CC BY
105
УДК 631.46:579.64:574.34:574.38
ОСОБЕННОСТИ КОЛОНИЗАЦИИ РАСТЕНИЙ ИНТРОДУЦИРОВАННОЙ ПОПУЛЯЦИЕЙ KLEBSIELLA PLANTICOLA ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ СТРЕССОВЫХ ФАКТОРОВ
О.В. СЕЛИЦКАЯ, В.Т. ЕМЦЕВ, А.Я. СОКОЛОВА, О.В. КОЛЕСНИКОВ (РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева)
Klebsiella planticola штамм ТСХА-91 — эндофитная бактерия, являющаяся основой биопрепарата биоплант. В условиях полевых, вегетационных и лабораторных экспериментов установлено, что при различных способах инокуляции Klebsiella planticola колонизирует не только ризоплану, но и филлосферу и сохраняется на высоком уровне численности в течение всего вегетационного периода. Исследованы некоторые аспекты изменения численности Klebsiella planticola и их миграции в ткани растения в условиях засоления почвы и в присутствии солей тяжелых металлов.
Ключевые слова: бактеризация, колонизация, ризоплана, филлосфера, засоление почвы, тяжелые металлы.
В результате многолетних исследований на кафедре микробиологии и иммунологии и в лаборатории микробиологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева был получен ряд перспективных штаммов ризобактерий, среди которых наибольшую эффективность показал штамм ТСХА-91 Klebsiella planticola. На основе этого штамма был создан биопрепарат биоплант, который показал высокую эффективность в различных эколого-географических условиях как в нашей стране, так и за рубежом и дал гарантированную прибавку урожая сельскохозяйственных культур на 20-25% [1, 4]. Однако широкое применение микробных землеудобрительных препаратов в практике сельского хозяйства сдерживается нестабильностью положительного эффекта во времени. Известно, что численность популяции микроорганизмов является важнейшим критерием их активности и статуса в биоценозе. Эффективность инокуляции определяется способностью бактерий к колонизации растений. Исследование динамики численности интродуцированной популяции бактерий после инокуляции растений позволяет раскрыть особенности взаимодействия растения и микроорганизма [2, 13].
Объекты и методы исследования
Объектом исследования являлись бактерии рода Klebsiella (Raoultella) семейства Enterobacteriaceae. Klebsiella planticola штамм ТСХА-91 Amp200 и Klebsiella planticola штамм ТСХА-91 Rif200 получены из коллекции кафедры микробиологии и иммунологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.
Для изучения колонизирующей способности и инвазивности K. planticola штамм ТСХА-91 Rif200 в качестве тест-культур использовали ячмень сорта Зазер-ский-85 и овес посевной. Для исследования особенностей колонизации Klebsiella газонных трав по фону засоления почвы были использованы райграс пастбищный сорта Дуэт и овсяница красная сорта Татьяна; а по фону загрязнения почвы тяжелыми металлами — травосмесь из овсяницы красной и овсяницы овечьей.
Исследования проводили в условиях полевых, вегетационных и лабораторных опытов. Для культивирования K. planticola использовали жидкие среды LB [10], Федорова — Калининской и К2 [1]. Отбор образцов почвенного и растительного материала для изучения выживаемости K. planticola проводили путем выборки растений с корневой системой и прилегающей к корням почвой методом рендомизации с каждой повторности варианта [3]. Для анализа ризосферы и ризопланы использовали метод последовательных отмываний корней [11]. Для анализа филлосферы листья срезали стерильными ножницами, разрезали и размалывали в стерильной ступке, готовили ряд разведений, одновременно определяли содержание сухой массы листьев. Для устранения эпифитной микрофлоры (только в опыте с тяжелыми металлами) листья обрабатывали 25%-м раствором гипохлорита натрия (моющее средство «Белизна»), разведенного с водой в соотношении 1:3, в течение 3 мин, затем тщательно промывали под проточной водой.
