CC BY
28
УДК 579.842.23:579.222
о.в. Юрьева, в.и. дубровина, к.м. Корытов, Г.Б. Мухтургин, т.А. Нванова, O.A. Витязева, Е.Г. Токмакова, C.B. Балахонов
особенности Антиоксидлнтной активности чумного микроба с разным плАзмидным спектром
ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока
Роспотребнадзора, Иркутск, Россия
Изучена антиоксидантная активность Yersinia pestis с разным плазмидным спектром. Показано, что супероксиддисмутазная активность исследованных штаммов Y. pestis, выделенных в Горно-Алтайском и Тувинском очагах, и их изогенных субкультур не зависит от плазмидного спектра. Все изученные штаммы чумного микроба и их изогенные варианты, отличающиеся по плазмидному профилю, обладают перекись-разрушающей активностью. Степень общей перекись-разрушающей активности может быть связана с наличием в геноме плазмиды pYP.
Ключевые слова: Yersinia pestis, плазмиды, супероксиддисмутаза, перекись-разрушающая активность
characteristics of an antioxidant activity of yersinia pestis with different plasmid spectrum
O.V. Yuryeva, V.I. Dubrovina, K.M. Korytov, G.B. Mukhturgin, T.A. Ivanova, S.A. Vityazeva,
E.G. Tokmakova, S.V. Balakhonov
Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East of Rospotrebnadzor, Irkutsk, Russia
Experimental data concerning complex study of antioxidant activity of Y. pestis with different plasmid spectrum (wild-type Yersinia pestis subsp. pestis, Yersinia pestis subsp. altaica and their isogenic variants) are represented in the article. Superoxide dismutase activity of the tested Y. pestis strains was from 6.0 to 9.0 x 109 microbe cells. Significant differences between the Y. pestis strains with different plasmid composition were not detected by this parameter. Our results, consistent with the data of other authors, tell that superoxide dismutase activity is a thermo-inducible feature and does mt depend on a plasmid spectrum. High peroxide destroying activity was also detected in all tested Y. pestis strains. The differences between the strains regarding their common peroxide destroying activity were found. This parameter of the plague microbe strains lacking pYP plasmid was at least 3 times lower than common peroxide destroying activity in strains with this plasmid in the genome. In our opinion these revealed differences were caused by characteristics of plasmid spectrum. The common peroxide destroying activity's degree of Y. pestis strains can be associated with the presence of pYP plasmid in the genome. The isogenic variants of Y. pestis strains lacking one of the plasmids had smaller pathogenic activity. This fact points to the need for further study of these strains. Key words: Yersinia pestis, plasmids, superoxide dismutase, peroxide destroying activity
введение
В трансмиссии возбудителя чумы Yersinia pestis ключевую роль играют паразитирующие на грызунах блохи. В отношении млекопитающих этот патоген является факультативным внутриклеточным паразитом, способным персистировать в фагоцитирующих клетках. Проникая внутрь фагоцитов, микроб подвергается воздействию факторов противомикробной защиты. Одной из первых реакций, индуцируемых при фагоцитозе, является так называемый «окислительный взрыв». В основе последнего лежит цепь ферментативных реакций, приводящих к образованию суперокси-даниона О-2 и перекиси водорода Н2О2. Эти токсичные продукты окислительного метаболизма фагоцитов обладают повреждающим действием в отношении жизненно важных молекул и структур микроорганизма. Антиоксидантная система патогенных бактерий нейтрализует активные формы кислорода О-2 и Н2О2, образующиеся при кислородзависимом фагоцитозе, а также в результате эндогенных окислительно-восстановительных реакций. Активные формы кислорода образуются у всех аэробов и факультативных анаэробов, растущих в аэробных условиях [2].
В антиоксидантную систему микроорганизмов входят супероксиддисмутазы, превращающие О-2 в Н2О2, каталазы, расщепляющие её до молекулярного кислорода и воды, а также пероксидазы, окисляющие органические субстраты при помощи Н2О2 Субстраты пероксидаз также входят в антиоксидантную систему микроорганизмов [4].
