислот и препятствуют синдрому избыточного роста бактерий [5]. Среди других описанных ранее изменений таксономического состава МБ при алкоголизме
— повышение представленности таксонов Proteobacteria [6], Gammaproteobacteria [7], Bacilli (Enterocuccus, Lactobacillus) [7], Escherichia coli, Staphylococcus [8], а также понижение Clostridia [6], Bacteroidetes [7], пробиотических Lactobacillus и Bifidobacterium, семейства Ruminococcaceae (в том числе Faecalibacterium, ассоциированных с противовоспалительной активностью) [9].
Современный подход к исследованию кишечной МБ
— метагеномное секвенирование образца кала в полногеномном формате позволяет оценить не только таксономический состав МБ на уровне видов, родов и т.п., но и функциональный на уровне генов, специфических функциональных групп генов и метаболических путей. Это позволяет оценить изменения метаболического потенциала всей МБ в отношении тех или иных функций — деградации полисахаридов, синтеза витаминов и др. Недавно в этом формате проведено обследование 98 пациентов с ЦП; классификация на основании 15 микробных генов позволила отличить пациентов с ЦП от здоровых индивидуумов [10].
МБ кишечника — метаболически активная часть системы человек—МБ. Помимо основных функций, таких как расщепление неперевариваемых человеком полисахаридов, многими исследователями отмечено, что кишечные бактерии могут производить (обычные сбраживатели [11]), а также метаболизировать этанол до ацетальдегида, а некоторые из них (Lactobacillus и Bifidobacterium) — до ацетил-КоА (показано in vitro для 8 выделенных из кишечника штаммов [12]). Таким образом, представляет интерес изучение роли вклада микробов кишечника в переработку или, наоборот, производство дополнительного этанола при алкогольном ЦП (АЦП), поскольку МБ может стать дополнительным фактором патогенеза или, напротив, оказывать протективный эффект при данной патологии.
Учитывая различия в таксономическом и функциональном составе МБ кишечника при ЦП неалкогольной этиологии, а также соответствующие отличия при алкоголизме, можно предположить, что при АЦП МБ состав кишечника также будет изменен. Выявление данных изменений позволит определить бактериальные маркеры, характерные для АЦП и его осложнений, и впоследствии создать диагностический инструмент, позволяющий выявлять подобные изменения на ранних стадиях развития заболевания, а также прогнозировать развитие осложнений.
Цель данного исследования состояла в определении диагностической и прогностической ценности таксономического состава, а также функционального потенциала МБ кишечника у больных ЦП алкогольной этиологии.
Материалы и методы
Клиническая группа. В исследование включены 20 больных, которые проходили лечение в отделении хронических заболеваний печени Московского клинического научного центра с диагнозом ЦП алкогольной этиологии (АЦП), из них 70% на стадии декомпенсации. В том числе 70% больных — мужского пола,
средний возраст 45,7 года. Критерии включения в изучаемую группу: диагноз АЦП, возраст старше 18 лет, злоупотребление алкоголем в анамнезе. Критерии исключения: отсутствие других (помимо АЦП) заболеваний печени, нарушения стула, применение про-, пребиотиков, антибиотиков и ингибиторов протонного насоса менее чем за 3 мес до обследования. Диагностику проводили с помощью стандартных тестов (биохимический анализ крови, общий анализ крови, коагулограмма), эзофагогастродуо-деноскопии, ультразвукового исследования органов брюшной полости. Степень декомпенсации и тяжести определяли по индексу Чайлд—Пью, воспалительную активность — по цитолизу (согласно уровню аланинаминотрансферазы, аспартатамино-трансферазы), степень холестаза — по уровню у-глутамилтранс-пептидазы (ГГТП), билирубина. У всех пациентов наблюдалась портальная гипертензия.
Сбор и обработка клинического материала. Забор кала у пациентов осуществляли в индивидуальный пластиковый контейнер, избегая попадания мочи и туалетной бумаги. Образец массой 10—20 г подвергали немедленной заморозке и хранили при температуре -20 °C. Из образцов кала выделяли тотальную ДНК согласно методике, разработанной в рамках выполнения работ по соглашению № 14.604.21.0119 при поддержке Минобрнауки РФ.
