CC BY
48
УДК 618.14-006.327 14.01.01 (Акушерство и гинекология)
ОСОБЕННОСТИ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО СТАТУСА У ПАЦИЕНТОК С АДЕНОМИОЗОМ
С.Н. Гайдуков1, А. Ф. Арутюнян1'2, Е.В. Костюшов2
1ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации г. Санкт-Петербург, Россия
2ГБУЗ Ленинградской области «Сертоловская городская больница» г. Сертолово, Россия
Аннотация. Целью настоящего исследования явилось количественное определение основных субпопуляций лимфоцитов периферической крови и выявление роли цитокинов в перитонеальной жидкости у пациенток с различными клиническими вариантами течения и морфологической формой аденомиоза. Количественное определение основных субпопуляций лимфоцитов периферической крови выполнялось у 49 женщин с помощью проточной цитометрии. Мультиплексного определения цитокинов в перитонеальной жидкости проводили у 27 пациенток: 20 женщин, имевших аденомиоз (основная группа) и семь — не имевших аденомиоз (группа сравнения), которым проводилась диагностическая лапароскопия. Таким образом, выявленные отклонения в субпопуляционном составе лимфоцитов периферической крови, характерно для пролиферирующей формы аденомиоза и прогресса заболевания. Наблюдаемая при аденомиозе обратная корреляция содержания 1БЫГ-т в перитонеальной жидкости с размером матки, возможно, является фактором, замедляющим развитие заболевания. Увеличение экспрессии 1Ь-10, выявленное при прогрессирующем аденомиозе, может свидетельствовать о неблагоприятной роли !Ъ2-типа иммунного ответа в развитии опухоли.
Ключевые слова: аденомиоз, иммунный ответ, Т- и В-лимфоциты, цитокины, перитонеальная жидкость.
Введение. Частота аденомиоза в структуре гинекологических заболеваний составляет 15— 20% [3; 6; 7]. Концепция клиники, тактики ведения, пато- и морфогенеза аденомиоза подробно обсуждаются в литературе не одно десятилетие. [1; 2; 4; 7], однако многие аспекты данной проблемы остаются малоизученными. В последнее десятилетие ведется изучение роли системных и локальных иммунных механизмов в патогенезе аденомиоза. Результаты исследований изменений иммунной системы у больных с аденомиозом, опубликованные в литературе, немногочисленны и противоречивы. Выявлены изменения в показателях иммунитета в периферической крови: обнаружены изменения Т- и В-лимфоцитарных систем. Цитокины способствуют клеточной пролиферации,
в том числе и пролиферации эндометриоидных гетеротопий. Особого внимания заслуживают сведения о TNF, который усиливает адгезию стро-мальных клеток эндометриоидных гетеротопий к поверхности мезотелия. Кроме того, TNF стимулирует способность факторов роста ускорять пролиферацию клеток. В литературе наибольшее количество исследований посвящено изучению функций перитонеальных цитокинов при наружном генитальном эндометриозе. Данные о роли цитокинов в перитонеальной жидкости с различными клиническими вариантами течения адено-миоза недостаточно изучены. Таким образом, немногочисленные исследования представленности различных субпопуляций лимфоцитов в периферической крови у больных с аденомиозом проти-
—--—-
~ 9 ~
—--—
воречивы, четко не определена патогенетическая значимость изменений иммунного ответа у пациенток, страдающих аденомиозом. Малоизученным остается состояние локального иммунитета у больных с доброкачественной опухолью миометрия и различными клиническими вариантами ее течения. Вновь полученные результаты иммунологических исследований могут дать возможность адекватного выбора методов лечения. В связи с этим целью настоящего исследования явилась количественное определение основных субпопуляций лимфоцитов периферической крови и выявление роли цитокинов в перитонеальной жидкости у пациенток с различными клиническими вариантами течения и морфологической формой адено-миоза.
