CC BY
36
лечение и предотвратить неудачи терапии в повседневной практике.
Таким образом, 11Т являются важным востребованным элементом улучшения качества лечения, поскольку они предоставляют независимые доказательства эффективности лечения или его экономической целесообразности, а также помогают найти новые показа-
ния для уже существующих или даже находящихся на этапе исследования препаратов.
В целях увеличения количества и повышения качества таких 11Т в России следует проводить специализированное образование врачей, работать над улучшением нормативной базы и привлекать к их выполнению высококвалифицированных специалистов.
CV 4
CS
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. PI-Initiated vs. Industry-Initiated Clinical Trials Reference Guide. University
of California, San Diego, Last Updated. February 7, 2018. Available at: https:// blink.ucsd.edu/research/preparing-proposals/clinical-research-trials/pi-vs-industry.html.
2. Fourman J. Investigator Initiated Trials. BIRS Center Purdue 2017. Available at: https://www.purdue.edu/discoverypark/ birs/presentations/Investigator%20 Initiated%20Trials%20PPt.pdf.
3. Gokbuget N. The Situation of Investigator Initiated Trials in Europe, 2009. Available at: https://www.leukemia-net.org/content/ international_trials/workshops/2supnd_ sup_workshop_09/e7613/ infoboxContent7614/InternationalIITs_ 0verview_ELN_Gkbuget_2009.pdf.
4. Moscicki R. CDER 2016 Update for Rare Diseases. Available at: https://www.fda. gov/downloads/aboutfda/centersoffices/of ficeofmedicalproductsandtobacco/cder/ ucm542141.pdf.
5. Field M.J., Boat T.F. Rare disease and orphan products Accelerating Research and Development, Committee on Accelerating Rare Diseases Research and Orphan Product Development, Institute of Medicine of the National Academies, the National Academies Press. Available at: https://www.nap.edu/read/12953/ chapter/1.
6. Attal M., Lauwers-Cances V., Hulin C. et al. Lenalidomide, bortezomib, and dexamethasone with transplantation for myeloma. N Engl J Med 2017;376(14):1311-20. DOI: 10.1056/ NEJMoa1611750. PMID: 28379796.
7. Ramsey B.W., Nepom G.T., Lonial S. Academic, foundation, and industry collaboration in finding new therapies. N Engl J Med 2017;376(18):1762-9. DOI: 10.1056/ NEJMra1612575. PMID: 28467868.
8. Novartis Investigator Initiated Trials (IITs) Guidelines, 2014. Available at: https:// www.novartis.com/sites/www.novartis. com/files/novartis-investigator-initiated-trials.pdf.
9. Investigator Initiated Studies (IIS) Creating and Submitting an Application, external user role. Abbvie, 2017. Available
at: www.abbvie.com/content/dam/abbvie-
dotcom/uploads/PDFs/SPIRIT_
External_Submitter_Guide.pdf.
10. Investigator Initiated Studies. Roche, 2018. Available at: www.roche.com/ research_and_development/who_we_are_ how_we_work/investigator-initiated-studies-portal.htm.
11. Беденков А. Поддержка исследовательских инициатив научных лидеров. Ремедиум 2012;5:51-2. [Bedenkov A. Supporting research initiatives of scientific leaders. Remedium = Remedium 2012;5:51-2.(In Russ.)].
12. National breast cancer foundation investigator initiated research scheme guidelines. Australia. Available at: https:// nbcf.org.au/research/information-for-researchers/grants-information/nbcf-grants-scheme/.
13. A Randomized Phase III Study Comparing Conventional Dose Treatment Using a Combination of Lenalidomide, Bortezomib and Dexamethasone (RVD) to High-Dose Treatment with Peripheral Stem Cell Transplant in the Initial Management of Myeloma in Patients up to 65 Years of Age (IFM/DFCI 2009). Trial Protocol, EudraCT Number: 2009-016871-32.
14. Clinical trials in human medicines, EMA. Available at: http://www.ema.europa.eu/ ema/index. jsp?curl=pages/special_topics/ general/general_content_000489.jsp.
15. Hartmann M. Impact of the new legislative framework within the European Union on non-commercial clinical research and investigator-initiated trials: a cross-European analysis with focus on oncology. Wissenschaftliche Pfungsarbeit zur Erlangung des Titels "Master of Drug Regulatory Affairs". Der MathematischNaturwissenschaftlichen Fakultät der Rheinischen Friedrich-WilhelmsUniversität, Bonn, 2005.
16. Madeira C., Pais A., Kubiak C. Investigator-initiated clinical trials conducted by the Portuguese Clinical Research Infrastructure Network (PtCRIN), 2016. Elsevier Inc. Available at: http://dx. doi.org/10.1016/j.conctc.2016.08.002.
17. Investigational New Drug Applications Prepared and Submitted by Sponsor-
Investigators. Guidance for Industry. FDA, Draft guidance, 2015. Available at: https:// www.fda.gov/downloads/Drugs/ Guidances/UCM446695.pdf.
18. Hartman K.A. Creating Infrastructure Support for Investigator Initiated Research. Research Compliance, Mayo Clinic HCCA Research Compliance Conference, 2017. Available at: https:// www.hcca-info.org/Portals/0/PDFs/ Resources/Conference_Handouts/
Research_Compliance/2017/V1_ses_
R501_3slides.pdf.
19. Bang Y.J., Chan K.A., Tan S. et al. IIT Made Easy Investigator Initiated Trials Made Easy, Sponsored by Quintiles, 2015. Available at: https://www.iqvia.com/-/ media/iqvia/pdfs/ap-location-site/iit-made-easy.pdf.
20. Trimble E.L., Ledermann J., Law K. et al. International models of investigator-initiated trials: implications for Japan. Ann Oncol 2012;23(12):3151-5.
DOI: 10.1093/annonc/mds168. PMID: 22843420.
21. Yasuyuki Sahara. MHLW's Measures
to Ensure the Reliability of Investigator-Initiated Clinical Trials. Ministry of Health, Labour and Welfare. Japan, 2013. Available at: https://www.wma.net/ wp-content/uploads/2017/01/Yasuyuki_ Sahara.pdf.