Показано, что чумной микроб проявляет супе-роксиддисмутазную активность, однако пока сложно сделать определённые выводы в отношении разнообразия форм этого фермента у Y. pestis. Например, Н.А. Видяева с соавт. (2008) изучала супероксиддис-мутазу нескольких штаммов возбудителя чумы с разным плазмидным составом. Все изученные авторами штаммы продуцировали только одну форму супероксиддисмутазы с одинаковой электрофоретической подвижностью и не различались между собой по степени её активности, что позволило сделать вывод о независимости этого признака от плазмидного состава [1].
У возбудителя чумы обнаружено несколько функциональных протеинов, обладающих каталаз-ной и/или пероксидазной активностью. Показано, что некоторые из них непосредственно связаны со
способностью патогена выживать внутри иммуно-компетентных клеток [1, 5, 8].
В 1993 г. R.J. Mehigh и R.R. Brubaker идентифицировали секретируемый белок KatY, обладающий каталазной и пероксидазной активностью. Экспрессия этого белка происходила при 37 °С или в Са2+-дефицитной среде, а его активность в экстрактах клеток Y pestis составляла менее 10 % от общей пере-кись-разрушающей активности. Авторы установили, что протеин KatY является одним из термоиндуци-бельных антигенов возбудителя чумы, ранее известным как антиген 5 или Е (этот белок перекрёстно реагировал с антителами, полученными к антигену 5) [9]. K^tY обнаруживали как в цитоплазматической, так и в периплазматической фракциях чумного микроба. Позже было показано, что детерминанта KatY локализована на хромосоме, а его экспрессия может быть индуцирована также экзогенной Н2О2 [7]. Несмотря на то, что Н2О2 и температурный режим (37 °С) являются основными элементами фаголизосомальной микросреды, пока не получено весомых доказательств доминирующей роли KatY в механизме устойчивости Y. pestis к фагоцитарному «окислительному взрыву», поскольку делеционный мутант KatY был высоко вирулентным для мышей [7, 8, 10].
В отличие от KatY, экспрессия консервативной для многих микроорганизмов монофункциональной каталазы KatA изменяется по фазам роста культуры Y. pestis и имеет ключевое значение для традиционной физиологической роли в механизме устойчивости микробной клетки к экзогенной перекиси водорода [8].
С.Р. Салямов с соавт. (2008) охарактеризовал внеклеточную несекретируемую каталазу Y. pestis, которая неспецифически сорбируется на наружной мембране бактерий. Максимальная экспрессия этого фермента происходила при 28 °С, в связи с чем автор предположил, что данная каталаза способствует устойчивости возбудителя к летальному действию H2O2 фагоцитов непосредственно после заражения
макроорганизма блохами. По мнению авторов, на более поздних сроках инфекционного процесса главную роль в защите микроба осуществляют секретируемые каталазы, экспрессируемые при 37 °С [5].
Следует отметить, что количество опубликованных работ, посвящённых изучению роли каталаз и пероксидаз У. pestisв патогенезе чумы и локализации их детерминант, ограничено. Также нет единого мнения о вкладе плазмид чумного микроба в его анти-оксидантный потенциал.
Поскольку нейтрализация перекиси водорода бактериальными клетками может быть результатом работы совокупности антиоксидантных ферментов (каталаз и пероксидаз), в настоящей работе будет использовано понятие «общая перекись-разрушающая активность».
Целью настоящей работы является изучение общей супероксиддисмутазной и перекись-разрушающей активности У. pestis с разным плазмидным составом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали 7 штаммов У. pestis из коллекции музея ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнад-зора (табл. 1).
Все манипуляции с культурами У. ре^, связанные с образованием аэрозоля, проводили в боксе микробиологической безопасности III класса в соответствии с СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами 1-11 групп патогенности (опасности)».