Численность бактерий определяли методом посева на среду LB с добавлением 200 мкг/мл рифампицина и амипициллина для выделения соответственно Klebsiella planticola штамм ТСХА-91 Rif200 и Klebsiella planticola штамм ТСХА-91 Amp200. Выделенные бактерии были идентифицированы с помощью экспресс-метода выделения плазмидной ДНК клебсиелл с последующим электрофорезом и методом ПЦР с помощью праймера PAR-C1 на базе Центра молекулярной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К. А. Тимирязева.
Результаты и их обсуждение
Для изучения приживаемости корневого ассоциативного диазотрофа K. plan-ticola штамм ТСХА-91 Rif200 на листьях и стеблях после нанесения бактериальной культуры на поверхность растений в условиях полевой станции РГАУ-МСХА был заложен мелкоделяночный опыт с ячменем сорта Зазерский 85. Почва участка — дерново-подзолистая среднесуглинистая. Растения в фазе цветения — начала плодоношения были опрысканы суточной культурой бактерий с титром 109 КОЕ/мл, разведенной водой в 50 раз. Установлено, что в течение первых суток численность внесенных бактерий на листьях и стеблях значительно снижается по сравнению с титром внесения почти на два порядка, но через трое суток было отмечено постепенное возрастание численности K. planticola.
Необходимо отметить, что на протяжении этого периода наблюдений вначале стояла жаркая, засушливая погода, а затем выпали обильные осадки, т. е. было выявлено, что бактерии не только не смывались с листьев, но и размножались в данных условиях. Это позволило предположить, что бактерии K. planticola штамм ТСХА-91 Rif200 способны проникать во внутренние ткани листьев.
Для подтверждения того, что внесенная в филлосферу растений популяция микроорганизмов сохраняется и приживается, а также для более подробного изучения стратегии поведения инокулянта в филлоплане, в полевом опыте были проведены наблюдения за динамикой численности интродуцированной популяции при разных
способах инокуляции растений ячменя (табл. 1). Опыт был заложен на станции защиты растений РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева. Для инокуляции семян их замачивали в суспензии клеток суточной культуры с титром 108—109 КОЕ/мл, в разведении 1:50 в течение часа. Инокуляция филлосферы осуществлялась путем опрыскивания ячменя вручную в фазе всходов суточной культурой с титром 108—109 КОЕ/мл, разведенной водой в соотношении 1:5.
Т а б л и ц а 1
Динамика численности K. planticola штамм ТСХА-91 Rif200 в филлосфере и ризоплане ячменя в зависимости от способа инокуляции, КОЕ/г сухой массы
Вариант инокуляции Время после инокуляции филлосферы, сут. Численность в филлосфере Численность в ризоплане
Инокуляция семян 1 Не обнаружено
5 Не обнаружено 4,0 ■ 10
17 3,0 ■ 102 Не обнаружено
37 5,0 ■ 103 Не обнаружено
57 Не обнаружено Не обнаружено
Инокуляция филлосферы 1 5,0 ■ 104
5 1,0 ■ 104 2,0 ■ 102
17 4,0 ■ 102 2,0 ■ 103
37 7,0 ■ 103 1,0 ■ 102
57 Не обнаружено 2,0 ■ 103
Совместная инокуляция (инокуляция семян + инокуляция филлосферы) 1 5,6 ■ 104
5 1,2 ■ 105 5,0 ■ 103
17 4,0 ■ 102 5,0 ■ 103
37 6,0 ■ 103 5,0 ■ 103
57 Не обнаружено 1,0 ■ 103
Установлено, что К. р1аШсо1а хорошо приживалась на корнях и листьях ячменя, причем можно говорить о связи между способом инокуляции и численностью микроорганизмов (см. табл. 1). Так, совместная обработка обеспечила численность клеток в ризоплане на стабильном уровне (5,0 • 103 КОЕ/г) в течение вегетации растений, которая несколько понизилась ко времени уборки (1,0 • 103 КОЕ/г). Было также выявлено, что при поверхностной бактеризации филлосферы интродуцируемые микроорганизмы способны мигрировать на поверхность корней растений, колонизировать их и приживаться на уровне численности 2,0 • 102-2,0 • 103 КОЕ/г в течение всей последующей вегетации. На следующий год был заложен опыт с аналогичной
схемой, однако для обработки семян также использовали суточную культуру бактерий с тем же титром, но сократили время замачивания семян до 30 мин, а для обработки филлосферы использовали разведение 1:50. Экспериментальные данные подтвердили результаты, полученные ранее, о способности бактерий K. planticola приживаться не только в ризосфере, но и в филлосфере растений и сохраняться там в течение всей вегетации, вплоть до уборки, на достаточно высоком (для эпифитных микроорганизмов) уровне численности — 103—104 КОЕ/г сухих листьев. В то же время отмечена способность K. planticola, нанесенных на филлосферу, быстро колонизировать корни (в течение суток) также на высоком уровне численности — 104 КОЕ/г сухих корней. Интересно то, что колебания численности K. planticola по вариантам в филлосфере практически не зависят от способа инокуляции растений.
