CC BY
25
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
АНТИИДИОТИПИЧЕСКАЯ ВАКЦИНАЦИЯ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ АУТОИММУННОМ ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТЕ
Кащенко Э.А., Белогородцев С.Н., Селедцова Г.В.
Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии, Новосибирск, Россия
Введение. Ключевую роль в патогенезе рассеянного склероза (РС) играют Т-лимфоциты, реактивные по отношению к поверхностным антигенам клеток нервной ткани. Показано, что адоптивный перенос активированных миелин-реактивных Т-клеток приводит к развитию экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) у животных. Аутореактивные CD4+Т-клетки продуцируют провоспалительные цитокины (^-2, TNFa, 1КЫу), которые поддерживают в ЦНС миелин-деструктивный воспалительный процесс. Является очевидным то, что элиминация аутоиммунных Т-лимфоцитов из организма должна лежать в основе патогенетического лечения рассеянного склероза (РС). Один из способов решения этой задачи связан с возможностью стимуляции антиидиотипического иммунного ответа, направленного на идиотипы рецепторов аутореактивных лимфоцитов. Вакцинация миелин-реактивными Т-клетками животных с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом приводит к остановке развития аутоиммунного демиелинизирующего процесса. Т-клеточная делеция является следствием литической активности антикло-нотипических CD8+Т-клеток, которые специфически распознают идиотипические структуры Т- клеточных рецепторов. Т- клеточная вакцинация также вызывает генерацию анти-клонотипических CD4+Т-клеток, которые в активированном состоянии продуцируют противовоспалительные цитокины Ш-4 и Ш-10.
Цель. Разработать Т-клеточную вакцину на основе аутореактивных эффекторных Т-лимфоцитов в экспериментальной модели аутоиммунного энцефаломиелита, и оценить ее субпопуляционный состав.
Материалы и методы. Эксперименты проводили на взрослых (4-5 месяцев) апатогенных мышах линии С57BL/6 (В6, Н-2Ь). Мышей иммунизировали подкожно смесью корпускулярного антигена головного мозга свиньи с основным белком миелина в адъюванте Фрейнда в дозе 100 мкг на мышь, на 0, 21 и 28 дни. Оценка неврологического дефицита проводилась по бальному индексу ЭАЭ. На 35 день у животных производили забор селезенки. Для приготовления антиидиотипической вакцины спленоциты культивировали с основным белком миелина в дозе 100 мкг/мл в течение недели. Затем спленоциты облучали и использовали в качестве антиидиотипической вакцины. Для оценки поверхностных маркеров пробы подвергали исследованию в проточном цитофлюориме-тре фирмы ,ВеС:оп Dikinson (США) с определением относительного содержания лимфоцитов, экспрессирующих соответствующий CD-маркер, среди 10000 просчитанных клеток. Специфичность пролиферативного ответа полученной культуры спленоцитов в отношении белков миелина подтверждали в пролиферативном тесте. Уровень пролиферативной клеточной активности определяли, используя стандартную процедуру, включавшую перенос клеток на стекловолоконный фильтр и учет радиоактивности с помощью жидкостного сцинтилляционно-
го b-счетчика. Индекс стимуляции (ИС) вычисляли по формуле: ИС = опыт (имп/мин) / контроль (имп/мин). Через 2,5 месяца после начала индукции ЭАЭ проводили курс экспериментальной терапии. Мыши получали однократную подкожную инъекцию антиидиотипической вакцины в дозе 5х106 клеток/мышь или 100 мкг/мл ОБМ п/к. Статистическую обработку результатов проводили с помощью непараметрического критерия Манна—Уитни и критерия Каплан и Майер.
Результаты. Показано достоверное (Р < 0,001) увеличение количества CD4+ в Т-клеточной вакцине (с 21,8±1,2 до 28,2±2,3, Р < 0,01). Отмечен 30% прирост абсолютного количества CD4+CD44+ и CD8+CD44+Т-клеток памяти в пуле CD4+ и CD8+Т-клеток со сдвигом в сторону увеличения центральных CD8+CD44+CD62L+Т-клеток памяти, обладающих цитотоксическим потенциалом. Количество активированных регуляторных клеток в Т-клеточной вакцине увеличивалось в разы при стимуляции антигеном (с 0,54±0,4 до 10,5±3,1 Р < 0,001). Показано уменьшение неврологической симптоматики у мышей как при лечении Т-клеточной вакциной, так и при использовании антигена в качестве иммунизирующего агента, зафиксировано снижение индекса ЭАЭ через две недели после начала лечения Т-клеточной вакциной в четыре раза (с 2,71±0,36 до 0,57±0,4).