Культуры выращивали на агаре Хоттингера при температуре 28 °С в течение 48 часов. Из полученных агаровых культур готовили взвесь 109 микробных клеток (м. к.) в фосфатном буфере, содержащем 0,05 М этилендиаминтетрауксусной кислоты натриевой соли (рН = 7.8 для определения супероксид-дисмутазной активности, рН = 7.0 для определения общей перекись-разрушающей активности). Взвесь инкубировали при 37 °С в течение 24 часов. Затем
Таблица 1
Характеристика тестируемых штаммов чумного микроба
Штамм Место выделения Плазмидный спектр
Y. pestis subsp. pestis И-2638 Тувинский природный очаг чумы pYP (6 мДа) pYV (45 мДа) pYT (61 мДа) pTP33 (22,5 мДа)
Y. pestis subsp. pestis И-3479* Иркутский противочумный институт pYP (6 мДа) pYT (61 мДа) pTP33 (21,5 мДа)
Y. pestis subsp. pestis И-3480* Иркутский противочумный институт pYT (61 мДа) pTP33 (21,5 мДа
Y. pestis subsp. pestis И-3560 Горно-Алтайский природный очаг чумы pYP (6 мДа) pYV (45 мДа) pYT (61 мДа) pTP33 (22,5 мДа)
Y. pestis subsp. altaica И-2359 Горно-Алтайский природный очаг чумы pYP (6 мДа) pYV (45 мДа) pYT (65 мДа)
Y. pestis subsp. altaica И-2948 Горно-Алтайский природный очаг чумы pYV (45 мДа) pYT (65 мДа)
Y. pestis subsp. altaica И-2948/3** Иркутский противочумный институт pYT (65 мДа)
Примечание: * - штаммы селекционированы из штамма Y. pestis subsp. pestis И-2638; ** - штамм селекционирован из штамма Y. pestis subsp. pestis И-2948.
определяли супероксиддисмутазную и общую пере-кись-разрушающую активность.
Для определения активности супероксиддисму-тазы в 300 мкл микробной взвеси, приготовленной в фосфатном буфере рН = 7.8, вносили 390 мл смеси 0,16 М раствора феназинметосульфата (Sigma, США) и 0,61 мМ нитросинего тетразолия (Sigma, США) в соотношении 1,5/5 мл. Реакцию начинали добавлением в реакционную смесь 210 мкл НАД Н (Sigma, США). Через 1 мин инкубации реакцию останавливали внесением 300 мкл ледяной уксусной кислоты. Реакционную смесь центрифугировали при 6000 об./мин. Результаты регистрировали на фотометрическом анализаторе ELx 808 Biotex (США) при длине волны 540 нм. За единицу активности фермента принимали такое его количество, которое уменьшало скорость неингибированной реакции на 50 %.
Для определения общей перекись-разрушающей активности в 1 мл взвеси вносили 1 мл 0,1%-го H2O2, инкубировали в течение 5 мин, затем в смесь вносили 1 мл 4%-го молибдата аммония в 10%-й H2SO4, центрифугировали в течение 5 мин при 6000 об./мин. Результаты регистрировали на спектрофотометри-ческом анализаторе ELx 808 Biotex (США) при длине волны 410 нм. Общую перекись-разрушающую активность выражали в эквивалентных каталазе единицах на 1 мл взвеси [6].
Эксперименты проводили в 8 аналитических и 3 биологических повторностях.
Статистическую обработку данных проводили при помощи стандартного пакета прикладных программ Statistica v. 6.1 (StatSoft Inc., США; лицензия № 19842001, ИПЧИ 31415926535897) с использованием t-критерия Стьюдента для независимых выборок с поправкой Бонферрони. Данные представлены в виде среднего арифметического (М) ± среднее квадратичное отклонение (s). Различия считали статистически значимыми при уровне значимости р < 0,01.