Материалы и методы. В настоящее исследование включены 49 больных с аденомиозом. Критерием включения в исследование пациенток явилось: наличие диффузного аденомиоза у женщин репродуктивного и перименопаузального возраста (на основании тщательного анализа клинико-анамнестических и инструментально-диагностических данных — эхографическое, допплерометри-ческое, гистероскопическое обследование с пунк-ционной биопсией миометрия). Возраст больных составлял от 30 до 48 лет (40 ± 2,5 года). Длительность клинических проявлений заболевания была от нескольких месяцев до 10 лет. Основными симптомами заболевания были обильные и длительные менструации у 31 (63,3%) пациенток, скудные темно-коричневые выделения до и (или) после менструации у 18 (36,7%) женщин, болезненные менструации у 10 (20,4%) обследованных. У 15 (30,6%) больных отмечались тазовые боли различной интенсивности и у 10 (20,4%) женщин — диспареуния. Первичное бесплодие имело место у 4 (8,2%) женщин, а вторичное — у 6 (12,2%). Известно, что аденомиоз часто сопровождается маточными кровотечениями, приводящими к ане-мизации больных. Исходя из полученных данных, показатель уровня гемоглобина в пределах 125— 110 г/л наблюдался у 18 (36,7%) пациенток с внутренним эндометриозом тела матки. Показатель уровня гемоглобина 109—100 г/л отмечала 31 (63,3%) больных с аденомиозом. При определении размеров матки получили следующие результаты: у 12 (24,5%) пациенток матка шответствовала размерам 5—6 н. б., у 6 (12,2%) больных — 7—8 н. б.,
у 31 (63,3%) женщин — 9—12 н. б. Средняя величина матки в среднем составила 7,8 ± 1,2 н. б. 49 пациенткам производилась экстирпация матки, вопрос об удалении придатков решался индивидуально. Основными показаниями для проведения гистерэктомии у обследованных больных с адено-миозом были: маточные кровотечения у 31 (63,3%) больных; тазовые боли у 15 (30,6%) пациенток; постгеморрагическая анемия у 31 (63,3%) больных; отсутствие эффекта от проведенной терапии аГнРГ у 37 (75,5%). Ультразвуковое исследование органов малого таза проводили с помощью ультразвукового диагностического прибора Sonoline G40, фирмы Siemens с использованием трансвагинального датчика (частота 6,7 мГц). При ультразвуковом исследовании определяли размеры матки, толщину и структуру миометрия, эндометрия, размеры яичников. Операционную гистерорезектоско-пию (фирмы Olimpys) с биопсией миометрия выполняли пациенткам с монополярной петлей ре-зектоскопа. Захватывали участки миометрия в области визуализируемых железистых ходов (при их отсутствии — в нескольких произвольных точках на разных стенках полости матки). Морфологические исследования были выполнены у всех 49 оперированных больных. Срезы операционного материала окрашивались гематоксилином-эозином, пикрофуксином для выявления соединительной ткани. Просмотр микропрепаратов осуществлялся на микроскопе МИКМЕД-2, видиограммы получены с помощью автоматического анализатора изображения ВИДИ0-ТЕСТ-2,0. При определении функционально активного и неактивного типов эндометриоидных гетеротопий использовали морфологическую классификацию предложенная И.И. Куценко [5], которая позволяет выделять следующие формы заболевания: пролифериру-ющую, стабильную (фиброзную), регрессирующую (дистрофическую). Количественное определение основных субпопуляций лимфоцитов периферической крови (гепаринизированная венозная кровь из кубитальной вены) выполнялось у 49 женщин с помощью проточной цитометрии. Окрашивание проводили коммерческими сочетаниями антител CD45/CD14, CD3/CD19, CD4/CD8, CD3/CD(16+56), CD3/HLADR, меченных флюоро-хромами FITC и РЕ набора Simultest Kit, («Becton Dickinson», США). Анализ экспрессии маркеров лимфоцитов и учет результатов проведен на про-
—--—-
~ 10 ~
—---
[очном цитофлюориметре DAKO Galaxy (Дания) с помощью программного обеспечения FlowMax. Было проведено клиническое обследование 27 пациенток: 20 женщин, имевших аденомиоз (основная группа) и семь — не имевших аденомиоз (группа сравнения), которым проводилась диагностическая лапароскопия. Материалом для иммунологического исследования являлась перитоне-альная жидкость (ПЖ), полученная в ходе оперативного вмешательства при лапароскопии или ла-паротомии. Полученные пробы перитонеальной жидкости подвергались исследованию с помощью мультиплексного определения цитокинов на аппарате Вю-Р1ех («Вю-Rad», США). Использовалась стандартная ТЬ1/ТЬ2-панель, состоящая из 9 показателей: IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN-y и TNF-a.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием общеупотребительных методов параметрической и непараметрической статистики. Методы описательной (дескриптивной) статистики включали в себя оценку среднего арифметического (М), средней ошибки среднего значения (m) — для признаков, имеющих непрерывное распределение; а также частоты встречаемости признаков с дискретными значениями. Для оценки межгрупповых различий значений признаков, имеющих непрерывное распределение, применяли t-критерий Стьюдента. Анализ зависимости между признаками проводили с помощью r-критерия Пирсона (где г = 0,3—0,5 — умеренная, г = 0,5—0,7 — значительные и г = 0,7— 0,9 — сильно выраженная связь). Статистическая обработка материала выполнялась на ЭВМ с использованием стандартного пакета программ прикладного статистического анализа (Statistica for Windows v. 6.0). Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых различий или факторных влияний) принимали равным 0,05.