Метагеномное секвенирование. Подготовка полногеномных библиотек и их секвенирование с использованием генетического анализатора SOLiD 5500 («Life Technology», США) осуществлена согласно рекомендациям производителя с использованием наборов 5500 SOLiD Fragment Library Core Kit, SOLiD Fragment Library Barcoding Kit, SOLiD FlowChip Kit, SOLiD FWD SR S50 Kit, SOLiD Run Cycle Buffer Kit. Фрагментные библиотеки созданы из 5 мкг тотальной ДНК для каждого образца с баркодами. Получены геномные прочтения длиной 50 нуклеотидов, среднее число ридов* на образец составило 16 млн.
Биоинформатическая обработка. Обработка результатов полногеномного секвенирования включала определение таксономического и функционального состава (количественное профилирование наличия бактериальных таксонов и функциональных групп генов соответственно). Данный анализ осуществляли с помощью вычислительного конвейера, разработанного и реализованного в лаборатории биоинформатики ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России [13, 14]. Основными этапами анализа являются фильтрация ридов по качеству; фильтрация ридов, картирующихся на геном человека; картирование на референсные каталоги бактериальных геномов и генов; вычисление относительной представленности бактериальных видов и групп генов на основании нормализации значений величины глубины покрытия мета-геномными ридами референсных последовательностей, входящих в указанные каталоги. В качестве референсного каталога геномов использован неизбыточный каталог из 353 геномов микроорганизмов, характерных для МБ кишечника (из [14]), а для генов — каталог из 3,3 млн генов МБ кишечника человека, полученный ранее в ходе крупного метагеномного исследования здорового населения Западной Европы [15]. В результате анализа получали вектора относительной представленности бактерий или генов (суммарной длины ридов картировавшихся на соответствующий геном или ген).
При сравнительном анализе в качестве контрольных групп использован набор из анализированных ранее метагеномов от здорового населения РФ (n=96) [14], США (n=137) [16], Китая (n=69) [17], Дании (n=85) [15]. Для подсчета попарных расстояний между метагеномами на основе векторов относительной представленности бактериальных видов использована мера Брея—Кертиса. Идентификацию родов (или генов), относительная представленность которых значительно различается между группами метагеномов, проводили с использованием рангового критерия Манна—Уитни (поправку на множественные сравнения выполняли по методу Бенджамини—Хохберга; в качестве статистически значимых принимали различия с откорректиро-ваннымp не более 0,01).
*Риды (от англ. reads) — короткие отсеквенированные последовательности. — Примеч. ред.
Для оценки метаболического потенциала МБ к переработке и синтезу этанола из базы данных КБОО [18] получены соответствующие метаболические цепочки и входящие в них группы генов. Всего отобрано 15 бактериальных функциональных групп в номенклатуре КБОО Oгthology (КО). Для каждого метагенома относительная представленность каждой КО-группы получена путем суммирования относительной представленности тех генов референсного каталога генов, которые принадлежали соответствующей КО-группе, согласно исходной аннотации каталога [15]. Полученные значения относительной представленности КО-групп использовали для сравнительного анализа.
Статистический анализ выполнен на языке программирования Я, версия 3.1.0. При поиске бактериальных видов, характерных для ротовой полости в качестве дополнительного метода профилирования таксономического состава использован программный пакет Ме1аРЫАп версии 1.7.7, основанный на детекции уникальных видоспецифичных генных маркеров [19]. Идентификация проводилась на уровне вида (параметры запуска программы: Ч ге1_аЬ --1ах_1еу 8); этап выравнивания ридов в рамках данного анализа проводился с помощью программного пакета Bowtie [20]. Среди результатов идентификации выделена та часть, которая соответствует бактериальным видам ротовой полости согласно списку из публикации по неалкогольному ЦП [10].
