CC BY
68
УДК 619:616.982.2:612.017.1:636.22./28
ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У КОРОВ, РЕАГИРУЮЩИХ НА ППД-ТУБЕРКУЛИН, И БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ
Власенко В.С. - д.б.н., с.н.с.; Бажин М.А. - д.в.н., зав. лабораторией;
Дюсенова Г.М. - к.б.н., с.н.с.; Таллер Л.А. - к.в.н., с.н.с.
ГНУ ВНИИБТЖ Россельхозакадемии, г. Омск e-mail: [email protected]
Ключевые слова: туберкулез, крупный рогатый скот, хемилюминесценция, НСТ-тест, нейтрофилы, дискретно-динамический анализ.
Key words: tuberculosis, cattle, chemiluminescence, NBT-test, neutrophils, discrete-dynamic analysis.
Важным показателем неспецифической резистентности организма является функциональное состояние нейтрофильных гранулоцитов, ответственных за процесс фагоцитоза в очаге воспаления и нейтрализацию инфекционных агентов. При поглощении и переваривании чужеродных частиц фагоцитирующими клетками периферической крови происходит резкое возрастание потребления кислорода. Все эти процессы настолько интенсивны, что получили название метаболического (респираторного, дыхательного) взрыва [1].
Туберкулез, как и другие инфекционно-воспалительные процессы, не оставляет безучастными различные звенья неспецифической резистентности организма. Но, несмотря на то, что в настоящее время уже сложилось обобщенное представление об иммунофагоцитарной системе периферической крови, процесс неспецифической резистентности при туберкулезе остается до конца неизученным [2].
В связи с вышесказанным предметом нашего исследовательского интереса стало изучение особенностей функционально-метаболического статуса нейтрофилов у крупного рогатого скота, реагирующего на ППД-туберкулин, и больного туберкулезом.
Материалы и методы исследований. Состояние кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов периферической крови и их функциональную активность оценивали методом спонтанной и стимулированной люминолзависимой хемилюминесценции (ХЛ) с помощью 36-канального автоматизированного хемилюминометра CL3604 [3], а также в тесте с нитросинимтетразолием (НСТ): спонтанном и стимулированном БЦЖ вариантах с последующей фиксацией реакции с помощью многоканального иммунохимического
анализатора «Fluorofot STDLess - 486-М». Оценку концентрации образовавшегося диформазана в нейтрофилах определяли по разнице экстинкций при длине волны 630 нм и 490 нм с последующим подсчетом коэффициента стимуляции (К ст.). К ст.=оптическая плотность в стимулированных лунках / оптическая плотность в контрольных лунках
[4].
Материалом для бактериологического исследования служили заглоточные и средостенные лимфатические узлы и кусочки паренхиматозных органов от крупного рогатого скота, положительно реагирующего на ППД-туберкулин для млекопитающих. После проведения предпосевной обработки суспензии биоматериала высевали на питательные среды Левенштейна-Йенсена и ФАСТ-3Л. Идентификацию выделенных культур проводили культуральными и биохимическими методами в соответствии с Наставлением по диагностике туберкулеза животных (2002 г.). Одновременно суспензиями биоматериалов были заражены морские свинки для постановки биологической пробы [5].
Первоначально провели сравнительное испытание показателей метаболической активности нейтрофилов периферической крови. Для этого отобрали 20 животных, которых разделили на 3 группы: 1-ю группу составили 5 голов, нереагирующих на ППД-туберкулин для млекопитающих, из благополучного хозяйства (контроль), 2-ю группу - 7 животных, реагирующих на ППД-туберкулин для млекопитающих, из благополучного по туберкулезу хозяйства и 3-ю - 8 голов, реагирующих на ППД-туберкулин для млекопитающих, из неблагополучного по туберкулезу хозяйства. При бактериологическом исследовании биоматериала от коров 2-ой группы выделены атипичные микобактерии III-IV групп по Раньону и 3-й группы - культура M. bovis.
На следующем этапе с целью выявления сочетаний показателей функционально-метаболической активности клеток крови, указывающих на уровень противотуберкулезного иммунитета, иммунологические параметры всех 20-и коров были подвергнуты исследованию дискретно-динамическим анализом с последующим составлением прогностической таблицы. Помимо этого для установления более объективной картины в различии взаимосвязей между иммунологическими параметрами у экспериментальных животных в периферической крови определили содержание иммунокомпетентных клеток в абсолютном содержании (тыс/мкл): число Т-лимфоцитов с помощью спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-рок), Т-киллеров -непрямого глобулинового розеткообразования с эритроцитами быка и В-лимфоцитов - комплементарного розеткообразования с эритроцитами быка [6]. Подсчет лейкоцитов и выведение лейкоцитарной формулы проводили по общепринятым методикам.
Математическая обработка цифровых данных включала определение средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (т). Для оценки существенности различий между двумя средними величинами Мх и Му использовали 1-критерий по Стьюденту. Различие между контролем и опытом считалось статистически достоверным только для Р<0,05.