При изучении колонизирующей способности штамма было выявлено присутствие бактерий K. planticola штамм ТСХА-91 на корнях и в почве ризосферы как растений, опрысканных культурой по всходам, так и на листьях тех растений, у которых были обработаны семена перед посевом. Одним из возможных объяснений этого факта может являться способность Klebsiella проникать во внутренние ткани растений и колонизировать растение изнутри. В литературе последних лет встречается много данных об обнаружении диазотрофных бактерий-эндофитов в тканях различных органов растений и даже в семенах [2, 13]. Эти факты позволили нам предположить, что и бактерии K. planticola можно также отнести к эндофитам [12].
Для доказательства проникновения K. planticola штамм ТСХА-91 в ткани растений через неповрежденную корневую систему и возможности миграции этих бактерий внутри растения был проведен лабораторный опыт в стерильных условиях на базе Института эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи. Стерилизованные семена овса проращивали в пробирках на стерильной среде, приготовленной из почвенной вытяжки. На 7-й день выращивания растений в питательную среду шприцем вносили суспензию суточной культуры бактерий K. planticola штамм ТСХА-91 Rif200, избегая контакта с корнями. Затем на 1, 3, 5 и 7-е сут. после инфицирования субстрата растения срезали стерильными ножницами, растирали в стерильных ступках, заливали стерильной водой 1:10 и высевали на плотную питательную среду с рифампицином 200 мкг/мл. Выделенные из растительного материала бактерии были идентифицированы не только по признаку рифампицинустойчивости и по фенотипическим характеристикам, но и с помощью экспресс-метода выделения плазмидной ДНК клебсиелл с последующим электрофорезом.
Выявлена инвазионная способность K. planticola штамм TCXA-91 Rif200 no отношению к молодым растениям овса и установлен факт его проникновения в ткани растения через корневую систему и миграции в надземные органы растения — листья и стебли (табл. 2).
По-видимому, можно считать, что изучаемые бактерии проявляют свойства эн-дофитов. Это позволяет предположить, что взаимоотношения растений с вносимым при инокуляции штаммом не ограничиваются ассоциативным взаимодействием, но являются более специфичными и тесными. Таким образом, установлено, что ассоциативные диазотрофные бактерии K. planticola штамм ТСХА-91 обладают свойством инвазивности и проникают во внутренние ткани растений, а также способны к миграции в двух направлениях: от корней к листьям и от листьев к корням.
Как известно, стрессовые факторы негативно влияют как на растения, так и на бактерии. В то же время инокуляция ризосферными бактериями может снижать отрицательное воздействие на растения таких неблагоприятных условий, как засо-
Т а б л и ц а 2
Выделение ДНК плазмид K.planticola штамма TCXA-91 Rif200 в органах овса (стерильный опыт в лабораторных условиях)
Органы растений Обнаружение ДНК плазмид Klebsiella planticola
сроки наблюдений, сут.