Результаты исследования и обсуждение. У оперированных больных с диффузным аденоми-озом при макроскопическом исследовании матка была округлой или бугристой формы, увеличена в основном за счет утолщения задней (61,2%) и передней стенок, обусловленного наличием адено-миоза. Консистенция маки в большинстве случаев была неравномерно плотной. На разрезе в мио-метрии очаги аденомиоза имели вид участков
уплотнения ячеистого строения, без капсулы и четких границ, представляющих собой инфильтраты, и кистозные образования. В ряде случаев в толще миометрия имелись мелкие (0,3—0,8 см) полости с геморрагическим содержимым. Очаги аденомиоза были представлены железистыми структурами различной величины и стромой окружающей железы, которая имела цитогенный характер и состояла из многочисленных фибробластоподоб-ных клеток с различным содержанием коллагено-вых волокон. Характерным было наличие множества тонкостенных сосудов. Как правило, стро-мальный компонент преобладал над железистым. В основном преобладание стромального компонента отмечалось в группе 31 (63,3%) пациенток с клинически активным проявлением, у которых морфологически верифицирована пролифериру-ющая форма аденомиоза. Вокруг очагов адено-миоза обнаруживались характерные изменения миометрия: гипертрофия миоцитов, формирование периваскулярных зон роста, сходных с наблюдаемыми в миомах. Функционально активные эндо-метриоидные гетеротопии часто располагались вблизи гетеротопий, в которых эпителий не имел признаков функциональной активности, что согласуется с данными А. Л. Унанян [7]. Сопоставление данных иммунофенотипирования лимфоцитов периферической крови у больных с аденомиозом в зависимости от наличия или отсутствия клинических проявлений заболевания выявило достоверное увеличение относительного содержания В-лимфоцитов (CD3CD19+) у 31 (63,3%) больной, у которых аденомиоз протекал с клиническими проявлениями (p = 0,045). Определено значимое увеличение относительного содержания В-лимфо-цитов (CD3CD19+) (р = 0,035) и натуральных киллеров (CD3CD( 16+56)+) (р = 0,025) у 31 (63,3%) пациентки с пролиферирующей формой аденоми-оза по сравнению с больными, имевшими стабильную или фиброзную форму опухоли. Выявлена связь частоты развития меноррагий у 22 (44,9%) больных и высокого содержания T-лимфоцитов (CD3+CD(16+56) (р < 0,05) и Т-киллеров (CD3+CD(16+56)+) (р<0,05). Проведенное исследование позволило также установить ряд изменений иммунного ответа у больных с аденомиозом на антигенное воздействие опухоли как на системном, так и на локальном уровне, обуславливающих особенности развития аденомиоза: увеличение раз-
—--—-
~ 11 ~
—--—
меров опухоли, развитие узловых форм адено-миоза. Выявленные в ходе исследования отклонения в субпопуляционном составе лимфоцитов периферической крови наиболее выражены при течении заболевания, сопровождающегося клиническими проявлениями: наличием меноррагий, прогрессированием опухоли, развитием узловых форм аденомиоза. Увеличение доли NK-клеток и В-лимфоцитов, имеющее место при «симптом-ном» течении заболевания, происходит в ответ на развитие осложнений, а также может быть маркером инфекции, играющей роль в индукции развития аденомиоза и миомы матки, о чем свидетельствуют данные литературы [8]. Также в ответ на увеличение числа очагов пролиферации, массы опухоли, а, следовательно антигенной нагрузки происходит общая активация афферентного звена — возрастает относительная доля Т-хелперов. Изучение системного иммунного ответа