Результаты исследований и их обсуждение. Результаты исследования функционально-метаболического статуса у коров разных групп представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Средние значения показателей функционально-метаболической активности нейтрофилов
Группа животных Символы ХЛ-метод, имп/мин НСТ-тест, у.е. оп. пл. К ст. НСТ
статистики спонт. стимулир. спонт. стимулир
1 -я группа M 1162,60 1168,6 60,60 104,60 1,71
(контроль) m± 12,41 13,00 4,45 11,87 0,12
M 1173,28 1290,71 34,00 33,43 1,04
2-я группа m± 28,02 71,58 3,57 2,85 0,12
Р >0,05 >0,05 <0,01 <0,001 <0,01
M 1593,87 1633,00 71,12 28,75 0,50
3-я группа m± 181,24 189,27 13,83 8,30 0,13
Р <0,05 <0,05 >0,05 <0,001 <0,001
Значения спонтанной и стимулированной люминолзависимой ХЛ клеток крови у реагирующих на ППД-туберкулин животных не отличались от таковых у здоровых, тогда как у больных туберкулезом коров с высокой степенью достоверности (Р<0,05) увеличивались (соответственно: 1593,87±181,24 и 1162,60±12,41 имп/мин в спонтанном варианте; 1633,00±189,27 и 1168,60±13,00 имп/мин в индуцированном варианте).
Спонтанный уровень генерации кислородных радикалов в нейтрофильных гранулоцитах в НСТ-тесте у реагирующих на ППД-туберкулин и больных туберкулезом также был изменен, но если у первых он был резко снижен (соответственно: 34,00±3,57 и 60,60±4,45 у. е. оп. пл.; Р<0,01), то у последних - увеличен.
Уровень функциональной активности нейтрофилов в НСТ-тесте, стимулированном БЦЖ, был резко сниженным как у реагирующих на ППД-туберкулин, так и больных туберкулезом коров.
Центральным признаком, свидетельствующим о снижении резистентности организма и низкой микробицидной активности нейтрофилов, являлось снижение показателей стимулированной реакции НСТ по отношению к спонтанной (коэффициента стимуляции - К ст.). Так, если у здоровых коров К ст. в среднем составил 1,71±0,12, то у 100 % больных туберкулезом животных этот коэффициент снизился (0,50±0,13).
У коров, реагирующих на ППД-туберкулин, отклонения показателей НСТ-теста не во всех случаях были однонаправленными: повышенным значениям спонтанного НСТ могли сопутствовать сниженные значения стимулированного НСТ и наоборот.
Поскольку в основе функционирования любой системы лежат связи между ее компонентами, для изучения иммунной системы у животных на следующем этапе был применен дискретно-динамический подход, базирующийся на оценке системы с позиции взаимосвязей между параметрами. С этой целью всех исследуемых животных разделили на подгруппы с минимальными и максимальными значениями параметров с установкой стабильности границ базиса, а затем провели статистическую обработку цифрового материала в подгруппах, отобрали значимые сочетания параметров по t-критерию Стьюдента и построили дифференциально-прогностическую таблицу. Таблицу составляли на основании выбора тех интервалов значений сочетаний параметров, которые различались в группе здоровых и больных туберкулезом животных.
В таблице 2 представлено 11 пар таких сочетаний. Обращает на себя внимание, что из большого количества возможных сочетаний прогностически значимыми оказались именно те, которые характеризуют функционально-метаболическую активность нейтрофилов: коэффициент стимуляции НСТ (К ст.НСТ), уровень спонтанной и стимулированной ХЛ (ХЛспонт.,ХЛстим.) и НСТ-тест, индуцированный БЦЖ (НСТбцж). Все это свидетельствует о важной роли показателей метаболической активности нейтрофилов в развитии противотуберкулезного иммунитета.
Таблица 2 - Дифференциально-прогностическая таблица по оценке _иммунного статуса у крупного рогатого скота_
№ п/п Сочетание: базис (вариабельный параметр) n t-критерий по Стьюденту базис вариабельный
1 ХЛСТим. (К ст. НСТ) 20 4,90 <1180 >0,17
2 К ст. НСТ (НСТбцж) 3,99 >1,46 >82
3 НСТбцж (К ст. НСТ) 3,97 >71 >0,64
4 ХЛспонт. (К ст. НСТ) 3,93 <1170 >0,82
5 Т-киллеры (НСТбцж) 3,22 <0,88 >34
6 В-лимфоциты (К ст. НСТ) 2,95 <0,60 >0,15
7 Т-киллеры (НСТспонт.) 2,91 <0,88 >21
8 ХЛстим. (В-лимфоциты) 2,52 <1180 <0,75
9 ХЛспонт. (ХЛстим.) 2,51 <1170 <1167
10 ХЛстим. (ХЛспонт.) 2,37 <1180 <1172
11 ХЛстим. (НСТбцж) 2,36 <1180 >18
Количество животных с высокой активностью иммунокомпетентных клеток 7 35 %
В результате изучения взаимосвязей выбраны интервалы значений параметров в их сочетаниях, по соответствию которых индивидуальным показателям отдельно взятого животного были установлены особи с высокой активностью иммунокомпетентных клеток. В результате выявлено 7 коров (35 %) с высокой активностью иммунокомпетентных клеток, в том числе 5 контрольных и 2 реагирующих на ППД-туберкулин из благополучного по туберкулезу хозяйства. Иммунная система животных, инфицированных M. bovis, находится в состоянии функционального напряжения, о чем свидетельствует отсутствие животных с высокой активностью иммунокомпетентных клеток.
