CC BY
42
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
бросаркомы in vivo. Кроме того, TNF способствует выживанию миелоидных клеток, а также играет важную роль в ангиогенезе и метастазировании.
Работа была осуществлена при поддержке гранта Президента РФ для ведущих научных школ НШ-10014.2016.4
ДЕФИЦИТ АРГИНИНА, ВЫЗВАННЫЙ АКТИВНОСТЬЮ СТРЕПТОКОККОВОЙ АРГИНИНДЕИМИНАЗЫ, СНИЖАЕТ ПРОДУКЦИЮ МАКРОФАГАМИ ОКСИДА АЗОТА
Головин А.С.1, Бурова Л.А.1, Соколов А.В.1, 2, Старикова Э.А.1, Фрейдлин И.С.1, 2' 3
1ФГБНУ«Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия
2 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
3 Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия
Введение. Ключевым компонентом врожденного иммунитета, контролирующим агрессию патогенных стрептококков (Streptococcus pyogenes) в организме, являются макрофаги. Одним из механизмов антибактериальной активности этих клеток служит продукция оксида азота (NO). Продукция оксида азота макрофагам опосредована ферментом NO-синтазой II, субстратом которого является аргинин. NO является важной внутри и межклеточной сигнальной молекулой, регулирующей пролиферацию и дифференцировку клеток адаптивного иммунитета, а также, обладает бактерицидной активностью. Аргинин используется в качестве субстрата бактериальным ферментом аргининдеиминазой (АД), который продуцирует S. pyogenes. Дефицит аргинина, вызванный действием ар-гининдеиминазы S. pyogenes, может приводить к дизрегу-ляции воспаления и нарушению формирования адекватного иммунного ответа.
Цель. Оценить влияние стрептококковой АД на продукцию NO макрофагами линии J774.
Материалы и методы. Эксперименты проводили на модельной системе мышиных макрофагов перевиваемой линии J774. В работе использовали супернатанты разрушенных ультразвуком S. pyogenes M49-16 и его изоген-ного мутанта с делецией гена АД M49-16delAD (любезно предоставлены проф. Суворовым А.Н., отдел молекулярной микробиологии, ФГБНУ «ИЭМ», Санкт-Петербург), содержащие биологически активные внутриклеточные компоненты бактерий. Клетки линии J774 вносили в планшет и добавляли в лунки супернатанты разрушенных стрептококков исходного или мутантного штамма. Для индукции синтеза NO в лунки планшета вносили ЛПС. В некоторые лунки вносили аргинин дополнительно. После 24 часов инкубации измеряли концентрацию оксида азота в надосадке с помощью реактива Грисса. Количество аргинина в экспериментальных пробах определяли с помощью модифицированной реакции Сукагуши.
Результаты. Предварительно проводили подбор концентрации супернатанта M49-16, в которой он обладал максимальной способностью гидролизовать аргинин. Для этого оценивали количество аргинина в экспериментальных пробах после инкубации с различными разведениями супернатанта исходного штамма. Для дальнейшей работы было выбрано оптимальное разведение супер-натантов разрушенных стрептококков 1 мкл/100 мкл культуральной среды. В этом разведении наблюдалось
достоверное снижение количества аргинина в экспериментальных пробах, содержащих супернатант исходного штамма (p < 0,001). Количество аргинина в пробах с су-пернатантом штамма M49-16delAD достоверно не снижалось. Исследование показало, что супернатант S. pyogenes M49-16 достоверно подавлял индуцированную ЛПС продукцию NO клетками линии J774 (p < 0,0001). При этом продукция NO в присутствии супернатанта S. pyogenes M49-16delAD не изменялась. Добавление аргинина приводило к трехкратному увеличению продукции NO клетками линии J774, инкубированными в присутствии су-пернатанта исходного штамма (p < 0,0001). Продукция NO клетками, инкубированными в присутствии суперна-танта M49-16delAD, при добавлении аргинина достоверно не отличалась от контрольного уровня.
Заключение. Полученные данные свидетельствуют о способности стрептококковой АД приводить к снижению продукции NO клетками линии J774 за счет депле-ции аргинина в культуральной среде.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 16-04-00150.