22. Thurlow J. Introduction to Investigator-Initiated Research, Presentation
to Division of Cardiology. January 26,
2011, Canada Rm. 121, 5790
University Ave. 473-4841. Available at:
www.cdha.nshealth.ca/system/files/
sites/391/documents/introduction-
investigator-initiated-research-
presentation.pdf.
23. Economic evaluation of investigator-initiated clinical trials conducted by networks. Final report. The Australian Clinical Trials Alliance, in association with Quantium Health Outcomes. Australian Commission on Safety and Quality
in Health Care 2017.
Available at: https://www.safetyandquality.
gov.au/wp-content/uploads/2017/07/
Economic-evaluation-of-investigator-
initiated-clinical-trials-conducted-by-
networks.pdf.
cv
4
CV
ев
сч
Вклад авторов
А. Г. Торубарова: написание текста рукописи; М.Б. Насонова: обзор публикаций по теме статьи. Authors' contributions A.G. Torubarova: article writing;
M.B. Nasonova: reviewing of publications on the article's topic. ORCID авторов/ORCID of authors
А.Г. Торубарова/A.G. Torubarova: https://orcid.org/0000-0002-0632-0959 М.Б. Насонова/M.B. Nasonova: https://orcid.org/0000-0003-2827-7354
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Исследование проведено без спонсорской поддержки. Financing. The study was performed without external funding.
Статья поступила: 17.10.2018. Принята к публикации: 28.11.2018. Article received: 17.10.2018. Accepted for publication: 28.11.2018.
Особенности иммунофенотипа опухолевых клеток у детей с острым лимфобластным лейкозом и наличием транслокации tП2;21Hp13;q22)/£Ш-Л0NX7
CV 4
Ж.В. Пермикин1, 2, А.М. Попов3, Т.Ю. Вержбицкая2, 4, Т.О. Ригер2, 4, О.Р. Аракаев2, 4, А.А. Власова2, es
Ю.В. Ольшанская3, А.Н. Казакова3, С.В. Цвиренко1, 2, Л.И. Савельев1, 2, 4, Г.А. Цаур1, 2, 4, 5, Л.Г. Фечина2, 4 2
ФГБОУВО «Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России; i—
Россия, 620028 Екатеринбург, ул. Репина, 3; g
2ГАУЗ СО «Областная детская клиническая больница»; Россия, 620149 Екатеринбург, ул. Серафимы Дерябиной, 32; ш
3ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии 5Е
им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России; Россия, 117997Москва, ул. Саморы Машела, 1; и
4ГАУЗ СО «Институт медицинских клеточных технологий»; Россия, 620026 Екатеринбург, ул. Карла Маркса, 22а; fr
5ФГБУН«Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения РАН»; Россия, 620049 Екатеринбург, _
ул. Первомайская, 106 «
Контакты: Александр Михайлович Попов [email protected]
оо
Цель исследования — поиск иммунофенотипическихмаркеров для прогнозирования наличия транслокации t(12;21)(p13;q22)/ETV6-RUNX1. i— Результаты. Транслокация t(12;21)(p13;q22)/ETV6-RUNX1 была обнаружена у 118 (22,4 %) из 526 обследованных пациентов ™ с острым лимфобластным лейкозом из В-линейных предшественников. Опухолевые бласты пациентов с транслокацией t(12;21) ^ (p13;q22)/ETV6-RUNX1 достоверно чаще имели высокую экспрессию CD10, а также коэкспрессию миелоидныхмаркеров CD13, CD33 и CD117. Для них также было типично отсутствие экспрессии CD20. В то же время полученные нами результаты не по- ж зволили найти отдельный иммунофенотипический маркер, который с высокой долей достоверности мог бы предсказывать наличие t(12;21)(p13;q22)/ETV6-RUNX1. Щ. Заключение. Таким образом, применение стандартного перечня иммунологических маркеров не позволяет уверенно выделить ® данную группу пациентов. Однако расширение диагностической панели, высокий уровень стандартизации проточной цитометрии ^ и дополнительные методы анализа цитометрических данных могут позволить достаточно точное выявление пациентов, отно- ® сящихся к этой клинически значимой подгруппе.
Ключевые слова: острый лимфобластный лейкоз, иммунофенотипирование, транслокация t(12;21)(p13;q22) ^
Для цитирования: Пермикин Ж.В., Попов А.М., Вержбицкая Т.Ю. и др. Особенности иммунофенотипа опухолевых клеток у детей с острым лимфобластным лейкозом и наличием транслокации t(12;21)(p13;q22)/ETV6-RUNX1. Онкогематология 2018;13(4): 95-103.
DOI: 10.17650/1818-8346-2018-13-4-95-103
Flow cytometric analysis of leukemic blast cells in pediatric B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia with
translocation t(12;21)(p13;q22)/ETV6-RUNX1
Zh. V Permikin1'2, A.M. Popov3, T. Yu. Verzhbitskaya2 4, I. O. Riger2 4, O. R. Arakaev2 4, A.A. Vlasova2, Yu. V Olshanskaya3, A.N. Kazakova3, S.V. Tsvirenko1'2, L.I. Saveliev1'24, G.A. Tsaur1'245,L.G. Fechina2'4
Ural State Medical University; 3 Repina St., Ekaterinburg 620030, Russia; 2Regional Children's Hospital; 32 Serafimy Deryabinoy St., Ekaterinburg 620149, Russia; 3Dmitriy RogachevNational Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology; 1 Samory Mashela St.,
Moscow 117997, Russia;
4Research Institute of Medical Cell Technologies; 22a Karla Marksa St., Ekaterinburg 620026, Russia; 5Institute of Immunology and Physiology of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences; 106 Pervomayskaya St.,
Ekaterinburg 620049, Russia
The objective of the study was searching for surface antigen expression that could predict presence of translocation t(12;21)(p13;q22)/ETV6-RUNX1 in pediatric B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia patients.