Заключение. Несмотря на наличие клинического улучшения у мышей, мы не отметили значимых изменений параметров Т-клеточного иммунитета в процессе лечения Т-клеточной вакциной. Дальнейшая работа будет посвящена поиску подходов в увеличении количества Т-регуляторных клеток и снижении количества Т-клеток памяти в модели экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита.
ОСОБЕННОСТИ ИММУННОГО ОТВЕТА НА ИНТРАГАСТРАЛЬНОЕ ВВЕДЕНИЕ ИНДИГЕННОГО ШТАММА E. COLI У САМЦОВ И САМОК КРЫС ЛИНИИ SPRAGUE DAWLEY
Козловская Г.В., Козловский Ю.Е., Силаенкова М.М., Пономаренко Е.А., Косырева А.М.
ФГБНУ«Научно-исследовательский институт морфологии человека», Москва, Россия
Цель. Изучение особенностей реации иммунной системы и микробиома кишечника на интрагастраль-ное введение потенциального пробиотического штамма E. coli EB.
Материалы и методы. Уровни экспрессии генов про-воспалительных цитокинов в печени, селезенке и кишечнике самцов и самок крыс линии Sprague Dawley определяли методом количественной ПЦР на Rotor Gene 6000. Изменения качественного и количественного состава микробиома кишечника контрольных и опытных животных определяли посредством бактериологического анализа и методом qPCR путем амплификации специфических для каждого таксона последовательностей гена 16S rRNA. Для выделения нуклеиновых кислот, реакций ПЦР и обратной транскрипции использовали реактивы фирм Евроген, Изоген и ДНК-технологии. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistica 6.
Было установлено, что интрагастральное введение штамма E. coli EB (2 недели, в дозе 5 х 109 живых бактерий)
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
не приводило к значительному изменению иммунного статуса животных, но выявило тендерные различия по показателю уровня продукции IL-2, IL-10 и IL-4, обусловленные действием изучаемого штамма. Анализ просвет-ной и пристеночной микрофлоры подопытных животных продемонстрировал ряд изменений в качественном и количественном составе микробиома, выразившиеся в а) увеличении общего количества микроорганизмов в ЖКТ на 1 порядок; б) уменьшении титра Bifidоbaсterшm в 13 раз; в) увеличении содержания индигенных La^bad^us в 12,5 раз; г) увеличении количества представителей рода ЕШетососсш на 1 порядок. Все указанные изменения микробиома носили динамический характер.
Выводы. Продемонстрированы гендерные различия в продукции цитокинов, вызванные введением индиген-ного штамма E. coli. Интрагастральное введение живых микроорганизмов вызывало динамические изменения в микробиоме. Возрастание количества таких микроорганизмов, как лактобациллы и энтерококки, позволяет предполагать наличие у рассматриваемого штамма про-тективного действия.
Заключение. в результате работы показано, что организмы самцов и самок по-разному реагируют на введение апатогенного штамма, что необходимо учитывать в случае применения пробиотических препаратов.
АКТИВНОСТЬ ЛИМФОЦИТОВ САМОК КРЫС ПРОТИВ МНС САМЦА И РОЛЬ ИММУНОГЛОБУЛИНА G В ЕЕ РЕГУЛЯЦИИ ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ
Коренчук Ю.В., Шайдулина Р.Р., Тронина Т.И., Меньшиков И.В., Тютина А.А., Вайтина А.М.
ФГБОУ ВО «Удмуртский государственный университет», Ижевск, Россия
Введение. Беременность, представляя собой феномен естественной аллотрансплантации, требует наличия эффективных регуляторных механизмов для предупреждения возможных антифетальных иммунных реакций. Сегодня ясно, что иммунологические взаимоотношения между организмами матери и плода являются двусторонним коммуникационным процессом, определенным, с одной стороны, презентацией фетальных антигенов, а с другой — распознаванием и реагированием на эти антигены материнской иммунной системы. Механизмы регуляции активности лимфоцитов матери специфичных к МНС плода, обеспечивающие срочную иммунологическую толерантность к плоду, как полуаллогенному трансплантату, остаются не ясны.