ОСОБЕННОСТИ РЕАКЦИИ МАКРОФАГОВ ПЕЧЕНИ НА ДЕЙСТВИЕ ВОДОРАСТВОРИМОГО СОЕДИНЕНИЯ КРЕМНИЯ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Гордова В.С., Григорьева Е.А., Сергеева В.Е., Смородченко А.Т.
ФГБОУ ВО «Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова, Чебоксары, Россия Институт вегетативной анатомии, клиника Шарите, университет Гумбольдта, Берлин, Германия
Макрофаги печени — особая популяция резидентных макрофагов, которым в последнее время, в связи с изучением иммунных функций печени, уделяется большое внимание. Нами уже было изучено влияние длительного поступления в организм с питьевой водой соединения кремния на макрофаги тимуса, селезенки, лимфоидных узелков тонкого кишечника и прилежащих к ним кишечных ворсинок и показано, что макрофаги уменьшаются в размерах, в них меняется содержание нейромедиатор-ных биогенных аминов, на их цитоплазме увеличивается экспрессия MHC II. Однако вопрос, является ли действие кремния, поступающего с питьевой водой идентичным для всех популяций макрофагов, остается открытым.
Цель. Изучение макрофагов печени лабораторных крыс на длительном сроке поступления в организм водорастворимого соединения кремния.
Материалы и методы. Изучали печень 10 нелинейных крыс-самцов. Контрольная группа (5 крыс), получала ad libitum стандартизованную питьевую воду, подопытная (5 крыс), получала ad libitum ту же воду с добавлением де-вятиводного метасиликата натрия в концентрации 10 мг/л в пересчете на кремний. Через девять месяцев животные были выведены из эксперимента, макрофаги в парафиновых срезах печени выявляли непрямым иммуногисто-химическим методом. Первичные антитела — мышиные антитела против CD68 (clon ED1, Abcam, Cambrige, UK), вторичные антитела — меченные биотилином козьи антитела (Vector Laboratories, U.S.). Для визуализации позитивного окрашивания срезы инкубировались с авидин-биотиновым комплексом и диамино-бензидином (Vector Laboratories, U.S.). Изучали макрофаги в десяти полях зрения (х400, х900), о степени экспрессии CD68 судили
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
по интенсивности светопропускания мембраны и цитоплазмы макрофагов, которую проводили с помощью де-мо-версии программы Sigma Scan Pro5.
Результаты. Макрофаги, экспрессирующие маркер CD68, имеют темно-коричневую окраску мембраны и светло-коричневую цитоплазму, располагаются преимущественно вдоль синусоидных капилляров. Их количество сопоставимо для обеих групп крыс и составляет 18-20 клеток в поле зрения (х400), однако у крыс, получавших кремний с водой, визуально макрофаги имеют меньшее количество отростков и более темную цитоплазматиче-скую мембрану. Средняя площадь макрофагов составила 179,23±5,94 мкм2 и 117,04±3,35 мкм2 для контрольной и подопытной групп соответственно (p < 0,001). Интенсивность светопропускания цитоплазматической мембраны составляет 110,20±11,06 у.е. и 102,47±1,66 у.е., цитоплазмы — 88,15±8,15 у.е. и 83,96±1,82 у.е. для контрольной и подопытной групп соответственно, что свидетельствует о том, что на поверхности звездчатых макрофагов крыс, получавших кремний, находится большее количество маркера CD68. Таким образом, морфологическая реакция макрофагов как печени, так и лимфоидных органов при данном виде воздействия в течение длительного времени имеет сходный характер.
Заключение. Наши наблюдения свидетельствуют, что при поступлении с питьевой водой соединения кремния макрофаги печени, уменьшаясь в размерах, компенсируют это увеличением экспрессии CD68 на своей цитоплазмати-ческой мембране, что можно расценивать как адаптационную реакцию в ответ на снижение фагоцитарной функции.
