CC BY
35© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
В.Н.Царев, Е.В.Ипполитов, А.Г.Трефилов, С.Д.Арутюнов, А.А.Пивоваров
ОСОБЕННОСТИ АДГЕЗИИ АНАЭРОБНЫХ ПАРОДОНТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ И ГРИБОВ CANDIDA ALBICANS К ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ОБРАЗЦАМ БАЗИСНОЙ СТОМАТОЛОГИЧЕСКОЙ ПЛАСТМАССЫ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ШЕРОХОВАТОСТИ ПОВЕРХНОСТИ И СПОСОБА ПОЛИРОВКИ
Московский государственный медико-стоматологический университет
Цель. Изучение основных параметров поверхности фрезерованных полиакриловых материалов с помощью атомно-силовой микроскопии и первичной микробной адгезии бактерий пародонтопатогенной группы и грибов Candida albicans с учетом способа полировки образцов. Материалы и методы. Исследованы образцы: обработанные фрезой без полировки (контроль); полированные в эргобоксе; полированные в условиях зуботех-нической лаборатории; полированные резиновой щеткой в кабинете врача-стоматолога. Для постановки эксперимента моделирования первичной адгезии микробов к образцам материалов использовали штаммы микробов, относящихся к пародонтопатогенным видам (клинические изоляты), которые были выделенны из пародонтальных карманов больных пародонтитом: Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus sanguis, грибы C. albicans. Результаты. Показано, что наиболее высокой степенью адгезии к полимеру после фрезерования обладает S. sanguis, умеренной — P. gingivalis, C. albicans, низкой — F. nucleatum. Существенное снижение адгезии наблюдается при полировке в условиях зуботехнической лаборатории или в эргобоксе, менее значимое — при полировке в стоматологическом кабинете. Заключение. Полученные данные позволяют сделать заключение, что образцы из полимерных материалов для изготовления базисов протезов обладают различной степенью выраженности микробной адгезии представителей паро-донтопатогенной микрофлоры и грибов C. albicans, которая зависит от способа полировки, что соответственно определяет различия колонизационной резистентности к формированию микробной биопленки при использовании полимера в клинических условиях.
Журн. микробиол., 2014, № 6, С. 21—27
Ключевые слова: полиметилметакрилат, микробная адгезия, пародонтопатогенные штаммы, грибы Candida albicans, зондовая атомно-силовая микроскопия
V.N.Tsarev, E.V.Ippolitov, A.G.Trefilov, S.D.Arutyunov, A.A.Pivovarov
FEATURES OF ADHESION OF ANAEROBIC PERIODONTOPATHOGENIC BACTERIA AND CANDIDA ALBICANS FUNGI TO EXPERIMENTAL SAMPLES OF BASIS DENTAL PLASTIC DEPENDING ON SURFACE ROUGHNESS AND POLISHING METHOD
Moscow State Medical-Dental University, Russia
Aim. Study the main surface parameters of milled polyacrylic materials using atomic force microscopy and primary microbial adhesion of periodontopathogenic group bacteria and Candida albicans fungi taking into consideration the method of sample polishing. Materials and methods. Studied samples: mill-treated without polishing (control); ergobox polished; polished in dental laboratory conditions; polished by a rubber brush in dentists' office. Microbial strains belonging to periodontopathogenic species (clinical isolates) that had been isolated from periodontal pockets of periodontitis patients: Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus sanguis, C. albicans fungi were used for modelling experiments of primary adhesion of microbes to the material samples. Results. S. sanguis had the highest degree of adhesion to polymer after milling, P. gingivalis, C. albicans — medium, F. nucleatum — low. A significant reduction of adhesion is observed during polishing in dental laboratory conditions or ergobox, less significant — during polishing in dental office. Conclusion. The data obtained allow to make a conclusion that the samples from polymer materials for preparation of prosthesis basis have varying degree of intensity of microbial adhesion of members of periodontopathogenic microflora and C. albicans
fungi that depends on the polishing method, that accordingly determined the differences in colonization resistance against formation of microbial biofilm during polymer use in clinical conditions.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2014, No. 6, P. 21-27
Key words: polymethylmethacrylate, microbial adhesion, periodontopathogenic strains, C. albicans fungi, probe atomic force microscopy
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что микробный налет (или биопленка) и его метаболическая активность во рту являются первичными причинами ряда инфекционных процессов, включая кариес зубов, воспалительные заболевания десен и поддерживающих структур зубов [1, 6]. Полость рта создает благоприятные условия для роста обширной и разнообразной популяции бактерий. Уникальностью полости рта является то, что это единственное место в организме, содержащее твердые, не обновляющиеся поверхности для микробной колонизации. Они состоят из естественных тканей зуба, таких как эмаль, дентин, цемент корня, а также из различных материалов включая ортопедические полимерные и металлические конструкции [5].