Результаты
Клинические параметры и описание пациентов. При
изучении цитолитической активности у пациентов данной группы установлено, что уровень АлАТ близок к норме (повышение в 1,5 раза и меньше) или минимально повышен (в 1,5—3 раза выше нормы). Средний уровень АлАТ составил 35,3+14,1 ед/л. Уровень АсАТ подвергся гораздо более значительным колебаниям: средний уровень 52,5+39,5 Ед/л. Среднее содержание общего билирубина у лиц данной группы составило 63,2+85,5 мкмоль/л, при этом тяжелый алкогольный гепатит на фоне ЦП отмечен у 1 больного. Средний уровень ГГТП составил 166+135 ед/л. Уровни щелочной фосфатазы, альбумина, протромбина, тромбоцитов и международное нормализованное отношение составили 161,1+138,15, 35+7,91, 58,05+18,99, (124,15+60,4)-109/л и 1,65+0,4 соответственно. При оценке выраженности печеночной недостаточности выявлено снижение уровня альбумина у 25% пациентов, протромбина у 65%. По индексу Чайлд—Пью пациенты распределились следующим образом: класс А — у 30%, класс В — у 35%, класс С — у 35%.
Таксономический состав МБ кишечника у пациентов с АЦП. Первичная обработка метагеномных данных (ридов), накопленных для группы пациентов с АЦП, показала их соответствие стандартному диапазону для данного типа данных, биоматериала и алгоритма: 32,09+11,05% ридов легли на референсный каталог геномов бактерий кишечника (сравнить с 23,87+6,54% в [14]). Для большинства образцов доля ДНК человека составила 1,44+4,88%, что также соответствует норме. Для одного образца (А103) данная величина составила 21,9%. Предположительно это может свидетельствовать о наличии воспалительных процессов в кишечнике [21]. Исследование общего таксономического состава МБ пациентов с АЦП выявило наличие 70 родов и 226 видов бактерий (рис. 1 см. на цв. вклейке).
Анализ видового состава МБ у пациентов с АЦП по сравнению с контрольными группами. Для выявления отличительных особенностей таксономического состава МБ, ассоциированных с заболеванием АЦП, проведено сопоставление наших данных с аналогичными, полученными
по четырем контрольным выборкам от здорового населения стран мира (всего 387 метагеномов; см. выше). Визуализация вариабельности состава с помощью многомерного шкалирования показала, что большая часть метагеномов пациентов с АЦП находится близко к основной массе метагеномов контрольных групп (рис. 2 см. на цв. вклейке); это отражает, что у большинства пациентов наиболее преобладающие бактериальные виды соответствуют таковым у здорового населения. Вместе с тем на графике наблюдается ряд точек (выбросов), соответствующих мета-геномам с аномальной структурой микробного сообщества. Для трех визуально наиболее выделяющихся образцов A122, A103, A113 расстояние до всех остальных образцов составило 0,96+0,05, 0,71±0,08 и 0,78+0,06 соответственно, что статистически значимо выше, чем попарное расстояние между всеми проанализированными метаге-номами (0,44+0,12; критерий Уэлча p<0,05).
Действительно, при более детальном рассмотрении выявлено, что в метагеноме A122 большая часть относительной бактериальной представленности приходится на роды Escherichia и Enterococcus (в основном за счет Escherichia coli — 32,2%, Escherichia spp. — 25,4% и Enterococcus faecium
— 21%) — для обоих родов данные значения на 1—2 порядка превышают норму для микрофлоры кишечника. В мета-геноме A113 наблюдается относительное преобладание различных видов Streptococcus (27%, в том числе S. salivarius 14,5%, S. vestibularis 4,4%), Lactobacillus (20%, в том числе L. salivarius 22%, L. crispatus 2,5%) и Veillonella (17%, в том числе V. spp. 6,4%, V. atypica 5,8%, V.parvula 4,6%, V. dispar3,5%)
— бактерии этих таксонов более характерны для ротовой, а не кишечной микрофлоры. Что касается метагенома A103, он не отличается высоким содержанием ненормальной микрофлоры, а формирует точку (выброс) за счет низкого разнообразия: 76% от общей представленности составляет комменсальный род Bacteroides.