ЭФФЕКТЫ ГЕНЕТИЧЕСКОГО БЭКГРАУНДА НА ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ МУТАЦИИ K72W ЦИТОХРОМА С IN VIVO
Горшкова Е.А.1, Недоспасов С.А.1, 2, Шилов Е.С.1
1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 ФГБУН«Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта» РАН, Москва, Россия
Цитохром С является незаменимым элементом дыхательной цепи митохондрий, а также выступает в роли одного из медиаторов внутреннего пути апоптоза. У мышей полный генетический нокаут соматического цитохрома С приводит к эмбриональной летальности. Ранее было показано, что точечная мутация замены лизина-72 нарушает только проапоптотические функции белка и на смешанном генетическом фоне приводит к различным эффектам для разных систем организма in vivo.
Мы перевели ранее полученных мышей с заменой остатка лизина-72 на триптофан (K72W-мыши) в последовательности соматического цитохрома С на смешанный генетический бэкграунд линий C57BL/6 и 129S2, поскольку на чистом генетическом фоне C57BL/6 они демонстрировали нормальный фенотип. Мы предположили, что проявление аномального фенотипа гомозиготных по K72W мышей зависит от генов-модификаторов, специфических для линии 129S2, и поэтому не наблюдается у мышей, несущих мутацию на чистом генетическом фоне линии C57BL/6. Целью данной работы является характеристика влияния мутации K72W на нервную и иммунную системы мыши и нахождение возможных механизмов модификации эффекта мутации, зависящих от генетического бэкграунда.
Для характеристики морфологии мозга K72W/K72W мышей был использован анализ гистологических и томографических изображений, а также цитофлуориметри-ческий анализ инфильтрирующих клеток мозга. Оценка популяций иммунных клеток тимуса и селезенки гомозиготных мышей была произведена при помощи проточной цитофлуориметрии.
По результатам работы была подтверждена зависимость проявления фенотипа с нарушениями развития мозга и тимуса у гомозиготных особей от линиеспецифи-ческих генов-модификаторов: при скрещивании мышей, несущих мутацию K72W на чистом C57BL/6 бэкграунде, с мышами дикого типа линии 129S2 в поколении F2 появляются особи, демонстрирующие аномалии развития. В дальнейших скрещиваниях было установлено, что аномальный фенотип проявляется примерно у 40% гомозигот, что указывает на наличие не менее двух генов-модификаторов. На основании литературных данных мы предположили, что такими модификаторами могут быть гены Casp4, Birc6, Naip1-6, однако проверка методом аллеле-специфической ПЦР не установила соответствия между проявлением аномального фенотипа и носительством аллелей данных генов, специфичных для линии 129S2, в гомозиготном или гетерозиготном состояниях.
Аномальный фенотип гетерогенен и включает такие признаки, как разрастание клеток коры и базальных ганглиев головного мозга, гидроцефалию, уменьшение размера тимуса и увеличение популяции DN-тимоцитов. Аномальные признаки сочетаются независимо друг от друга: встречаются K72W/K72W мыши, со значительно измененной морфологией головного мозга и нормальным распределением популяций тимоцитов, и наоборот. Также мы показали, что несмотря на аномальное развитие головного мозга у части гомозигот K72W/K72W, эк-зоэнцефалия не приводит к нарушению гематоэнцефа-лического барьера и массовой инфильтрации иммунных клеток в головной мозг.
Полученные результаты указывают на важность исследования эффектов генетического бэкграунда в моделях генетических нокинов и нокаутов. Мы планируем продолжить поиск генов-модификаторов апоптотическо-го пути, определение которых может расширить существующее представление о механизмах апоптоза.
Работа была осуществлена при поддержке гранта Президента РФ для ведущих научных школ НШ-10014.2016.4.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 16-34-01216 мол-а.
ВИЗУАЛИЗАЦИЯ TNF IN VIVO С ПОМОЩЬЮ НАНОАНТИТЕЛ, СЛИТЫХ С БЕЛКОМ KATUSHKA
Горшкова Е.Н.1, Южакова Д.В.1, 2, Василенко Е.А.1, Ширманова М.В.2, Ефимов Г.А.3, Ермакова К.Д.1, Недоспасов С.А.1, 4, Астраханцева И.В.1
1 Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород, Россия
2 Нижегородская государственная медицинская академия, Нижний Новгород, Россия
3 Гематологический научный центр, Москва, Россия
4 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва, Россия
Введение. Фактор некроза опухоли (TNF) является провоспалительным цитокином, который играет важную