Выводы: 1. Особенностью кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у больных туберкулезом животных является увеличение их свечения как при взаимодействии со специфическим антигеном, так и без него. В то же время данные бактериологических исследований наряду с ХЛ исследованиями подтвердили неспецифическую природу аллергических реакций на ППД-туберкулин у крупного рогатого скота из благополучного по туберкулезу хозяйства.
2. Повышение в НСТ-тесте у больных туберкулезом спонтанного уровня генерации кислородных радикалов в нейтрофильных гранулоцитах можно расценивать как защитно-приспособительный механизм возмещения дефекта бактерицидной функции клеток. Низкие значения коэффициента стимуляции НСТ, определяемого как соотношение между индуцированным и спонтанным вариантом, являются центральным признаком, отражающим истощение противоинфекционного потенциала нейтрофилов у инфицированных животных.
3. С помощью дифференциально-прогностической таблицы, составленной на основании дискретно-динамического анализа, определены сочетания показателей активности клеток крови, позволяющих прогнозировать развитие заболевания. Изучение иммунной системы на основе взаимосвязей подтвердило важную роль показателей метаболической активности нейтрофилов в формировании противотуберкулезного иммунитета.
ЛИТЕРАТУРА: 1. Лебедев К.А. Иммунная недостаточность (выявление и лечение) / К.А. Лебедев, И.Д. Понякина. - М: Медицинская книга, Н. Новгород: Издательство НГМА, 2003. - 443 с. 2. Филинюк О. В. Цитохимическая и микробицидная активность фагоцитов крови у больных туберкулезом легких / О. В. Филинюк, Н. А. Земляная, А. К. Стрелис и др. // Бюллетень сибирской медицины. - 2007. - № 1. - С. 62-66. 3. Пат. 2296334 РФ, МПК7 G01N 33/569. Способ прижизненной диагностики туберкулеза / Г.М. Дюсенова, В.Г. Ощепков; заявитель и патентообладатель Всероссийский науч.- исслед. ин-т бруцеллеза и туберкулеза животных. - №2004124989/15; заявл. 16.08.04; опубл. 27.03.07,
Бюл. №9. 4. Пат. 2218567 РФ, MnK7G 01 N 33/52. Способ диагностики функционального состояния нейтрофилов человека / М.А. Годков, В.Ю. Зинкин.; заявитель и патентообладатель науч.- исслед. ин-т скорой помощи им. Н.В. Склифосовского. - №2001132646/14; заявл. 05.12.01; опубл. 10.12.03. 5. Наставление по диагностике туберкулеза животных. - М., 2002,утверждено ДВ МСХ РФ 18.11.2002. 6. Бажин М.А. Дискретно-динамический анализ в оценке иммунитета / М.А. Бажин, В.С. Власенко, А.Н. Новиков, Ю.И. Пацула // Методические рекомендации / СО РАСХН. ВНИИБТЖ. - Омск, 2005. - 24 с.
ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У КОРОВ, РЕАГИРУЮЩИХ НА ППД-ТУБЕРКУЛИН, И БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ
Власенко В.С., Бажин М.А., Дюсенова Г.М., Таллер Л.А.
Резюме
В статье представлены результаты оценки метаболического взрыва на основании определения активных форм кислорода в нейтрофиле (хемилюминесценция (ХЛ), тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ)) у здоровых, инфицированных атипичными микобактериями и больных туберкулезом коров. Установлено, что функционально-метаболический статус больных туберкулезом характеризуется увеличением значений люминолзависимой ХЛ клеток крови, а также истощением противомикробного потенциала нейтрофилов, о чем свидетельствовали низкие показатели коэффициента стимуляции НСТ у 100 % инфицированных M. bovis животных.
THE FEATURES OF FUNCTIONAL METABOLIC ACTIVITY PERIPHERAL
BLOOD OF NEUTROPHILS IN COWS REACTING TO PPD-TUBERCULIN
AND TB PATIENTS
Vlasenko V.S., Bazhin M.A., Dyusenova G.M., Taller L.A.
Summary
In the article there are presented the results of metabolic explosion based on the determination of reactive oxygen species in neutrophils (chemiluminescence (CL), nitrobluetetrazoliumtest (NBT)) at healthy infected atypical mycobacteria and TB patient cows. There are found that the functional metabolic status of TB patients is characterized by increased values of luminol-dependent chemiluminescence of blood cells as well as the depletion of the antimicrobial potential of neutrophils, as evidenced by low levels of factor stimulation NBT at 100% infected M. bovis animals.