1 3 5 7
Листья и стебли Не обнаружено Не обнаружено Обнаружено Обнаружено
Корни Обнаружено Обнаружено Обнаружено Обнаружено
ление почвы и загрязнение ее тяжелыми металлами [2, 6, 7, 8, 9, 13]. Небезинте-ресно определить, как засоление почвы и загрязнение ее тяжелыми металлами влияют на поведение эндофитов при колонизации растений. Для изучения влияния засоления был поставлен вегетационный опыт и проведено искусственное засоление почвы (чернозем обыкновенный, Курская обл.) различными концентрациями хлорида натрия. Хлорид натрия вносили в почву в концентрации 0,05-0, 1-0,2% к массе почвы. Через 14 дней после набивки сосудов проводили посев газонных трав. Перед посевом в вариантах опыта с инокуляцией семена в течение 30 мин замачивали в суточной культуре K. planticola штамм ТСХА-91 Rif200, выращенной на жидкой питательной среде LB и разведенной водой 1:50. Титр исходной культуры 109 КОЕ/мл. Для вариантов без инокуляции бактериями семена на 30 мин помещали в воду. Опыт продолжался в течение двух сезонов. Пробы почвы и растений отбирали на 14-е сут. после инокуляции, а затем по фазам развития растений. Для прохождения зимнего периода в полевых условиях сосуды с газонными травами были установлены в траншею на уровне земли, чтобы температура почвы в сосудах и слой снежного покрова были одинаковыми с полевыми условиями [5].
Установлено, что приживаемость K. planticola в ризоплане овсяницы красной и райграса пастбищного была высокой, независимо от концентрации хлорида натрия (см. рисунок).
Так, численность K. planticola в ризоплане растений хотя и уменьшилась в течение вегетации с 106-107 КОЕ/г корней (фаза первого листа) до 102-104 КОЕ/г корней (конец сезона) в вариантах с дозами хлорида натрия 0,05-0,1% к массе почвы, но оставалась достаточно высокой. Однако внесение хлорида натрия 0,2% к массе почвы оказывало подавляющий эффект на размножение данных бактерий в ризопла-не газонных трав. Так, численность K. planticola в этих вариантах в 10-100 раз ниже, чем в контроле.
Интересным представляется тот факт, что после прохождения зимнего периода хранения сосудов в полевых условиях K. planticola сохранила свою жизнеспособность в ризоплане газонных трав только в вариантах с засолением. Численность данного микроорганизма после прохождения зимнего периода в ризоплане газонных трав на засоленной почве составила 102-103 КОЕ/г корней. Явление сохранения популяции K. planticola после прохождения зимнего периода при отрицательных температурах почвы в условиях засоления наблюдается впервые. Этот факт можно объяснить тем, что K. planticola является эндофитной ризобактерией и, возможно, что при действии отрицательных температур хлорид натрия в почве оказывал на бактери-
Численность бактерий в ризоплане
а
КОЕ/г сухой
массы Райграс пастбищный,
б
Динамика численности бактерий K. planticola штамм TCXA-91 Rif200 в ризоплане газонных трав по фону засоления почвы различными концентрациями NaCl (вегетационный опыт): а — овсяница красная, сорт Татьяна; б — райграс пастбищный, сорт Дуэт. Сроки наблюдений: первый лист (I), второй лист (II), третий лист (III), кущение (IV), окончание периода вегетации (V), после прохождения зимнего периода (VI), инокуляция растений K. planticola (VII), колошение (VIII), цветение (IX), созревание (X). Концентрация NaCl указана в процентах по отношению к массе почвы
альную клетку К. р1апИсо1а определенный протекторный эффект, препятствующей кристаллизации воды.