Results. ETV6-RUNX1 fusion gene transcript was revealed in 118 (22.4 %) out of 526 children with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Leukemic blast cells in ETV6-RUNX1-positive patients more frequently had high CD10 expression, myeloid markers co-expression, including CD13, CD33, CD117, and absence of CD20 than in ETV6-RUNX1-negative ones. Nevertheless diagnostic test performance characteristics of each single parameter was not strong enough for predicting the presence of translocation t(12;21)(p13;q22)/ETV6-RUNX1. Conclusion. Thus application of conventional set of immunological markers does not allow reliable distinguishing this patients' subgroup.
However antibodies panel enlargement, high degree of flow cytometry standardization and additional analytical methods can potentially improve applicability of antigen profile analysis for separation of patients with translocation t(12;21)(p13;q22)/ETV6-RUNX1.
Key words: acute lymphoblastic leukemia, immunophenotype, translocation t(12;21)(p13;q22)
cv
4
cs
For citation: Permikin Zh.V., Popov A.M., Verzhbitskaya T.Yu. et al. Flow cytometric analysis of leukemic blast cells in pediatric b-cell precursor acute lymphoblastic leukemia with translocation t(12;21)(p13;q22)/ETV6-RUNX1. Onkogematologiya = Oncohematology 2018;13(4): 95-103.
cv
4
Введение
У детей с острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) и повторяющимися генетическими аберрациями наиболее часто встречающейся структурной перестройкой является транслокация t(12;21)(p13;q22), ведущая к образованию химерного гена ETV6-RUNX1 (TEL-AML1) [1-3]. Данная хромосомная аберрация считается криптической, т. е. ее невозможно выявить при стандартном цитогенетическом анализе [4]. Поэтому для ее определения необходимо использовать такие высокотехнологичные методы клинической лабораторной диагностики, как флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) и обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) [4-6]. К сожалению, в нашей стране эти методы используются только в ограниченном числе лабораторий. Важность выявления транслокации t(12;21)(p13;q22)/ETV6-RUNX1 связана с тем, что она ассоциирована с благоприятным прогнозом при ОЛЛ у детей [7-11], в том числе при существенном снижении продолжительности терапии [12].
Ранее неоднократно предпринимались попытки найти иммунофенотипические маркеры, ассоциированные с наличием данной транслокации для того, чтобы проводить прицельный поиск транслокации t(12;21)(p13;q22)/ETV6-RUNX1. Наиболее убедительные данные получены для иммунофенотипа, соответствующего ОЛЛ из В-линейных предшественников (ВП-ОЛЛ) с экспрессией CD27, отсутствием и/или слабой экспрессией CD44, а также с отсутствием экспрессии CD20, CD9, CD66c [13-19]. Однако вышеперечисленные маркеры, кроме CD20, редко используются на этапе первичного иммунофенотипирования при установлении диагноза ОЛЛ. Поэтому нами был предпринят поиск иммунофенотипических критериев, применяемых в общепринятой диагностической панели [20, 21], для прогнозирования наличия транслокации t(12;21)(p13;q22)/ETV6-RUNX1.
Цель исследования - оценить особенности имму-нофенотипа бластных клеток у детей с ВП-ОЛЛ и наличием транслокации t(12;21)(p13;q22)/ETV6-RUNX1
Материалы и методы
Исследование проводилось в лаборатории молекулярной биологии, иммунофенотипирования и па-томорфологии Отдела детской онкологии и гематологии Областной детской клинической больницы г. Екатеринбурга с марта 2008 г. по декабрь 2017 г. В исследуе-
мую группу были включены 526 пациентов с диагнозом ВП-ОЛЛ. Медиана возраста составила 3,4 года (1 мес—17 лет). Диагноз ОЛЛ устанавливали на основании стандартных цитологических критериев [22], дополненных результатами иммунофенотипирования согласно рекомендациям группы EGIL [23, 24]. Выявление транслокации t(12;21)(p13;q22)/ETV6-RUNX1 проводили методом двухстадийной («гнездной») ОТ-ПЦР по ранее описанной методике [25].
Иммунофенотипирование опухолевых клеток в костном мозге выполняли методом 4-8-цветной проточной цитометрии на приборе FACS Canto II (Becton & Dickinson (BD), США). Настройку прибора производили с использованием калибровочной системы Comp Beads (BD). Мониторинг стабильности работы прибора осуществляли с помощью калибровочных частиц Cytometer Setup and Tracking (BD). Диагностическая панель включала комбинацию антител, приведенных в табл. 1. Окрашивание первичномеченными моно-клональными антителами проводили согласно инструкции производителя. После инкубации суспензии костномозговых клеток с первичномеченными моно-клональными антителами взвесь обрабатывали лизиру-ющим раствором (FACS Lysing solution, BD), а затем отмывали фосфатно-солевым буфером (Cell Wash, BD). Результаты иммунофенотипирования оценивали с помощью программного обеспечения FACS Diva 4.0—6.1 (BD). Объединение цитометрических данных разных пациентов проводили с использованием программы Kaluza 2.1 (Beckman Coulter (BC), США). Объединяли данные только тех пациентов, иммунофено-типирование которых было выполнено по идентичным протоколам работы, одинаковыми комбинациями антител и флуорохромов, а также при стабильных настройках проточного цитометра. Оценку и интерпретацию результатов иммунофенотипирования проводили в соответствии со стандартом российско-белорусской кооперативной группы «Москва—Берлин» [21]. Для сравнения уровня экспрессии антигенов использовали значения средней интенсивности флуоресценции (mean fluorescence intensity, MFI). Поскольку величина MFI напрямую зависит от используемых сочетаний антител с флуорохромами, а также от настроек проточного цитометра, прямое сопоставление MFI оказалось возможным для 103 пациентов.