По данным литературы основными факторами, способствующими формированию биопленки, являются: шероховатость и рельеф поверхности, характер субстрата и распределение свободной энергии на поверхности материала. Установлено, что конкретные виды бактерий при колонизации отдают предпочтение определенным частям зубов, например, некоторые из них очень плотно связываются с цементом корня, другие — с эмалью, третьи — с определенными видами реставрационных или протезных материалов [10].
Установлено, что шероховатость поверхности материала особенно важна для прикрепления бактерий, тогда как влияние свободной энергии поверхности менее существенно. Причем оказалось, что шероховатость поверхности материалов гораздо существеннее влияет на накопление бактериального налета, чем потенциально антибактериальные вещества (фтор, выделяющийся из этих материалов, или иные антибактериальные компоненты) [8, 10].
Очевидно, на первой стадии формирования биопленки зуба определяющими являются начальные взаимодействия между микроорганизмом и субстратом, то есть гидрофобные и электростатические взаимодействия [2, 9]. В настоящее время накоплено достаточно большое количество результатов исследований, в которых описываются особенности формирования биопленки в связи с различными стоматологическими материалами, такими как керамика, металлы, пластмассы и другие полимеры [5, 8]. Вместе с тем, исследований по формированию смешанной биопленки с участием пародонтопатогенных видов бактерий на базисных ортопедических пластмассах в доступной литературе не много и они, как правило, не раскрывают физико-химической основы процесса формирования микробного налета [1, 2].
Наиболее адекватным контактным методом оценки шероховатости поверхности материала и получения трехмерного изображения является атомно-силовая микроскопия (АСМ) [4, 7]. Атомно-силовое изображение имеет большую наглядность, позволяет визуально отметить особености рельефа, плохо поддающиеся анализу численными методами [3].
Дальнейшей задачей в области этих исследований следует считать разработку адекватных моделей для изучения механизмов адгезии пародонтопатогенных бактерий к базисным стоматологическим материалам для протезирования и комплексную оценку факторов, определяющих адгезию и последующую колонизацию с использованием современных методов изучения процессов формирования микробной биопленки [1, 6, 8].
Целью нашего исследования явилось изучение основных параметров поверхности фрезерованных полиакриловых материалов с помощью атомно-силовой микроскопии и первичной микробной адгезии бактерий пародонтопатогенной группы и грибов Candida albicans с учетом способа полировки образцов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для исследований методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) использовали зондовую нанолабораторию «Интегра Прима» (ЗАО «НТ-МДТ», Россия). Для получения изображения рельефа была использован метод полуконтактной сканирующей зондовой микроскопии [3]. Данный метод основан на взаимодействии с поверхностью колеблющегося на резонансной частоте кантеливера (лазерной иглы) с частотой несколько сотен кГц. При использовании данного метода контактное давление канти-ливера на поверхность существенно меньше по сравнению с контактными методами. Это позволяет проводить измерения на мягких и легко разрушающихся материалах.
Использованы образцы: обработанные фрезой без полировки (контроль); полированные в эргобоксе; полированные в условиях зуботехнической лаборатории; полированные резиновой щеткой в кабинете врача-стоматолога.
Для параллельного изучения первичной адгезии микроорганизмов (специфического прилипания к поверхности конструкционного материала для последующей колонизации и формирования биопленки) из исследуемого стоматологического материала — пластмассы типа полиметилметакрилат изготавливали пластины площадью 1 см2, которые подвергали различным типам полировки с последующей отмывкой в дистиллированной воде. До постановки теста первичной адгезии образцы обрабатывали ультрафиолетом и хранили в стерильных чашках Петри.
Для постановки эксперимента моделирования первичной адгезии микробов к образцам материалов использовали штаммы микробов, относящихся к пародонтопа-тогенным видам (клинические изоляты), которые были выделенны из пародонталь-ных карманов больных пародонтитом: Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nuclea-tum, Streptococcus sanguis, грибы C. albicans.
Идентификацию выделенных штаммов проводили с использованием протокола, рекомендованного для анаэробной бактериологической лаборатории, с применением тест-систем для идентификации анаэробных и микроаэрофильных бактерий по биохимическим свойствам API 20 A и API 20 Strep фирмы «БиоМерье» (Франция), а также по генетическим маркерам с помощью ПЦР [5, 6].