Сравнительный анализ относительной представленности отдельных бактериальных таксонов в группе пациентов с АЦП и каждой из контрольных групп выявил ряд статистически значимых отличий (результаты по наиболее представленным видам отражены на рис. 3, см. на цв. вклейке). В частности, по сравнению с МБ здорового населения РФ выявлено повышенное содержание 17 видов и пониженное
— 45 видов (p<0,01). Среди видов со статистически значимо повышенной представленностью у пациентов различные оппортунистические патогены Streptococcus и Veillonellä, а также род Lactobacillus. В то же время понижен уровень комменсальных бактерий Clostridium, Ruminococcus, а также пробиотических видов Faecalibacterium prausnitzii и Bifido-bacterium adolescentis, обратно ассоциированных с воспалительными заболеваниями кишечника [9].
Определение микроорганизмов, характерных для ротовой полости человека, в МБ кишечника пациентов с АЦП. В недавно опубликованном исследовании метагенома кишечника у пациентов с ЦП отмечено значительно повышенное по сравнению с контрольной группой наличие бактерий, населяющих ротовую полость у здоровых людей [10]. Геномы этих видов не содержатся в используемом нами референсном каталоге, поскольку он оптимизирован под высокопроизводительное профилирование кишечных метагеномов. Поэтому использован метод ме-тагеномного профилирования на основании идентификации видоспецифичных генных маркеров MetaPhlAn [19],
Представленность бактерий, характерных для ротовой полости человека, в метагеноме кишечника пациентов с АЦП*
№ Образец Вид Относительная представленность согласно MetaPhlAn, %
1 A104 Streptococcus salivarius 1,52
2 A105 Streptococcus vestibularis 3,90
3 A105 Streptococcus parasanguinis 2,69
4 A105 Streptococcus salivarius 2,05
5 A108 Lactobacillus salivarius 14,61
6 A108 Streptococcus salivarius 10,13
7 A108 Streptococcus parasanguinis 5,09
8 A108 Veillonella atypica 1,23
9 A112 Veillonella parvula 1,38
10 A113 Lactobacillus salivarius 34,84
11 A113 Streptococcus salivarius 12,15
12 A113 Veillonella atypica 10,30
13 A113 Veillonella parvula 7,46
14 A113 Streptococcus parasanguinis 5,13
15 A113 Streptococcus vestibularis 1,54
16 A113 Veillonella dispar 1,31
17 A117 Lactobacillus salivarius 18,87
18 A117 Veillonella parvula 3,68
19 A123 Streptococcus salivarius 4,35
20 A123 Streptococcus parasanguinis 1,48
Примечание. * — ряды упорядочены по образцам, затем в порядке убывания представленности.
который позволяет определять геномы бактерий ротовой полости (см. выше). По результатам анализа метагеномов пациентов с АЦП с помощью данного алгоритма выявлены 7 образцов, в которых относительная представленность, по крайней мере одного бактериального вида, населяющего ротовую полость, составляла более 1% (см. таблицу). Данные роды принадлежат Lactobacillus, Streptococcus и Veillonella. Максимальное присутствие составило 34,84% (вид Lactobacillus salivarius в образце A113).
Анализ метаболического потенциала МБ кишечника у пациентов с АЦП. Предположительно МБ кишечника у лиц, страдающих алкоголизмом, обладает измененной способностью к переработке алкоголя и его продуктов. Чтобы проверить эту гипотезу на имеющихся метагеном-ных данных, мы провели количественное профилирование генов, относящихся к метаболизму этанола (см. выше). На рис. 4 приведены метаболические цепочки, выбранные из метаболической базы данных KEGG для этого анализа.