Для статистической обработки результатов применяли программу Statistica 7.0. Статистическую значимость
Таблица 1. Моноклональные антитела, применявшиеся для диагностического иммунофенотипирования острого лейкоза Table 1. Monoclonal antibodies used for diagnostic immunophenotyping of acute leukemia
Моноклональное Флуорохром Производитель
Fluorochrome Manufacturer
Mon°donalantib°dy
CD7 FITC BD
NG2 PE BD
CD45 PerCP BD
CD34 PE-Cy7 BD
CD19 PE-Cy7/APC BD
CD3 APC-Cy7/APC-H7 BD
CD10 PE/BV421 BD
CD56 BV510 BD
CD15 FITC/BV510 BD
CD13 PE/PE-Cy7 BD
CD33 PerCP/PE-Cy7/APC BD
CD11c APC/BV510 BD
CD14 APC-Cy7/APC-H7 BD
CD117 PE/APC/BV421 BD
CD64 FITC/BV510 BD
iLysozime FITC Invitrogen
iMPO FITC/PE BD/Invitrogen
iCD22 PE-Cy7/BV421 BD
iCD79a APC BC, BD
CD58 FITC BD, BC
CD20 APC-Cy7 BD
CD38 BV510 BD
Anti-Lambda FITC/PE BD
Anti-Kappa FITC/PE BD
IgM APC BD
CD5 PE-Cy7 BD
Примечание. BD — Becton & Dickinson, США; BC — Beckman Coulter, США. Note. BD — Becton & Dickinson, USA; BC — Beckman Coulter, USA.
различии определяли с помощью непараметрических критериев Манна—Уитни и х2 с поправкой Йетса. Достоверными считали различия прир <0,05. Для оценки ассоциации между экспрессией отдельных имму-нофенотипических маркеров и выявлением ^12;21) (p13;q22)/ETV6-RUNX1 проводили расчет диагностической чувствительности, специфичности, предсказа-
тельной ценности положительного и отрицательного результатов, диагностической эффективности теста [26].
Результаты
Транслокация ^12;21)(р13^22)/ЕТГ6^иЖ1 была обнаружена у 118 (22,4 %) из 526 обследованных пациентов. Иммунофенотип опухолевых клеток всех пациентов с транслокацией t(12;21)(p13;q22)/ETV6-RUNX^1 соответствовал варианту В11, в то время как при отсутствии данной генетической аберрации этот вариант был диагностирован достоверно реже — у 365 (89,5 %) из 408 пациентов (р <0,001). Профиль экспрессии антигенов при ОЛЛ с наличием перестройки ETV6-RUNX1 и без нее существенно различался (табл. 2). Опухолевые бласты при наличии транслокации ^12;21)(р13;22)/ ETV6-RUNX1 достоверно чаще экспрессировали CD10, CD45 и CD34, но реже CD20 и внутриклеточную ц-цепь иммуноглобулина. Наиболее же существенным отличием стало крайне высокое число пациентов, у которых опухолевые клетки коэкспрессировали ми-елоидные антигены. У 76,3 % пациентов с ^12;21) (p13;q22)/ETV6-RUNX1 была выявлена экспрессия как минимум одного из исследованных миелоидных маркеров. Эти различия оказались значимыми для CD13, CD33 и CD117, проанализированных по отдельности. Даже CD117, ранее считавшийся достаточно специфичным признаком миелоидной дифференцировки [27], был обнаружен на опухолевых клетках в 37,2 % случаев при ОЛЛ с наличием транслокации ^12;21) (p13;q22)/ETV6-RUNX1. Кроме того, почти у половины пациентов с данной генетической аберрацией было определено более одного миелоидного маркера, а 13,6 % детей по классификации EGIL [23] должны быть отнесены к категории острого бифенотипическо-го лейкоза, поскольку у них опухолевые клетки коэкс-прессировали все 3 перечисленных антигена.
Характеристики параметров диагностической эффективности определения отдельных антигенов для прогнозирования наличия перестройки ^12;21)(р13^22)/ ETV6-RUNX1 представлены в табл. 3. Как видно из представленных данных, наибольшей диагностической эффективностью обладала экспрессия CD117 (89,4 %), крайне редко определявшаяся у пациентов без этой транслокации. Однако данная высокая диагностическая эффективность была достигнута исключительно за счет высокой специфичности (97,1 %) при достаточно низкой чувствительности (37,3 %). Максимальной же специфичностью обладала экспрессия 3 мие-лоидных антигенов (99,3 %).
Среди исследованных маркеров только CD10 был экспрессирован в подавляющем большинстве случаев (более 90 % пациентов) в обеих исследованных группах, поэтому нами была предпринята попытка количественного сравнения экспрессии данного антигена при CD10-положительном ОЛЛ. Результаты сравнения представлены на рис. 1а. Несмотря на значимо более высокую MFI CD10 у пациентов с ^12;21)(р13^22)/
CV 4
ев
сч
4
cv
ев
cv
Таблица 2. Число пациентов, бластные клетки которых экспрессируют различные антигены в зависимости от наличия транслокации t(12;21) (p13;q22)/ETV6-RUNX1
Table 2. Number of patients whose blast cells express various antigens depending on the presence of translocation t(12;21)(p13;q22)/ETV6-RUNX1
Маркер Пациенты с t(12;21)(p13;q22)/ ETV6-RUNX1 (n = 118), n (%) Пациенты без t(12;21)(p13;q22)/ ETV6-RUNX1 (n = 408), n (%) P
Marker Patients with t(12;21)(p13;q22)/ ETV6-RUNX1 (n = 118), n (%) Patients without t(12;21)(p13;q22)/ ETV6-RUNX1 (n = 408), n (%)
Экспрессия CD10 CD10 expression 118 (100) 387 (94,9) 0,025
Экспрессия CD20 CD20 expression 31 (26,3) 180 (44,1) <0,001
Экспрессия CD45 CD45 expression 101 (85,6) 304 (74,5) 0,017
Экспрессия CD34 CD34 expression 108 (91,5) 337 (82,6) 0,008
Экспрессия CD33 CD33 expression 40 (33,9) 62 (15,2) <0,001
Экспрессия CD117 CD117 expression 44 (37,2) 12 (2,9) <0,001
Экспрессия CD13 CD13 expression 75 (63,6) 104 (25,5) <0,001
Экспрессия как минимум одного миелоидного антигена Expression of at least one myeloid antigen 90 (76,3) 140 (34,3) <0,001
Экспрессия не менее двух миелоид-ных антигенов Expression of two or more myeloid antigens 54 (45,8) 34 (8,3) <0,001
Экспрессия трех миелоидных антигенов Expression of three myeloid antigens 16 (13,6) 3 (0,7) <0,001
Внутриклеточная экспрессия IgM Intracellular IgM expression 0 24 (5,9) 0,014
Мембранная экспрессия IgM Membrane IgM expression 0 3 (0,7) 0,810
Примечание. Жирным шрифтом в таблице выделены показатели, имеющие статистически значимые различия (p <0,05). Note. In bold there are indicators that have statistically significant differences (p <0.05).