Для проведения методики оценки первичной адгезии идентичные исследуемые образцы стоматологических материалов размером 1х1 см помещали во взвесь суточной культуры микроорганизмов тест-штаммов. Количество бактерий в 1 мл взвеси составляло 108 КОЕ/мл в соответствии со стандартом мутности 0,5 McFarland; грибов — 106 КОЕ/мл. Экспозиция — 40 минут в анаэростате при 37°C (для анаэробных бактерий), а для грибов — в обычных условиях при комнатной температуре.
Процедура постановки эксперимента соответствовала стандартному методу [1, 2] с незначительными модификациями, которые заключались в следующем. Для удаления не прилипших бактерий или дрожжей образцы вначале трижды отмывали в 10 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия. Затем каждый образец помещали в отдельную пластиковую камеру, содержащую 1 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия. Далее пластиковые камеры с исследуемыми образцами обрабатывали ультразвуком в ультразвуковой ванне «Ultrasonic (НПФ «Геософт», Россия) при частоте 60 кГц в течение 10 мин, что позволяло снять и перевести во взвешенное состояние те микробные клетки, которые вступили в первичную адгезию с поверхностью стоматологического материала.
Затем из полученного смыва с образцов с помощью автоматической микропипетки проводили посев 100 мкл на 5% агар Columbia с последующим распределением микроорганизмов по поверхности питательной среды стерильной платиновой бакте-
риологической петлей. Для исследования адгезии дрожжевых грибов использовали агар Сабуро. Посевы инкубировали в анаэробных условиях при 37°C — для анаэробных бактерий и в обычных условиях при комнатной температуре — для C. albicans.
После завершения культивирования с помощью исследовательского стереоми-кроскопа Eclips («Nikon», Япония) подсчитывали количество колоний, выросших на питательных средах, определяли десятичный логарифм этой величины и рассчитывали индекс первичной адгезии для каждого образца материала и исследуемых тест-штаммов по [6].
Статистическую обработку данных осуществляли методами вариационной параметрической и непараметрической статистики для малой выборки с использованием программы «Биостат» для персонального компьютера.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
Сводные результаты по измерению шероховатости поверхности четырех образцов исследуемого материала с применением атомно-силовой микроскопии (параметры шероховатости определялись по полученным изображениям поверхностей при размере поля микроскопии 50х50 мкм) показали, что полированные образцы имеют на порядок меньшую шероховатость, чем образцы после фрезеровки. Поверхность всех образцов неоднородна, и параметры шероховатости поверхности на различных участках образца могут сильно отличаться, что отражается в измеренном стандартном отклонении.
На образцах после фрезеровки имеются неровности с определенным направлением, которое задается алгоритмом обработки образца и формой рабочей части фрезы. На полированных образцах на поверхности имеются неровности в виде выступающих частиц, которые могут быть связаны с плохим отводом продуктов износа при полировке или прилипанием частиц полировочной смеси к образцу. Наличие данных частиц приводит к увеличению разницы между среднеарифметической и среднеквадратичной шероховатостью.
Более детальное изучение образцов с помощью атомно-силовой микрокопии показало, что в образцах с обычной фрезеровкой имеются глубокие канавки глубиной порядка 10 мкм и шагом около сотни микрометров. Поверхность канавки на дне и на склоне имеют микрорельеф с невысокой шероховатостью. Микрорельеф состоит из неровностей, которые имеют то же направление, что и канавка. Вероятно, данные неровности отражают форму фрезы, использованной для данного образца.
Вероятно, дополнительная финишная обработка (очистка) поверхности может значительно уменьшить измеряемую шероховатость образцов за счет удаления выступов, представляющих собой одиночные частицы или их агломераты. Очевидно, что все эти факторы могут влиять на уровень первичной адгезии микроорганизмов при их контакте с данным видом базисного полимера (пластмассы) и последующее формирование микробной биопленки в клинических условиях и ее агрессивность для слизистой оболочки полости рта и пародонта.
Полученные нами цифровые данные, характеризующие первичную адгезию представителей пародонтопатогенной микрофлоры полости рта и дрожжевых грибов к образцам стоматологического материала с разными типами полировки показали, что для базисного стоматологического материала полиметилметакрилат отмечались принципиальные различия первичной адгезии бактериальной (P. gingivalis, F. nuclea-tum, S. sanguis) и грибковой (C. albicans) микрофлоры, в том числе в зависимости от способа полировки. В целом индексы адгезии к контрольным образцам после обычной фрезеровки соответствовали среднему уровню первичной адгезии, описанному ранее для анаэробных пародонтопатогенов (0,32 — 0,52) и грибов Candida (0,59) и высокому уровню — для стрептококков (0,94) [1, 2, 6] .