результаты и обсуждение
Определены различия между штаммами по активности супероксиддисмутазы (рис. 1). Несмотря на то, что в отдельных случаях указанные различия не
были статистически значимыми, выявлена некоторая закономерность. Так, при сравнении активности супероксиддисмутазы штамма Y. pestis subsp. pestis И-2638 (pYP+pYV+pYT+pTP33+), выделенного в Тувинском природном очаге, и его изогенного варианта Y. pestis subsp. pestis И-3479 (pYP+pYV~pYT+pTP33+), лишённого плазмиды pYV-, статистически значимых различий по активности супероксиддисмутазы не установлено (6,8 ± 1,0 и 8,4 ± 1,4 ед./5 х 109 м. к. соответственно; р < 0,01). Однако у последнего штамма активность супероксиддисмутазы существенно (в 1,8 раз) выше, чем у другого селекционного штамма Y. pestis subsp. pestis И-3480 (pYP pYV pYT+pTP33+), также полученного от исходного штамма И-2638. У штаммов, выделенных в Горно-Алтайском природном очаге, статистически значимые различия по активности супероксиддисмутазы обнаружены только между Y. pestis subsp. pestis И-3560 (pYP+pYV+pYT+pTP33+), обладающим полным набором плазмид, характерным для Тувинского природного очага, и селекционным Y pestis subsp. altaica И-2948/3 (pYP pYV pYT+). У первого этот показатель был существенно выше, чем у второго (7,0 ± 1,0 и 5,8 ± 0,8 ед./5 х 109 м. к. соответственно; р < 0,01). В целом на основании полученных данных сложно сделать выводы о роли какой-либо из плазмид в активности супероксиддисмутазы чумного микроба. Это заключение подтверждают данные других авторов, которые показали, что супероксиддисму-тазная активность является термоиндуцибельным признаком и не связана с плазмидным составом [1, 3]. Тем не менее, однозначные выводы о роли плазмид в активности супероксиддисмутазы Y. pestis можно будет сделать после более детального исследования с использованием в качестве объектов бесплазмидных и одноплазмидных штаммов.
У всех исследованных штаммов чумного микроба выявлена высокая общая перекись-разрушающая активность. Способность Y. pestis разрушать H2O2 хорошо изучена. Однако такие исследования, как правило, ограничиваются качественным определением пере-кись-разрушающей активности. Опубликованные работы, посвящённые количественной оценке этого показателя у штаммов Y. pestis с разным плазмидным
И-2638
И-3479
И-3480 И-3560
Штаммы Y. pestis
И-2359
И-2948
И-2948/3
рис. 1. Супероксидцисмутазная активность чумного микроба с разным плазмидным составом: СОД - супероксидцисмутаза.
3,0
S 2,0
Ч 1,5
ш <
£ 1,0
0,5
0,0
И-2638 И-3479 И-3480 И-3560 И-2359
Штаммы Y. pestis
И-2948
И-2948/3
рис. 2. Общая перекись-разрушающая активность Y. pestis с разным плазмидным составом: ОПРА - общая перекись-разрушающая активность.
2
составом, встречаются редко. Также немногочисленны и противоречивы сведения о корреляционной зависимости каталазной активности от вирулентности чумного микроба [1, 7, 8, 10].
Нами обнаружены различия между изученными штаммами в отношении общей перекись-разрушаю-щей активности (рис. 2). У штаммов V pestis, которые лишены плазмиды pYP (6 мДа) этот показатель как минимум в 3 раза ниже, чем у штаммов, в геноме которых присутствует эта плазмида. Следует отметить, что максимальное значение общей перекись-раз-рушающей активности у штаммов, обладающих pYP, превышало порог чувствительности использованного метода, что не позволило судить о реальной величине вышеуказанных отличий. Известными генетическими элементами плазмиды pYP, ассоциированными с вирулентностью, являются детерминанты продукции пестицина, фибринолизина и плазмокоагулазы. Не удалось обнаружить каких-либо сведений, свидетельствующих в пользу участия этой плазмиды в общей антиоксидантной активности чумного микроба. Возможно, обнаруженная нами закономерность повышения степени перекись-разрушающей активности у штаммов чумного микроба разных подвидов косвенно связана с плазмидой pYP. Важно отметить, что анти-оксидантный потенциал микроорганизмов складывается из экспрессии многих ферментных систем. Установить вклад каждой из них в общую активность возможно только при помощи более сложных и трудоёмких методов, которые не позволяют исследовать одновременно несколько штаммов. Полученные в ходе экспериментов данные являются одним из этапов комплексного изучения свойств чумного микроба и могут послужить основой для дальнейших исследований.