Цель и задачи. Выяснить как изменяется активность лимфоцитов самок крыс по отношению к МНС самца и роль иммуноглобулинов плазмы крови в обеспечении толерантности к плоду.
Материалы и методы. Были использованы девственные самки крыс Wistar (n = 19) и самцы линии Wistar-Kyoto (WKY) (n = 9) и самцы Wistar (n = 10). Самки и самцы после объединения содержались парами. Беременность наступала в течение 1 или 2 недель после объединения крыс. Была исследована пролиферативная активность лимфоцитов самок крыс в однонаправленной смешанной культуре с лимфоцитами самца еженедельно после объединения животных в пару, а также непосредственно перед объединением. Лимфоциты культивировали в течение 5 дней в полной питательной среде. Активность лимфоцитов самки оценивали
по потреблению глюкозы. Для выяснения роли аутоплазмы и содержащихся в ней иммуноглобулинов в регуляции активности лимфоцитов самки, специфичных к лимфоцитам самца, лимфоциты самок перед культивированием инкубировали в течение 1 часа с аутоплазмой и с аутоплазмой, очищенной от IgG, затем лимфоциты отмывали от несвя-завшихся факторов плазмы. Плазма содержала комплемент, поэтому при инкубировании лимфоцитов с аутоплазмой мог быть реализован цитотоксический эффект антител.
Результаты. Обнаружено, что лимфоциты девственных самок отвечают на лимфоциты самцов. Предварительная обработка лимфоцитов самок аутоплазмой в 47% случаях не влияет на активность лимфоцитов самок, вызванную лимфоцитами самца, в 37% — стимулирует, в 16% — подавляет. Таким образом, примерно у половины исследованных девственных самок крыс ""^аг в плазме крови присутствуют факторы, осуществляющие регуляцию активности лимфоцитов в отношении МНС антигенов самцов ""Маг или самцов линии "КУ В основном факторы плазмы стимулируют активность лимфоцитов в отношении данных антигенов. Удаление IgG из плазмы самок девственных крыс не приводило к отмене эффекта плазмы, оказывающей ингибирующее воздействие на лимфоциты самок, но отменяло эффект плазмы, оказывающей стимулирующий эффект. Следовательно, стимулирующий эффект аутоплазмы на активность лимфоцитов девственных самок, вызванную лимфоцитами самца, ассоциирован с IgG, а ингибирующий — с другими фактора плазмы. У беременных крыс на 1 неделе беременности пролиферация лимфоцитов в ответ на лимфоциты самца в 2 раза ниже (р < 0,05, t-test), чем до беременности, на 2 неделе возвращается к уровню до беременности, а на 3 неделе — в 2 раза выше, чем до беременности (р < 0,05, t-test). В течение всей беременности в аутоплазме самок присутствуют факторы, стимулирующие пролифератив-ную активность лимфоцитов самок, вызванную лимфоцитами самца. Аутоплазма, лишенная IgG, сохраняет стимулирующую активность, но в некоторых случаях последняя снижается после удаления IgG. Данный факт позволяет предполагать, что стимулирующий эффект плазмы при беременности обусловлен не IgG, возможно иммуноглобулином класса М. Наоборот, у беременных крыс обнаруживается IgG, который ограничивает стимулирующую активность плазмы. Об этом свидетельствует увеличение стимулирующего эффекта аутоплазмы на пролиферацию лимфоцитов самки, вызванную лимфоцитами самца, после ее истощения от IgG. Возможно, сдерживание экспансии лимфоцитов самки против МНС самца и, следовательно, плода иммуноглобулинами класса G участвует в поддержании толерантности к плоду.
Заключение. Таким образом, факторы плазмы крови постоянно поддерживают активность лимфоцитов специфичных к чужеродным МНС. Во время беременности стимулирующая активность плазмы в отношении лимфоцитов специфичных к чужеродным МНС сдерживается IgG. Возможно, появление IgG, ограничивающего стимулирующую активность плазмы в отношении лимфоцитов специфичных к МНС самца, обеспечивает снижение активности лимфоцитов самки к МНС в первой половине беременности и сохранение плода.