у больных аденомиоза показало, что изменения в иммунной системе, по-видимому, являются вторичными и происходят в ответ на опухолевый рост, что согласуется с имеющимися в литературе данными [8]. Развивающееся при прогрессировании заболевания увеличение относительного содержания субпопуляций лимфоцитов (CD3CD19+, CD3CD(16+56)+, CD48) является отражением прогрессии опухолевого процесса в миометрии. Результаты проведенного исследования показали достоверное повышение уровня IL-10 у пациенток с аденомиозом при сопоставлении с группой сравнения (p = 0,016). При дальнейшей статистической обработке уровень цитокинов у пациенток с аденомиозом был проанализирован в зависимости от клинических вариантов течения заболевания. Были выявлены достоверно повышенные уровни IL-10, GM-CSF, IFN-x и TNF-à у пациенток с длительностью течения заболевания более 5 лет по сравнению с пациентками, у которых аденомиоз существовал менее 5 лет (p < 0,05). Обнаружен повышенный уровень IL-10 у пациенток с прогрессированием аденомиоза (p<0,05) по сравнению с группой контроля. У пациенток с размером матки, соответствовавшим величине менее 8 недель беременности, уровень IFN-x был достоверно выше, чем в группе больных размером аденомиоза более 8 недель (p = 0,002). Локальный иммунный ответ, изучавшийся на основании особенностей экспрессии цитокинов в перитонеальной жидкости больных
с аденомиозом, показал, что на местном уровне иммунные изменения при опухолевом росте более выражены, чем на системном. Опухолевый рост сопровождается экспрессией цитокинов, ответственных за клеточный (Th1) и гуморальный (Th2) типы иммунного ответа. Определение превалирующей роли Th1 либо Th2 иммунного ответа при пролиферативном процессе является важным вопросом клинической иммунологии. Проведенное исследование показало особенности экспрессии медиаторов клеточных взаимодействий, ответственных за каждый из типов иммунного ответа, в зависимости от вариантов клинического течения аденомиоза. Полученные результаты выявили сдерживающую роль TM-типа иммунного ответа в прогрессировании аденомиоза. Подтверждением этому является отрицательная корреляция между размером опухоли и содержанием IFN-x в пери-тонеальной жидкости больных. Кроме того, длительно существующий в миометрии пролифера-тивный процесс также вызывает активацию иммунной системы преимущественно по Th1 пути, на что указывает увеличение содержания IL-10, GM-CSF, IFN-x и TNF-a в перитонеальной жидкости больных c аденомиозом. Заключение об активации клеточного типа иммунной защиты подтверждается и нашими данными, полученными при исследовании содержания субпопуляций лимфоцитов в периферической крови (системный ответ): отмечено относительное увеличение Т-хелперов и NK-клеток при развитии опухоли больших размеров и при узловой форме аденомиоза. Вместе с тем, IFN-x играет важную роль в процессах воспроизводства и функционирования экстрацеллю-лярного матрикса, в частности, коллагена. IFN-x подавляет транскрипцию гена коллагена I типа, синтезируемого фибробластами [10]. Известно, что IFN-x блокирует дифференцировку фибробластов в миофибробласты, вызванную TGF-ß (трансформирующий фактор роста ß) [9]. Таким образом, наблюдаемая при аденомиозе гиперпродукция TGF-ß [11], возможно, сдерживается эндогенно синтезируемым IFN-x, что является фактором, замедляющим развитие заболевания. Очевидно, что недостаточность клеточного звена иммунного ответа является одной из предпосылок прогресси-рованием аденомиоза.