Различия по способам полировки также были отмечены, и в ряде случаев они были статистически достоверны, что соответствовало результатам, полученным с помощью атомно-силовой микроскопии.
Хотя мы и наблюдали несколько иную картину в отношении образцов материала, обработанных разными способами (полированных), но общая закономерность, выявленная с контрольными образцами, сохранялась — более низкий уровень адгезии отмечен у штамма фузобактерий, средний (умеренный) — у порфиромонад и грибов C. albicans, самый высокий — у микроаэрофильных стрептококков.
Так, при исследовании адгезии тест-штаммов к образцам, полированным в эрго-боксе, отмечен минимальный уровень первичной адгезии всех тест-штаммов, как бактерий, так и грибов в пределах от 0,24 (фузобактерии) до 0,37 (кандиды). Более высокий уровень первичной адгезии также продемонстрировали микроаэрофильные стрептококки (0,84+0,03, P<0,05) как по сравнению с контролем, так и по сравнению с другими видами полировки.
На образцах, полированных в эргобоксе, не видно полос полировки, но имеются одиночные частицы подобно тем, что наблюдались на образцах, полированных в лаборатории. В отличие от образцов, полированных в лаборатории, таких частиц на поверхности меньше, и они менее склонны к образованию агломератов. В то же время, рельеф поверхности полированных в эргобоксе образцов имеет несколько больший перепад высот по сравнению с рельефом образцов, полированных в лаборатории. Поэтому можно предположить, что более грубые частицы и зазубрины в условиях клинического применения материала с такой формой обработки могут послужить хорошей основой для формирования массивной микробной биопленки, что может иметь отрицательное влияние на слизистую оболочку полости рта и пародонт.
При исследовании адгезии тест-штаммов к образцам, полированным в зуботех-нической лаборатории, отмеченная закономерность была аналогичной. Индекс адгезии анаэробов и грибов составил от 0,22 (фузобактерии) до 0,49 (кандиды). Более высокий уровень первичной адгезии продемонстрировали лишь микроаэрофильные стрептококки (0,90+0,04; P<0,05) как по сравнению с контролем, так и по сравнению с другими видами полировки.
Методом атомно-силовой микроскопии отмечено, что на полированных образцах отсутствуют микронные неровности, характерные для фрезерованных образцов, то есть поверхность становится менее шероховатой. Однако на образцах, полированных в лаборатории, видны полосы от полировки глубиной в несколько десятков нанометров и шагом несколько микрометров. На поверхности присутствуют частицы, принимающие форму острых выступов — зазубрин на АСМ-изображении. Частицы собраны в агломераты и неоднородно распределены по поверхности образца. Данные частицы могут являться продуктами износа материала образца или частицами полировочной смеси. Такие частицы часто имеют невысокое сцепление с подложкой и легко отделяются от поверхности при слабом механическом воздействии.
Последнее объясняет, почему степень адгезии к образцам, полированным в лаборатории, была несколько выше по сравнению с образцами, полированными в эрго-боксе, где сцепление частиц и зазубрин более выражено — большое количество микробных клеток, прилипших к зазубринам, отделяется от образцов вместе с ними при проведении посева на питательную среду, что несколько повышает показатель адгезии по сравнению с обработкой в эргобоксе. Возможно, данным образцам следует провести дополнительную «финишную» очистку поверхности после полировки, которая устранит эти неровности. Способ и параметры такой процедуры следует подбирать после анализа состава и механических свойств данных частиц.
При исследовании адгезии тест-штаммов к образцам, полированным в условиях стоматологического кабинета, отмечали наименее выраженные отличия от контрольных фрезерованных образцов.
Индекс адгезии анаэробов и грибов был умеренным и составил от 0,45 (порфиро-монады) до 0,51 (кандиды). У фузобактерий адгезия была достоверно ниже (0,28). Уровень адгезии микроаэрофильных стрептококков, напротив, был крайне высоким и не отличался от контрольных (неполированных) образцов (0,94+0,04; P>0,05).