ETV6-RUNX1, четкого разделения только по экспрессии данного антигена получить не удалось. Проведенный ROC-анализ (рис. 1б) также показал достоверную ассоциацию MFI и наличия ^12;21)(р13^22)/Е7У6-RUNX1, однако полученный пороговый уровень, лучше всего разделяющий пациентов с наличием и отсутствием транслокации ЦП;21)(р13'я22)/ЕТУ6-ЖЖ1, позволил получить диагностическую эффективность лишь в 80,6 % случаев.
Таким образом, несмотря на существенные различия в антигенном профиле между пациентами с транслокацией ^12;21)(р13^22)/Е7Г6-К^Х1 и без нее, выявить какой-то отдельный маркер, точно разделяющий эти 2 подгруппы ОЛЛ, нам не удалось.
Такой результат, прежде всего, связан с биологической гетерогенностью ETV6-RUNX1-отрицательной группы, включающей пациентов как с известными
генетическими аберрациями (в том числе высокая гипердиплоидия, гиподиплоидный кариотип, транслокации ^9;22)^34^11), ^1;19)№3;р13), перестройки гена MLL), так и относящихся к группе «В-другие» ОЛЛ. В то же время случаи, ассоциированные с наличием транслокации ^12;21)(р13^22)/Е7Г6^^Х1, по экспрессии антигенов оказались крайне похожими между собой. Одинаковыми были не только «формальные» иммунофенотипические признаки, такие как наличие или отсутствие того или иного маркера, но и распределения клеток на точечных бифлуорес-центных графиках. Так, при совмещении цитомет-рических данных 10 пациентов с ^12;21)(р13^22)/ ETV6-RUNX1 распределение клеток в объединенном массиве данных было практически идентичным распределениям у каждого из включенных в анализ пациентов (рис. 2).
Таблица 3. Диагностическая ценность иммунофенотипических маркеров для прогнозирования наличия транслокации t(12;21)(p13.2;q22.1)/ ETV6-RUNX1
Table 3. The diagnostic test performance of immunophenotypic markers for predicting the presence of translocation t(12;21)(p13.2;q22.1)/ETV6-RUNX1
Маркер
Чувствительность
Sensitivity
Специфичность
Specificity
Предсказательная ценность положительного результата
Positive predictive value
Предсказательная ценность отрицательного результата
Диагностическая эффективность
1ельн°1° резутш.а Overall correct
¡¡Д!
Экспрессия CD10 CD10 expression 100 5,1 23,4 100 26,4
Отсутствие экспрессии CD20 The absence of CD20 expression 73,7 44,1 27,6 85,3 50,8
Экспрессия CD45 CD45 expression 85,6 25,5 24,9 85,9 39,0
Экспрессия CD34 CD34 expression 91,5 17,4 24,3 87,7 33,8
Экспрессия CD33 CD33 expression 33,9 84,8 39,2 81,6 73,4
Экспрессия CD117 CD117 expression 37,3 97,1 78,6 84,3 89,4
Экспрессия CD13 CD13 expression 63,6 74,5 41,9 87,6 72,1
Экспрессия как минимум одного миелоидного антигена Expression of at least one myeloid antigen 76,3 65,7 39,1 90,5 68,1
Экспрессия не менее двух миелоидных антигенов Expression of two or more myeloid antigens 45,8 91,7 61,4 85,4 81,4
Экспрессия трех миелоидных антигенов Expression of three myeloid antigens 14,8 99,3 84,2 79,9 80,0
Отсутствие внутриклеточной экспрессии IgM Absence of intracellular IgM expression 100 5,9 23,5 100 27,0
CV 4
es
cv
4
Обсуждение
Иммунофенотипирование бластных клеток костного мозга является одним из широко распространенных методов диагностики ОЛЛ. Ранее было показано, что при ВП-ОЛЛ у детей существует корреляция антигенного профиля опухолевых клеток с наличием известных молекулярно-генетических аберраций. По иммунофенотипу наиболее точное прогнозирование возможно для перестроек гена КМТ2А (МЫ) [28, 29], а также транслокации ^9;22)^34^11) с образованием химерного гена BCR-ABL1 [28, 30]. Кроме того, продолжаются попытки определения типичного профиля экспрессии антигенов и для других клинически значимых генетических аберраций, в том числе и t(12;21)(p13;q22)/ETV6-RUNX1.
К наиболее типичным иммунофенотипическим маркерам, характеризующим группу пациентов с на-
личием транслокации ^12;21)(р13^22)/ЕТУ6^иШ1, чаще всего относят отсутствие экспрессии CD9, CD20, CD66c [13—17], несколько реже — высокую экспрессию CD10 [31], СD40 [32], CD135 [31] и HLA-DR [31, 32], а также низкую экспрессию CD20 [13] и CD86 [32], коэкспрессию миелоидных антигенов CD13, СD33, CDw65 [5]. В то же время наиболее убедительно выглядят результаты другого исследования, указывающие на то, что экспрессия CD27 и отсутствие/слабая экспрессия CD44 специфичны для случаев с наличием транслокации t(12;21)(p13;q22)/ETV6-RUml [18, 19].