Выводы. Таким образом, выявленные отклонения в субпопуляционном составе лимфоцитов
—--—-
~ 12 ~
периферической крови были наиболее выражены при течении заболевания, сопровождающегося клиническими проявлениями: наличием менорра-гий, прогрессированием заболевания. Определение отклонения в субпопуляционном составе лимфоцитов периферической может быть использовано в целях прогноза течения заболевания. Наблюдаемая при аденомиозе обратная корреляция содержания IFN-x в перитонеальной жидкости с размером матки, возможно, является фактором, замедляющим развитие заболевания. Очевидно, что недостаточность клеточного звена иммунного ответа является одной из предпосылок прогрессирова-ния аденомиоза. Увеличение экспрессии IL-10, отмеченное при прогрессирующем аденомиозе, может свидетельствовать о неблагоприятной роли ТЬ2-типа иммунного ответа в развитии опухоли.
ЛИТЕРАТУРА
1. Арутюнян А.Ф., Гайдуков С.Н., Костюшов Е.В. Особенности экспрессии цитокинов в перитонеальной жидкости у больных с аденомиозом // Материалы V Всероссийского конгресса, «Амбулаторно-поликлиническая помощь — в эпицентре женского здоровья». М., 2013. С. 125—126.
2. Гайдуков С.Н., Арутюнян А.Ф., Костюшов Е.В. Соотношение субпопуляций лимфоцитов в периферической крови больных с различными вариантами течения аденомиоза // Материалы V Всероссийского конгресса «Амбулаторно-поликлиническая помощь — в эпицентре женского здоровья». М., 2013. С. 147—149.
3. Доброкачественные заболевания матки / А.Н. Стрижаков, А.И. Давыдов, В.М. Пашков, В.А. Лебедев. 2-е изд., перераб. и доп. М.: ГЭОТ АР-Медиа, 2014.
3. Киселев В.И., Лященко А.А. Молекулярные механизмы регуляции гиперпластических процессов. М., 2005.
4. Куценко И.И. Клинико-морфологическая диагностика и особенности лечения различных по активности форм генитального эндометриоза: Автореф. дис. ... докт. мед. наук. М., 1995.
5. Медицинские и социальные аспекты генитального эндометриоза / Л.В. Адамян, М.М. Сонова, Е.С. Тихонова, Э.В. Зимина, С.О. Антонова // Проблемы репродукции. 2011. № 6. С. 78—81.
6. Унанян А.Л. Эндометриоз тела матки и яичников: новые аспекты патогенеза, клиники и лечения: Ав-тореф. дис. ... док. мед. наук. М., 2007.
7. Этиология и патогенез лейомиомы матки — факты, гипотезы, размышления / А.Л. Тихомиров,
B.Н. Серов, Е.В. Жаров, Д.М. Лубнин // АГ-инфо. 2006. № 3. С. 3—8.
8. Effect of IFN-gamma and dexamethasone on TGF-betal induced human fetal lung fibroblast myofibroblast differentiation / L. Gu, Y.J. Zhu, Z.J. Guo, X.X. Xu, W.B. Xu // Acta Pharmacol Sin. 2004. Vol. 25. N 2 11. P. 1479—1488.
9. Interferon-gamma induces major histocompatibility class II transactivator (CIITA) that mediates collagen repression and major histocompatibility class II activation by human aortic smooth muscle cells / G. Buttice, J. Miller, L. Wang, B.D. Smith // Circ Res. 2006. Jan 26 (Epub ahead of print).
10. TAK 1, but not TAB 1 or TAB 2, plays an essential role in multiple signaling pathways in vivo / J.H. Shim,
C. Xiao, A.E. Paschal, S.T. Bailey, P. Rao, M.S. Hayden, K.Y. Lee, C. Bussey, M. Steckel, N. Tanaka, G. Yamada, S. Akira, K. Matsumoto, S. Ghosh // GenesDev. 2005. Vol. 19. N 22. P. 2668—2681.