выводы
1. Супероксиддисмутазная активность исследованных штаммов V pestis, выделенных в Горно-Алтайском и Тувинском очагах, и их изогенных субкультур не зависит от плазмидного состава.
2. Все изученные штаммы чумного микроба и их изогенные варианты, отличающиеся по плазмидному
профилю, обладают перекись-разрушающей активностью. Возможно, степень общей перекись-разру-шающей активности связана с наличием в геноме плазмиды pYP.
литература references
1. Видяева Н.А., Гаева А.В., Куклева Л.М., Одино-ков Г.Н., Кутырев В.В. Сравнительная характеристика антиокислительных ферментов штаммов Yersinia pestis различных подвидов и Yersinia pseudotuberculosis // Проблемы особо опасных инфекций. - 2008. -Вып. 96. - С. 29-32.
Vidyaeva NA, Gaeva AV, Kukleva LM, Odinokov GN, Kutyrev VV (2008). Comparative analysis of antioxidant enzymes of Yersinia pestis strains of different subspecies and Yersinia pseudotuberculosis strains [Sravnitel'naya kharakteristika antiokislitel'nykh fermentov shtammov Yersinia pestis razlichnykh podvidov i Yersinia pseudotuberculosis]. Problemy osobo opasnykh infektsiy, (96), 29-32.
2. Галактионов В.Г. Иммунология. - М.: Академия, 2004. - 523 с.
Galaktionov VG (2004). Immunology [Immunologiya],
523.
3. Куликов О.А., Дробков В.И., Дармов И.В., Смирнов Е.В. Супероксиддисмутазы чумного микроба // Вестн. Рос. АМН. - 1996. - № 6. - С. 45-49.
Kulikov OA, Drobkov VI, Darmov IV, Smirnov EV (1996). Superoxide dismutases of Yersinia pestis [Super-oksiddismutazy chumnogo mikroba]. Vestnik Rossiyskoy akademii meditsinskikh nauk, (6), 45-49.
4. Курбанов А.И. Антиоксидантные ферменты микроорганизмов как потенциальные факторы пато-генности // Международный медицинский журнал.-2009 . - Т. 15, № 1. - С. 136-139.
Kurbanov AI (2009). Antioxidant enzymes of microorganisms as potential factors of pathogenicity [Antioksidantnye fermenty mikroorganizmov kak potentsial'nye faktory patogennosti]. Mezhdunarodnyy meditsinskiy zhurnal, 15 (1), 136-139.
5. Салямов С.Р., Гончаров Е.К. Механизм продукции несекретируемой внеклеточной каталазы
клетками Yersinia pestis // Биотехнология. - 2008. -№ 2. - С. 15-20.
Salyamov SR, Goncharov EK (2008). Mechanism of Yersinia pestis production of non-excreted extracellular catalase [Mekhanizm produktsii nesekretiruemoy vnekletochnoy katalazy kletkami Yersinia pestis]. Biotekh-nologiya, (2), 15-20.
6. Юр ьева О.В., Дубровина В.И., Иванова Т.А., Мухтургин Г.Б., Корытов К.М., Николаев В.Б., Пя-тидесятникова А.Б., Балахонов С.В. Определение протеолитической, супероксиддисмутазной и общей перекись-разрушающей активности чумного микроба с применением фотометрического анализатора. Методические рекомендации. - Иркутск, 2015. - 12 с.