В результате сравнительного анализа представленности генов данных цепочек у пациентов с АЦП и контрольной группой из числа населения РФ обнаружено, что у группы пациентов повышена представленность генов аль-дегиддегидрогеназ (K00138, K04021) и понижена представленность ацетил-КоА-синтетаз (K01905, K01895); отношение средних по группам значений величин находится в диапазоне 4—16 раз (рис. 5 см. на цв. вклейке). Сравнение группы пациентов с контрольными группами населения других стран мира показало более значительные отличия: у пациентов оказались повышены уровни большинства проанализированных KO-групп, за исключением некоторых генов алкоголь- и альдегиддегидрогеназ.
Обсуждение
Представленное пилотное исследование МБ кишечника у группы пациентов с АЦП в формате метагеномно-
го анализа — первое в Российской Федерации исследование такого масштаба. Оно позволило выявить значительные особенности как таксономической структуры, так и функционально-метаболического потенциала данного микробного сообщества. В целом состав микрофлоры изучаемой группы с АЦП принципиально не отличается от состава микрофлоры у контрольных групп здорового населения стран мира и состоит в основном из представителей нормальной МБ. У пациентов наблюдается снижение представленности потенциально полезных родов бактерий, в том числе Bifidobacterium, фирмикут Ruminococcus и Faecalibacterium, производящих бутират. На этом фоне наблюдается относительное повышение содержания оппортунистических патогенов родов Escherichia, Enterococcus. Кроме того, повышена доля видов, характерных для ротовой полости (из родов Veillonella, Lactobacillus, Streptococcus). Это наблюдение согласуется с ранее опубликованными результатами [10]. Как известно, ЦП сопровождается снижением функций врожденного иммунитета, секреции желудочного сока и желчи. Возможно, одной из причин миграции бактерий из ротовой полости в кишечник является иммунный дисбаланс. Другой возможной причиной может быть изменение продукции желчных кислот, так как в норме желчь является одним из факторов модуляции структуры и численности бактериальных популяций. Найденные бактерии ротовой полости преимущественно ассоциированы с различными оппортунистическими инфекциями: Veillonella могут быть причиной раневых, гнойных инфекций и воспалительного процесса в толстой кишке [22]; Enterococcus обеспечивают колонизационную резистентность слизистых оболочек и способные вызвать аутоинфекции в условиях иммунодефицитных состояний [23]. В перспективе наличие в МБ кишечника видов, типичных для ротовой полости, можно рассматривать как диагностический маркер для оценки функционального статуса печени.
Рис. 4. Схема бактериальных реакций синтеза/переработки этанола (до ключевых соединений, задействованных в основных метаболических путях клеток).
В организме человека основная переработка этанола происходит в печени, где он метаболизируется в токсичный ацетальдегид, а затем в ацетил-KoA. При нарушении функций печени ацетальдегид перерабатывается неполностью, что ведет к его накоплению и повышению степени токсического воздействия на организм. Показано, что ацетальдегид может принимать участие в процессе канцерогенеза. Ферменты, расщепляющие этанол, экспресси-руются в основном в гепатоцитах, но кишечные эпители-оциты и кишечные бактерии также участвуют в метаболизме этанола. При патологиях печени, с одной стороны, МБ может перерабатывать этанол в альдегид, что приводит к увеличению уровня ацетальдегида в просвете кишечника [24] и способствует повышению проницаемости кишечника и воспалению [9]. С другой стороны, МБ может служить резервом ферментов переработки ацетальде-гида (и оказывать положительный эффект) [12]. Кроме того, МБ может продуцировать эндогенный этанол при расщеплении углеводов. Таким образом, исследование метаболических способностей МБ при алкоголизме и заболеваниях печени может указать на новые факторы в патогенезе этих заболеваний.