THE FEATURES OF IMMUNOLOGICAL STATUS IN PATIENTS WITH ADENOMYOSIS
S.N. Gaidukov1, A.F. Arutunyan1'2, E. V. Kostushov2
1 Saint Petersburg State Pediatric Medical University of Ministry of Health of the Russian Federation Saint Petersburg, Russia 2Sertolovo City Hospital Sertolovo city, Russia
Annotation. The purpose of this study was a quantitative determination of the main subpopulations of peripheral blood lymphocytes and identification of the role of cytokines in the peritoneal fluid of patients with different clinical variants and morphological form of adenomyosis. Quantification of the major subpopulations of peripheral blood lymphocytes was
—--—
~ 13 ~
—■--—
performed in 49 women by flow cytometry. Multiplex determination of cytokines in peritoneal fluid was performed in 27 patients: 20 women with adenomyosis (main group) and seven — had no adenomyosis (group) that diagnostic laparo-scopy was performed. Thus, the abnormality in the subpopulation composition of peripheral blood lymphocytes, characteristic of proliferating forms of adenomyosis and progress of the disease. The observed inverse correlation with adenomyosis content of IFN-x in peritoneal fluid with the size of the uterus may be a factor in slowing down the progression of the disease. Increased expression of IL-10, revealed in progressive adenomyosis, can testify to the unfavorable role of Th2-type immune response to tumor development.
Key words: adenomyosis, immune response, T and B lymphocytes, cytokines, peritoneal fluid.
REFERENCES
1. Arutjunjan A.F., Gajdukov S.N., Kostjushov E.V. Osobennosti jekspressii citokinov v peritoneal'noj zhidkosti u bol'nyh s adenomiozom. Materialy V Vserossijskogo kongressa "Ambulatorno-poliklinicheskaja pomoshh' — v jepicentre zhenskogo zdorovja". Moscow, 2013. P. 125— 126.
2. Gajdukov S.N., Arutjunjan A.F., Kostjushov E.V. Sootnoshenie subpopuljacij limfocitov v perifericheskoj krovi bol'nyh s razlichnymi variantami techenija adenomi-oza. Materialy V Vserossijskogo kongressa "Ambulatorno-poliklinicheskaja pomoshh' — v jepicentre zhenskogo zdorovja". Moscow, 2013. P. 147—149.
3. Strizhakov A.N., Davydov A.I., Pashkov V.M., Lebedev V.A. Dobrokachestvennye zabolevanija matki. 2-e izd., pererab. i dop. Moscow, GJeOTAR-Media, 2014.
4. Kiselev V.I., Ljashhenko A.A. Molekuljarnye me-hanizmy reguljacii giperplasticheskih processov. Moscow, 2005.
5. Kucenko I.I. Kliniko-morfologicheskaja diagnos-tika i osobennosti lechenija razlichnyh po aktivnosti form genital'nogo jendometrioza: Avtoref. dis. dokt. med. nauk. Moscow, 1995.
6. Adamjan L.V., Sonova M.M., Tihonova E.S., Zimina Je.V., Antonova S.O. Medicinskie i social'nye aspekty
genital'nogo jendometrioza. Problemy reprodukcii, 2011, no. 6, pp.78—81.
7. Unanjan A.L. Jendometrioz tela matki i jaichnikov: novye aspekty patogeneza, kliniki i lechenija: Avtoref. dis. dok. med. nauk. Moskow, 2007.
8. Jetiologija i patogenez lejomiomy matki — fakty, gipotezy, razmyshlenija / Tihomirov A.L., Serov V.N., Zharov E.V., Lubnin D.M. //AG-info. — 2006. — № 3. S. 3—8.
9. Gu L., Zhu Y.J., Guo Z.J., Xu X.X., Xu W.B. Effect of IFN-gamma and dexamethasone on TGF-betal-in-duced human fetal lung fibroblast myofibroblast differentiation. Acta Pharmacol Sin., 2004, vol. 25, no. 2 11, pp. 1479—1488.
10. Buttice G., Miller J., Wang L., Smith B.D. Interfe-ron-gamma induces major histocompatibility class II trans-activator (CIITA) that mediates collagen repression and major histocompatibility class II activation by human aortic smooth muscle cells. Circ Res., 2006, Jan 26 (Epub ahead of print).
11. Shim J.H., Xiao C., Paschal A.E., Bailey S.T., Rao P., Hayden M.S., Lee K.Y., Bussey C,, Steckel M., Tanaka N., Yamada G., Akira S., Matsumoto K., Ghosh S. TAK 1, but not TAB 1 or TAB 2, plays an essential role in multiple signaling pathways in vivo. GenesDev., 2005, vol. 19, no. 22, pp. 2668—2681.