Yuryeva OV, Dubrovina VI, Ivanova TA, Mukhturgin GB, Korytov KM, Nikolayev VB, Pyatidesyatnikova AB, Balak-honov SV (2015). Determination of Yersinia pestis proteolytic, superoxide dismutase and common peroxide-destroying activity using photometric analyzer. Guidelines [Opredelenie proteoliticheskoy, superoksiddismutaznoy
i obshchey perekis'-razrushayushchey aktivnosti chum-nogo mikroba s primeneniem fotometricheskogo anali-zatora. Metodicheskie rekomendatsii], 12.
7. Garcia E, Nedialkov YA, Elliott J, Motin VL, Bru-baker RR (1999). Molecular characterization of KatY (antigen 5), a thermoregulated chromosomally encoded catalase-peroxidase of Yersinia pestis. J. Bacteriol, (181), 3114-3122.
8. Han Y, Geng J, Qiu Y, Guo Z, Zhou D, Bi Y, Du Z, Song Y, Wang X, Tan Y, Zhu Z, Zhai J, Yang R (2008). Physiological and regulatory characterization of KatA and KatY in Yersinia pestis. DNA Cell Biol., (8), 453-462.
9. Mehigh R, Brubaker R (1993). Major stable peptides of Yersinia pestis synthesized during the low-calcium response. Infect. Immun., 61 (1), 13-22.
10. Motin VL, Georgescu AM, Fitch JP, Gu PP, Nelson DO, Mabery SL, Garnham JB, Sokhansanj BA, Ott LL, Coleman MA, Elliott JM, Kegelmeyer LM, Wyrobek AJ, Slezak TR, Brubaker RR, Garcia E (2004). Temporal global changes in gene expression during temperature transition in Yersinia pestis. J. Bacteriol., (186), 6298-6305.
сведения об авторах Information about the authors
Юрьева Ольга Викторовна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории патофизиологии ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35, факс: 8 (3952) 22-01-40; e-mail: [email protected]) Yuryeva Olga Viktorovna - Candidate of Biological Sciences, Senior Research Officer of the Laboratory Pathophysiology of Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East (664047, Irkutsk, Trilisser str., 78; tel.: +7 (3952) 22-01-35, fax: +7 (3952) 22-01-40; e-mail: [email protected])
Дубровина Валентина Ивановна - доктор биологических наук, заведующая лабораторией патофизиологии ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора (e-mail: [email protected])
Dubrovina Valentina Ivanovna - Doctor of Biological Sciences, Head of the Laboratory of Pathophysiology of Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East (e-mail: [email protected])
Корытов Константин Михайлович - младший научный сотрудник лаборатории патофизиологии ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора (e-mail: [email protected]) Korytov Konstantin Mikhaylovich - Junior Research Officer of the Laboratory of Pathophysiology of Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East (e-mail: [email protected])
Мухтургин Геннадий Борисович - младший научный сотрудник лаборатории экспериментальных животных ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора (e-mail: adm@ chumin.irkutsk.ru)
Mukhturgin Gennadiy Borisovich - Junior Research Officer of the Laboratory of Experimental Animals of Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East (e-mail: [email protected])
Иванова Татьяна Александровна - заведующая лабораторией экспериментальных животных ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора
Ivanova Tatyana Aleksandrovna - Head of the Laboratory of Experimental Animals of Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East
Витязева Светлана Александровна - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник отдела микробиологии чумы ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора Vityazeva Svetlana Aleksandrovna - Candidate of Medical Sciences, Senior Research Officer of the Department of Plague Microbiology of Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East
Токмакова Елена Геннадьевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела микробиологии чумы ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора Tokmakova Elena Gennadyevna - Candidate of Biological Sciences, Senior Research Officer of the Department of Plague Microbiology of Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East
Балахонов Сергей Владимирович - доктор медицинских наук, профессор, директор ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора
BalakhonovSergey Vladimirovich - Doctor of Medical Sciences, Professor, Director of Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East