Метагеномный анализ функционального потенциала МБ показал, что у пациентов с АЦП наблюдается повышение относительной представленности бактериальных генов альдегиддегидрогеназ и понижение — для генов ацетил-КоА-синтетаз. Дополнительно нами обнаружено повышение потенциала метаболизма этанола в МБ контрольной группы РФ по сравнению с контрольными группами из других стран. Можно предположить, что в российской группе кишечная микрофлора как здоровой популяции, так и с АЦП изначально более адаптирована к метаболизму этанола по сравнению с МБ контрольных групп из других стран. Такие различия могут коррелировать со значительными высокоуровневыми вариациями
таксономического состава — на уровне соотношения основных отделов Bacteroidetes, Firmicutes и Actinobacteria. Так, у контрольной группы из США абсолютно преобладают Bacteroides, в геномах которых в принципе понижено содержание этих генов. При этом у пациентов с АЦП по сравнению с когортами из других стран повышена доля Lactobacillus, в геномах которых полностью представлены все гены ферментов изученного пути [12]. Наш подход в силу формата данных не дает ответ на преобладающее направление исследуемых реакций превращения этанола и его продуктов; таким образом, невозможно различить потенциал синтеза и деградации этанола в силу обратимости большинства изучаемых реакций. Данное исследование не предполагало оценку экспрессии генов (например, с помощью метатранскриптомного и/или метапротеомного подхода) и отражает лишь гипотетические возможности МБ. Тем не менее предположительно эти различия влекут за собой и изменения в реальном уровне переработки этанола и продуктов его метаболизма МБ, что имеет существенное значение для организма человека.
Заключение
Проведенный нами метагеномный анализ МБ кишечника на ограниченной выборке пациентов с АЦП позволил выявить особенности, свидетельствующие о смещении таксономической структуры микробного сообщества. Выявленное повышение представленности генов метаболизма этанола указывает на потенциальную адаптацию МБ к хроническому употреблению алкоголя и нарушениям функций печени. Ожидается, что исследование обнаруженных тенденций на более широкой выборке пациентов позволит углубить понимание роли МБ в патогенезе данного заболевания, в частности ее роли в изменении метаболизма этанола и продуктов его деградации.
Финансовая поддержка
Данное исследование осуществлялось за счет средств государственного контракта №КРМЕР160414Х0119 при финансовой поддержке государства в лице Минобрнауки России, с использованием оборудования Междисципли-
нарного ЦКП Казанского федерального (Приволжского) университета (ГК №14.594.21.0003, уникальный идентификатор КРМЕР159414Х0003).
Конфликт интересов отсутствует.
AMTEPATYPA
1. World Health Organization et al. Global status report on alcohol and health-2014. World Health Organization; 2014.
2. Gramenzi A, Caputo F, Biselli M et al. Review article: alcoholic liver disease — pathophysiological aspects and risk factors. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 2006;24(8):1151-1161.
doi:10.1111/j.1365-2036.2006.03110.x.
3. Atkinson K, Rao R. Role of protein tyrosine phosphorylation in acetaldehyde-induced disruption of epithelial tight junctions. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2001;280:1280-1288.
4. Bull-Otterson L, Feng W, Kirpich I et al. Metagenomic Analyses of Alcohol Induced Pathogenic Alterations in the Intestinal Mi-crobiome and the Effect of Lactobacillus rhamnosus GG Treatment. PLoSONE. 2013;8(1):e53028.
doi: 10.1371/journal.pone.0053028.
5. Bajaj J, Heuman D, Hylemon P et al. Altered profile ofhuman gut microbiome is associated with cirrhosis and its complications. Journal of Hepatology. 2014;60(5):940-947.
doi:10.1016/j.jhep.2013.12.019.
6. Chen Y, Yang F, Lu H et al. Characterization of fecal microbial communities in patients with liver cirrhosis. Hepatology. 2011;54(2):562-572.
doi:10.1002/hep.24423.
7. Mutlu E, Gillevet P, Rangwala H et al. Colonic microbiome is altered in alcoholism. AJP: Gastrointestinal and Liver Physiology. 2012;302(9):G966-G978.
doi: 10.1152/ajpgi.00380.2011.
8. Liu Q, Duan Z, Ha D, Bengmark S, Kurtovic J, Riordan S. Synbi-otic modulation of gut flora: Effect on minimal hepatic encephalopathy in patients with cirrhosis. Hepatology. 2004;39(5):1441-1449. doi:10.1002/hep.20194.