Для изучения воздействия загрязнения грунта тяжелыми металлами на колонизацию растений бактериями К. р1апИео1а была проведена серия вегетационных опытов с газонными травами. В качестве субстрата использовали низинный торф, который был загрязнен смесью солей тяжелых металлов СоС12, Си804, РЬС03 из расчета превышения ПДК в 100 раз для каждого.
Инокуляцию проводили путем замачивания семян непосредственно перед высевом в суспензии суточной культуры К. р1апИео1а на среде К2, разведенной стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:50 в течение 30 мин. Для точного определения наличия К. р1апИео1а в корнях растений в третьем опыте был использован метод ПЦР. При этом разведения растертых корней овсяницы красной высевались на среду ЬБ с ампициллином, после чего колонии, имеющие признаки, характерные для К. р1апНео1а, исследовались методом ПЦР с помощью праймера РЛЯ-С1. В результате было подтверждено, что данные колонии образованы бактериями К. р1апНсо1а.
Известно, что тяжелые металлы негативно влияют на рост и развитие растений и микроорганизмов. Однако в нашем эксперименте исследование образцов, отобранных на 20-й день, показало, что в варианте с инокуляцией и загрязнением тяжелыми металлами в ризоплане овсяницы были обнаружены бактерии К. р1аШсо1а, численность которых составила 1,5 • 104 КОЕ/г сухого вещества, что незначительно ниже, чем в варианте с инокуляцией без загрязнения (табл. 3).
Т а б л и ц а 3
Влияние загрязнения почвы CoCl2, CuSO4, PbCO3 на распределение интродуцированной популяции К. р!апИсо!а штамм ТСХА-91 AmpR в корнях и листьях растений овсяницы, КОЕ/г сухого вещества
Вариант 20 дней 40 дней
ризоплана филлосфера ризоплана филлосфера
Контроль Не обнаружено Не обнаружено Не обнаружено Не обнаружено
Бактеризация О см Не обнаружено Не обнаружено 5,5 • 103
Тяжелые металлы Не обнаружено Не обнаружено Не обнаружено Не обнаружено
Бактеризация + ТМ 1,5 ■ 104 Не обнаружено Не обнаружено 1,0 • 103
Полученные результаты свидетельствуют об устойчивости данного штамма бактерий к содержанию солей Со, Си, РЬ в почве в количестве, превышающем ПДК в 100 раз. В филлосфере овсяницы на 20-й день после инокуляции семян К. р1апИсо1а не была выявлена. Однако посев, который был проведен на 40-й день, показал, что интродуцированные микроорганизмы мигрировали в филлосферу (стебли и листья),
а в ризоплане K. planticola в этот срок не была обнаружена. Таким образом, в процессе онтогенеза растений наблюдается миграция бактерий K. planticola из прикорневой зоны в филлосферу овсяницы. При содержании в почве свинца, меди и кобальта в размерах, превышающих ПДК в 100 раз, миграция также имеет место, но в меньшей степени.
Заключение
Полученный фактический экспериментальный материал выявил, что бактерии способны колонизировать как поверхность растений, так и проникать внутрь корней, стеблей и листьев. Представленные данные показывают, что растения и микроорганизмы являются единым целым, обеспечивающим жизнедеятельность партнеров благодаря симбиотическим взаимоотношениям, что дает им возможность более эффективно противостоять стрессовым факторам окружающей среды, повышая способность видов к выживанию.
Библиографический список
1. Ассоциативный симбиоз и его роль в продуктивности сельскохозяйственных растений / В.Т. Емцев [и др.] // Тимирязев и биологическая наука: сб. науч. тр. (к 150-летию со дня рождения К.А. Тимирязева). М., 1994. С.106-119.
2. Взаимодействие ризосферных бактерий с растениями: механизмы образования и факторы эффективности ассоциативных симбиозов/ А.И. Шапошников [и др.] // Сельскохозяйственная биология. 2001. №3. С.16-22.
3. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). М.: Агропромиздат, 1985. 351 с.