Однако далеко не все эти антигены используются для первичной диагностики острых лейкозов. Поэтому нами была предпринята попытка охарактеризовать иммунофенотип на основании имеющихся в нашем распоряжении сведений, полученных в ходе применения стандартной диагностической панели. Нами были
а
cv 4
ев
Э
СП
О
и
ETV6-RUNX1+
ETV6-RUNX1-
■ - медиана / median □ - межквартильный интервал /
interquartile interval ± - 1-й процентиль /
7я percentile Т - 99-й процентиль / 99th percentile
р = 0,008
1
0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
• - значение MFI с наилучшей диагностической эффективностью / MFI value with best diagnostic efficacy
/
/
/
/
/
/
/
/
s
Площадь под кривой 0,685/ Area under curve 0,685 р = 0,015
0,2 0,4 0,6 0,8 1
1-Специфичность / 7-Specificity
cv
4
Рис. 1. Корреляция экспрессии CD10 с наличием t(12;21)(p13;q22): а — сравнение средней интенсивности флуоресценции (MFI) CD10-BV421 между пациентами с данной перестройкой (n = 23) и без нее (n = 79); б — ROC-кривая оценки возможности прогнозирования наличия ETV6-RUNX1 в зависимости от экспрессии CD10
Fig. 1. Correlation of CD10 expression with presence of translocation t(12;21)(p13;q22): a — comparison of mean fluorescence intensity (MFI) CD10-BV421 between patients with (n = 23) and without this aberration (n = 79); б — ROC-curve analysis for prediction of t(12;21)(p13;q22)/ETV6-RUNX1 presence by CD10 expression
Рис. 2. Схожесть распределения клеток на точечных бифлуоресцентных графиках единичного пациента с ETV6-RUNX1 (верхний ряд) и 10 пациентов с данной генетической аберрацией (совмещенные цитометрические данные, нижний ряд)
Fig. 2. The similarity of cell distribution on bifluorescent dot-plots of a single patient with ETV6-RUNX1 (top row) and 10 patients with this genetic aberration (combined cytometric data, bottom row)
б
0
получены убедительные данные о том, что пациенты с ETV6-RUNX1 имеют достаточно специфический антигенный профиль, характеризующийся, прежде всего, высокой экспрессией CD10 и коэкспрессией CD13, CD33 и/или CD117. Кроме того, внутри данной группы ОЛЛ одинаковым было и распределение клеток на графиках цитометрических данных.
В то же время полученные нами результаты не позволили найти отдельный иммунофенотипический маркер, который с высокой долей достоверности мог бы
предсказывать наличие t(12;21)(p13;q22)/ETV6-RUNX1. Каждый из исследованных маркеров отличался относительно высоким значением либо чувствительности, либо специфичности, что в итоге приводило к относительно низкой диагностической эффективности. Отсутствие же хотя бы двух параметров с высокими значениями обоих основных диагностических показателей не позволило применять для разделения пациентов какие-либо иммунофенотипические комбинации. В итоге наибольшей предсказательной ценностью
обладали антигены с высокой специфичностью, но не чувствительностью, что связано с существенно большим размером группы пациентов без транслокации ^12;21).
Ранее для прогнозирования наличия транслокации t(12;21)(p13;q22)/E7У6-RUNX1 у пациентов с ВП-ОЛЛ чаще всего сравнивали наличие/отсутствие экспрессии отдельных маркеров (чаще) или их комбинаций (реже) между группами с транслокацией ^12;21) и без нее. Оценку показателей диагностической ценности применяли гораздо реже [13, 14, 31]. Например, в работе М. Borowitz и соавт. комбинация отсутствия или низкой экспрессии CD9 и СD20 обладала диагностической чувствительностью 0,88, специфичностью 0,71, предсказательной ценностью положительного результата 0,47, отрицательного результата 0,95 [13], что довольно близко к полученным нами значениям. Чуть более высокие показатели диагностической ценности были получены в работе V. Gandemer и соавт. при использовании комбинации низкой MFI CD9 (<20) и доли CD10-положительных клеток (>40 %): чувствительность 0,812, специфичность 0,921, диагностическая эффективность теста 0,900 [14]. Однако использование значений MFI в рутинной диагностике требует крайне высокого уровня стандартизации исследований, что далеко не всегда достижимо в рамках рутинной диагностики ОЛЛ [16]. Отсутствие экспрессии CD66с, которую описывают как один из наиболее специфических изолированных маркеров ^12;21)-положитель-ного ОЛЛ, также типично для ОЛЛ с перестройками гена КМТ2А и ОЛЛ с наличием транслокации ^1;19) ^23;р13)/^3-РВХ1 [15].
Несмотря на вышеупомянутые недостатки, представляется интересным и важным расширить используемую диагностическую панель, включив в нее CD27, CD44, СD9 и, возможно, ряд других маркеров, а также применять не качественное, а количественное (оценка MFI) исследование экспрессии всех антигенов, в том числе и с использованием математических методов анализа [33]. Это даст более детальный ответ на вопрос, можно ли точно предсказывать наличие транслокации ^12;21)(р13^22), однако потребует существенно большей стандартизации проведения проточной цитометрии. В случае успеха станет возможным выделение не только ETV6-RUNX1 -положительных, но и ETV6-RUNX1 -подобных пациентов [18].
Заключение
Таким образом, пациенты с ОЛЛ и наличием транслокации t(12;21)(p13;q22)/E7У6-RUNX1 имеют весьма специфический иммунофенотип, который существенно отличается от ОЛЛ без данной генетической аберрации. При t(12;21)(p13;q22)/E7У6-RUNX1 опухолевые клетки достоверно чаще имеют высокую экспрессию CD10 и коэкспрессию миелоидных антигенов. Тем не менее применение стандартного перечня иммунологических маркеров не позволяет уверенно выделить данную группу пациентов. Расширение диагностической панели, высокий уровень стандартизации проточной цитометрии и дополнительные методы анализа цитометрических данных могут позволить достаточно точное выявление пациентов, относящихся к этой клинически значимой подгруппе.
CV 4
CS
CV 4
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Romana S.P., Le Coniat M., Berger R. t(12;21): a new recurrent translocation in acute lymphoblastic leukemia. Genes Chromosomes Cancer 1994;9(3):186-91. PMID: 7515661.
2. Golub T., Barker G., Bohlander S. et al. Fusion of the TEL gene on 12p13
to the AML1 gene on 21q22 in acute lymphoblastic leukemia. Proc Natl Acad Sci USA 1995;92(11):4917-21. PMID: 7761424.
3. Romana S.P., Mauchauffe M., Le Coniat M. et al. The t(12;21) of acute lymphoblastic leukemia results in a tel-AML1 gene fusion. Blood 1995;85(12):3662-70. PMID: 7780150.