9. Leclercq S, Matamoros S, Cani P et al. Intestinal permeability, gut-bacterial dysbiosis, and behavioral markers of alcohol-dependence severity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2014;111(42):E4485-E4493. doi:10.1073/pnas.1415174111.
10. Qin N, Yang F, Li A et al. Alterations of the human gut microbi-ome in liver cirrhosis. Nature. 2014;513(7516):59-64.
doi:10.1038/nature13568.
11. Miller TL, Wolin MJ. Fermentations by saccharolytic intestinal bacteria. The American Journal of Clinical Nutrition. 1979;32(1):164-172.
12. Nosova T. Acetaldehyde production and metabolism by human indigenous and probiotic lactobacillus and bifidobacterium strains. Alcohol and Alcoholism. 2000;35(6):561-568.
doi:10.1093/alcalc/35.6.561.
13. Tyakht A, Popenko A, Belenikin M, Altukhov I, Pavlenko A, Kos-tryukova E, Selezneva O, Larin A, Karpova I, Alexeev D. MALINA: a web service for visual analytics of human gut microbiota whole-genome metagenomic reads. Source Code Biol Med. 2012;7(1):13.
doi:10.1186/1751—0473-7-13.
14. Tyakht A, Kostryukova E, Popenko A, Belenikin M, Pavlenko A, Larin A, Karpova I, Selezneva O, Semashko T, Ospanova E, Ba-benko V, Maev I, Cheremushkin S, Kucheryavyy Y, Shcherbakov P, Grinevich V, Efimov O, Sas E, Abdulkhakov R, Abdulkhakov S, Lyalyukova E, Livzan M, Vlassov V, Sagdeev R,Tsukanov V, Osip-enko M, Kozlova I, Tkachev A, Sergienko V, Alexeev D, Govorun V. Human gut microbiota community structures in urban and rural populations in Russia. Nature Communications. 2013;4:2469.
doi:10.1038/ncomms3469.
15. Qin J, Li R, Raes J et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature. 2010;464(7285): 59-65.
doi:10.1038/nature08821.
16. Huttenhower C, Gevers D, Knight R et al. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 2012;486(7402):207-214.
doi:10.1038/nature 11234.
17. Qin J, Li Y, Cai Z et al. A metagenome-wide association study of gut microbiota in type 2 diabetes. Nature. 2012;490(7418):55-60. doi:10.1038/nature 11450.
18. Kanehisa M. The KEGG database. Silico simulation of biological processes. 2002;247:91-103.
19. Segata N, Waldron L, Ballarini A, Narasimhan V, Jousson O, Huttenhower C. Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes. Nature Methods. 2012;9(8):811-814.
doi:10.1038/nmeth.2066.
20. Langmead B, Trapnell C, Pop M, Salzberg S. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 2009;10(3):R25.
doi:10.1186/gb-2009-10-3-r25.
21. Кострюкова Е.С., Карпова И.Ю., Ларин А.К., Попенко А.С., Тяхт А.В., Ильина Е.Н. Вариабельность относительного содержания геномной ДНК человека при метагеномном анализе микробиоты кишечника. Биомедицинская химия. 2014;60(6):695-701. doi:10.18097/pbmc20146006695.
22. Gevers D, Kugathasan S, Denson L et al. The Treatment-Naive Microbiome in New-Onset Crohn's Disease. Cell Host & Microbe. 2014;15(3):382-392.
doi: 10.1016/j.chom.2014.02.005.
23. Taur Y, Xavier J, Lipuma L et al. Intestinal Domination and the Risk of Bacteremia in Patients Undergoing Allogeneic Hemato-poietic Stem Cell Transplantation. Clinical Infectious Diseases. 2012;55(7):905-914.
doi:10.1093/cid/cis580.
24. Ferrier L, Bdrard F, Debrauwer L et al. Impairment of the Intestinal Barrier by Ethanol Involves Enteric Microflora and Mast Cell Activation in Rodents. The American Journal of Pathology. 2006;168(4):1148-1154.
doi:10.2353/ajpath.2006.050617.
Поступила 16.09.2015