4. Емцев В. Т. Ассоциативный симбиоз почвенных диазотрофных бактерий и овощных культур // Почвоведение. 1994. №4. С.74-84.
5. Журбицкий З.И. Теория и практика вегетационного метода. М.: Наука, 1968. 244 с.
6. Использование ассоциативных бактерий для инокуляции ячменя в условиях загрязнения почвы свинцом и кадмием / А.А. Белимов [и др.] // Микробиология. 2004. Т. 73. №1. С. 118-125.
7. Колесников О.В., Тимохина Т.П. Влияние бактеризации на устойчивость растений к тяжелым металлам // Известия ТСХА. 2011. Вып. 4. C. 24-29.
8. Лапыгина Е.В., Лысак Л.В. Изменение структуры бактериального комплекса почвы под влиянием насыщенных растворов минеральных солей. Перспективы развития почвенной биологии: тр. Всерос. конф. М.: МАКСПресс, 2001. С. 273-278.
9. Лапыгина Е.В., Лысак Л.В., Звягинцев Д.Г. Устойчивость комплекса почвенных бактерий к солевому шоку // Микробиология. 2002. Т.71. №2. С. 171-175.
10. МиллерД.Х. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир, 1976. 436 с.
11. Молекулярные основы взаимоотношений ассоциативных микроорганизмов с растениями. М.: Наука, 2005. 262 с.
12. Селицкая О.В., Самохин Л. В., Блинков Е.А. Влияние засухи и низких положительных температур на взаимодействие ассоциативных бактерий с растением огурца // Известия ТСХА. 2009. Вып. 4. С. 129-132.
13. Тихонович И.А., Проворов Н.А. Симбиозы растений и микроорганизмов: молекулярная генетика агросистем будущего. СПб.: изд-во Санкт-Петербургского ун-та, 2009. 210 с.
14. Isolation and partial characterization of endophytic diazotrophs associated with japanese sugarcane cultivar / C.A. Jr. Asis [et al.] // Soil Sci. Nutr. 2000. Vol. 46. № 3. P. 759-765.
THE FEATURES OF COLONIZATION OF PLANTS BY INTRODUCED POPULATION OF KLEBSIELLA PLANTICOLA WHEN SUBJECTED TO
STRESS FACTORS
Q.V. SELITSKAYA, V.T. EMTSEV, A.Y. SOKOLOVA, O.V. KOLESNIKOV (Russian State Agrarian University — K.A. Timiryazev MAA)
Klebsiella planticola TSHA-91 is a strain of endophytic bacterium which is used as the basis of a biological product — bioplant. During the field, pot and laboratory experiments having been inoculated in different ways Klebsiella planticola was revealed to colonize not only the rhizoplane, but also thephyllosphere and, moreover, the bacterial abundance remained at a high level throughout the growing season. Some aspects concerning the fluctuations of Klebsiella planticola number and its migration into plant tissues under the conditions of soil salinization and the presence of salts containing heavy metals were investigated.
Key words: colonization, rhizoplane, bacterization of rhizoplane, phyllosphere, soil salinization, heavy metals.
Селицкая Ольга Валентиновна — к. б. н., заведующая кафедрой микробиологии и иммунологии РГАУ-МСХА имени К. А. Тимирязева (127550, Москва, ул. Тимирязевская, 49; тел.: (499) 976-09-66; e-mail: [email protected]).
Емцев Всеволод Тихонович — д. б. н., проф. кафедры микробиологии и иммунологии РГАУ-МСХА имени К. А. Тимирязева. Тел.: (499) 976-09-66; e-mail: [email protected].
Соколова Анна Ярославна — аспирант кафедры микробиологии и иммунологии РГАУ-МСХА имени К. А. Тимирязева. Тел.: (499) 976-09-66; e-mail: [email protected].
Колесников Олег Васильевич — к. б. н., ассистент кафедры микробиологии и иммунологии РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева. Тел.: (499) 976-09-66; e-mail: [email protected].