4. Shurtleff S., Buijs A., Behm F. et al. TEL/AML1 fusion resulting from a cryptic t(12;21) is the most common genetic lesion in pediatric ALL and defines
a subgroup of patients with an excellent prognosis. Leukemia 1995;9(12):1985-9. PMID: 8609706.
5. Borkhardt A., Cazzaniga G., Viehmann S. et al. Incidence and clinical relevance
of TEL/AML1 fusion genes in children with acute lymphoblastic leukemia enrolled in the German and Italian multicenter therapy trials. Blood 1997;90(2):571-7. PMID: 9226156.
6. Kobayashi H., Rowley J. Identification of cytogenetically undetected 12p13 translocations and associated deletions with fluorescence in situ hybridization. Genes Chromosomes Cancer 1995;12(1):66-9. PMID: 7534114.
7. Moricke A., Zimmermann M., Reiter A. et al. Long-term results of five consecutive trials in childhood acute lymphoblastic leukemia performed by the ALL-BFM study group from 1981 to 2000. Leukemia 2010;24(2):265-84.
DOI: 10.1038/leu.2009.257. PMID: 20010625.
8. Moorman A., Ensor H., Richards S. et al. Prognostic effect of chromosomal abnormalities in childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukaemia: results from the UK Medical Research Council ALL97/99 randomised trial.
Lancet Oncol 2010;11(5):429-38. DOI: 10.1016/S1470-2045(10)70066-8. PMID: 20409752. 9. Loh M., Goldwasser M., Silverman L. et al. Prospective analysis of TEL/AML1-positive patients treated on Dana-Farber Cancer Institute Consortium Protocol 95— 01. Blood 2006;107(11):4508-13. DOI: 10.1182/blood-2005-08-3451. PMID: 16493009.
10. Forestier E., Heyman M., Andersen M.K. et al. Outcome of ETV6/RUNXI-positive childhood acute lymphoblastic leukaemia in the NOPHO-ALL-1992 protocol: frequent late relapses but good overall survival. Br J Haematol 2008;140(6):665-72. DOI: 10.1111/j.1365-2141.2008.06980.x. PMID: 18241254.
11. Bhojwani D., Pei D., Sandlund J. et al. ETV6-RUNX1-positive childhood acute lymphoblastic leukemia: improved outcome with contemporary therapy. Leukemia 2012;26(2):265-70.
DOI: 10.1038/leu.2011.227. PMID: 21869842.
cv
4
CS
CV 4
12. Kato M., Ishimaru S., Seki M. et al. Long-term outcome of 6-month maintenance chemotherapy for acute lymphoblastic leukemia in children. Leukemia 2017;31(3):580-4. DOI: 10.1038/ leu.2016.274. PMID: 27698447.
13. Borowitz M., Rubnitz K., Nash M. et al. Surface antigen phenotype can predict TEL-AML1 rearrangement in childhood B-precursor ALL: a Pediatric Oncology Group study. Leukemia 1998;12(11):1764-70. PMID: 9823952.
14. Gandemer V., Aubry M., Roussel M. et al. CD9 expression can be used to predict childhood TEL/AML1-positive acute lymphoblastic leukemia: proposal for
an accelerated diagnostic flowchart. Leuk Res 2010;34(4):430-7. DOI: 10.1016/j.leukres.2009.09.033. PMID: 19896186.
15. Kiyokawa N., Iijima K., Tomita O. et al. Significance of CD66c expression
in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leuk Res 2014;38(1):42-8. DOI: 10.1016/j.leukres.2013.10.008. PMID: 24231528.
16. van Dongen J., Lhermitte L., Boettcher S. et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping
of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia 2012;26(9):1908-75. DOI: 10.1038/leu.2012.120. PMID: 22552007.
17. Kalina T., Vaskova M., Mejstrikova E. et al. Myeloid antigens in childhood lymphoblastic leukemia: clinical data point to regulation of CD66c distinct from other myeloid antigens. BMC Cancer 2005;5:38. DOI: 10.1186/1471-2407-5-38.
PMID: 15826304.
18. Zaliova M., Kotrova M., Bresolin S. et al. ETV6/RUNX1-like acute lymphoblastic leukemia: a novel B-cell precursor leukemia subtype associated with
the CD27/CD44 immunophenotype. Genes Chromosomes Cancer 2017;56(8):608-16. DOI: 10.1002/gcc.22464. PMID: 28395118.
19. Vaskova M., Mejstrikova E., Kalina T. et al. Transfer of genomics information to flow cytometry: expression of CD27 and CD44 discriminates subtypes of acute lympho-blastic leukemia. Leukemia 2005;19(5):876-8.
DOI: 10.1038/sj.leu.2403706. PMID: 15759032.
20. Dworzak M.N., Buldini B., Gaipa G. et al. AIEOP-BFM consensus guidelines 2016 for flow cytometric immunophenotyping of Pediatric acute lymphoblastic leukemia. Cytometry B Clin Cytom 2018;94(1):82-93. DOI: 10.1002/cyto.b.21518.
PMID: 28187514.
21. Новикова И.А., Вержбицкая Т.Ю., Мовчан Л.В. и др. Стандарт российско-белорусской кооперативной группы по иммунофенотипированию острого лимфобластного лейкоза у детей. Он-когематология 2018;13(1):73—82.
DOI: 10.17650/1818-8346-2018-13-1-73-82. [Novikova I.A., Verzhbitskaya T.Y., Movchan L.V. et al. Russian-Belarusian multicenter group standard guidelines for childhood acute lymphoblastic leukemia flow cytometric diagnostics. Onkogematologiya = Oncohematology 2018;13(1):73-82. (In Russ.)].
22. Bennett J., Catovsky D., Daniel M. et al. Proposals for the classification of the acute leukaemias. French-American-British (FAB) co-operative group. Br J Haematol 1976;33(4):451-8. PMID: 188440.
23. Bene M.C., Castoldi G., Knapp W. et al. Proposals for the immunological classification of acute leukemias. European Group for the Immunological Characterization of Leukemias (EGIL). Leukemia 1995;9(10):1783-6.
PMID: 7564526.
24. Bene M.C., Nebe T., Bettelheim P. et al. Immunophenotyping of acute leukemia and lymphoproliferative disorders:
a consensus proposal of the European LeukemiaNet Work Package 10. Leukemia 2011;25(4):567-74. DOI: 10.1038/leu.2010.312. PMID: 21252983.
25. Harbott J., Viehmann S., Borkhardt A.
et al. Incidence of TEL/AML1 fusion gene analyzed consecutively in children with acute lymphoblastic leukemia in relapse. Blood 1997;90(12):4933-7. PMID: 9389711.
26. ГОСТ Р 53022.3-2008. Технологии лабораторные клинические. Требования к качеству клинических лабораторных исследований. Часть 3. Правила оценки клинической информативности лабораторных тестов. Доступно по: http://docs.cntd.ru/document/ 1200072565. Режим доступа: 16.08.2017. [GOST(State Standard) Р 53022.3-2008. Clinical laboratory technologies. Quality requirements for clinical laboratory tests.
Part 3. Rules for assessment the clinical informativity of laboratory tests. Available at: http://docs.cntd.ru/document/ 1200072565. Access Mode 08/16/2017. (In Russ.)].
27. Bene M.C., Bernier M., Casasnovas R.O. et al. The reliability and specificity of c-kit for the diagnosis of acute myeloid leukemias and undifferentiated leukemias. The European Group for
the Immunological Classification of Leukemias (EGIL). Blood 1998;92(2):596-9. PMID: 9657760.
28. Hrusak O., Porwit-MacDonald A. Antigen expression patterns reflecting genotype
of acute leukemias. Leukemia 2002;16(7):1233-58. DOI: 10.1038/sj.leu.2402504. PMID: 12094248.
29. Попов А.М., Цаур Г.А., Вержбицкая Т.Ю. и др. Иммунофенотипическая характеристика острого лимфобластного лейкоза у детей первого года жизни. Онко-гематология 2012;7(2):14—24.
DOI: 10.17650/1818-8346-2012-7-2-14-24. [Popov A.M., Tsaur G.A., Verzhbitskaya T.Y. et al. Immunophenotypic investigation of infant acute lymphoblastic leukemia. Onkogematologiya = Oncohematology 2012;7(2):14-24. (In Russ.)].
30. Buldini B., Zangrando A., Michielotto B. et al. Identification of immunophenotypic signatures by clustering analysis
in pediatric patients with Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia. Am J Hematol 2010;85(2): 138-41. DOI: 10.1002/ajh.21595. PMID: 20095033.
31. De Zen L., Orfao A., Cazzaniga G. et al Quantitative multiparametric immunophenotyping in acute lymphoblastic leukemia: correlation with specific genotype. I. ETV6/AML1 ALLs identification. Leukemia 2000;14(7):1225-31. PMID: 10914546.
32. Alessandri A., Reid G., Bader S. et al. ETV6(TEL)-AML1 pre-B acute lymphoblastic leukaemia cells are associated with a distinct antigen-presenting phenotype. Br J Haematol 2002;116(2):266-72. PMID: 11841426.
33. Saeys Y., Van Gassen S., Lambrecht B.N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nat Rev Immunol 2016;16(7):449-62.
DOI: 10.1038/nri.2016.56. PMID: 27320317.
Вклад авторов
Ж.В. Пермикин: разработка дизайна исследования, анализ цитометрических данных, обзор публикаций, написание текста статьи; А.М. Попов, Г. А. Цаур: разработка дизайна исследования, анализ данных, написание и редактирование текста статьи; Т.Ю. Вержбицкая: анализ данных иммунофенотипирования; Т.О. Ригер: анализ молекулярно-генетических данных;
О.Р. Аракаев, А.А. Власова, С.В. Цвиренко, Л.И. Савельев: написание и редактирование статьи;
Ю.В. Ольшанская, А.Н. Казакова: получение цитогенетических данных;
Л.Г. Фечина: общее руководство исследованием, редактирование статьи, обзор публикаций.
Authors' contributions "
Zh.V. Permikin: study design development, cytometric data analysis, reviewing of publications, article writing; _j
А.М. Popov, G.A. Tsaur: study design development, analysis of data, article writing and editing; ® T.Yu. Verzhbitskaya: immunophenotyping data analysis; Т.О. Riger: analysis of molecular genetic data;
O.R. Arakaev, A.A. Vlasova, S.V. Tsvirenko, L.I. Saveliev: article writing and editing; ™
Yu.V. Olshanskaya, A.N. Kazakova: obtaining cytogenetic data; ^ L.G. Fechina: general research leadership, article editing, reviewing of publications.
ORCID авторов/ORCID of authors О
Ж.В. Пермикин/Zh.V. Permikin: https://orcid.org/0000-0003-1904-4989 -1 А.М. Попов/А.М. Popov: https://orcid.org/0000-0002-0889-6986 Т.Ю. Вержбицкая/T.Yu. Verzhbitskaya: https://orcid.org/0000-0001-9329-1828
Ю.В. Ольшанская/Yu.V. Olshanskaya: https://orcid.org/0000-0002-2352-7716 E А.Н. Казакова/A.N. Kazakova: https://orcid.org/0000-0002-1085-4646
С.В. Цвиренко/S.V. Tsvirenko: http://orcid.org/0000-0003-0185-0050 e
Л.И. Савельев/L.I. Saveliev: https://orcid.org/0000-0002-5180-6560 "
Г.А. Цаур/G.A. Tsaur: https://orcid.org/0000-0002-9881-6221 ^
Л.Г. Фечина/L.G. Fechina: https://orcid.org/0000-0002-1885-3912 _
СЭ
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. о
Финансирование. Исследование проведено без спонсорской поддержки. ее
Financing. The study was performed without external funding. a
cv
Информированное согласие. Родители пациентов подписали информированное согласие на участие детей в исследовании. ^ Informed consent. There is given the parental informed consent to the children's participation in the study.
Статья поступила: 01.11.2018. Принята к публикации: 03.12.2018. Article received: 01.11.2018. Accepted for publication: 03.12.2018.