На образцах, полированных в клинике, не видно полос полировки, имеются одиночные частицы подобно тем, что наблюдались на всех полированных образцах. Значительных агломератов не наблюдается. Перепад высоты неровностей на поверхности образцов достигает сотни нанометров, что является наибольшим значением среди полированных образцов. Описанная микроскопическая
картина, на наш взгляд, может привести к формированию массивной биопленки в клинических условиях и обусловить повреждение слизистой оболочки полости рта и пародонта токсинами и ферментами пародонтопатогенных бактерий и грибов C. albicans.
Принципиально важным, на наш взгляд, является достаточно выраженный уровень адгезии F. nucleatum, выявленный нами в контрольных образцах и при полировке в условиях стоматологического кабинета. Известно, что именно этот вид, являющийся самым многочисленным в интактных участках тканевых поверхностей полости рта, обеспечивает коадгезию с такими ведущими пародон-топатогенными видами как P. gingivalis и Treponema denticola [6]. Данное обстоятельство подтверждают результаты сканирующей электронной микроскопии образцов (рис.).
Известно, что F. nucleatum коагрегирует не только с ранними, но и с поздними колонизаторами слизистой оболочки десны [2, 10]. К последним относятся: A. actinomyce-temcomitans, P. gingivalis, T denticola, Eubacterium spp., Veillonella spp. Очевидно, F. nucleatum действует как «мост» между ранними и поздними колонизаторами при формировании биопленки.
ОБСУЖДЕНИЕ
Полученные данные позволяют сделать заключение, что образцы из полимерных материалов для изготовления базисов протезов обладают различной степенью выраженности микробной адгезии представителей пародонтопатогенной микрофлоры и грибов C. albicans, которая зависит от способа полировки, что соответственно определяет различия колонизационной резистентности к формированию микробной биопленки при использовании полимера в клинических условиях.
Шероховатость поверхности стоматологических базисных материалов, рельеф поверхности, наличие конгломератов материала и зазубрин, а также степень их сцепления с материалом, используемым для зубного протезирования, имеет существенное значение в формировании биопленки на данных материалах с участием резидентных (S. sanguis) и пародонтопатогенных видов анаэробных бактерий (P. gingivalis, F. nucleatum) и грибов C. albicans, что позволяет обосновать выбор определенных способов полировки.
Образцы полимерных материалов, полученные при обработке в эргобоксе и зу-ботехнической лаборатории, характеризуются минимальным уровнем адгезии по сравнению с другими способами, что позволяет сделать заключение, что полимеры, обработанные данными способами, обладают более выраженной колонизационной резистентностью в отношении штаммов пародонтопатогенных бактерий и дрожже-подобных грибов. Средние значения колонизационной резистентности имеют полимеры, обработанные в условиях стоматологического кабинета, а минимальные — неполированные.
Наиболее высокий уровень адгезии к полимерам отмечен у штамма S. sanguis — достоверное снижение индекса адгезии отмечено только при использовании полировки в эргобоксе. Однако факт высокой колонизации образцов S. sanguis нельзя однозначно считать отрицательным, поскольку он является представителем нормальной микробной флоры полости рта, в отличие от других видов, использованных для исследования первичной адгезии в настоящей работе.
Коаггрегация F. nucleatum и P. gingivalis (фрагмент микробной биопленки).
Сканирующая электронная микроскопия.
ЛИТЕРАТУРА
1. Арутюнов С.Д., Ибрагимов Т.И., Царев В.Н., Савкина Н.И., Трефилов А.Г. Микробиологическое обоснование выбора базисной пластмассы съемных зубных протезов . Стоматология. 2000, 3: 4-8.
2. Кучерова М.А., Трефилов А.Г. Индекс адгезии микроорганизмов к полимерным базисным материалам как индикатор оценки антимикробных средств. Стоматолог. 2008, 5: 38-44.
3. Мальков О.В., Литвиненко А.В. Измерение параметров шероховатости поверхности детали. М., Изд. МГТУ им. Баумана, 2012.
4. Миронов В.Л. Основы сканирующей зондовой микроскопии. Н. Новгород, 2004.
5. Царев В.Н., Давыдова М.М. Методы микробиологического исследования, применяемые в стоматологии. В: Микробиология, вирусология и иммунология. В.Н. Царев (ред.). М., Практическая медицина — ГЭОТАР-Медиа, 2009.
6. Царев В.Н., Ибрагимов Т.И., Трефилов А.Г. Применение методов микробиологического мониторинга в процессе ортопедического лечения пациентов с вторичной полной адентией. Стоматолог. 2008, 2: 45-51.
7. Binnig G., Quate C. F. Atomic force microscope. Physical Review Letters. 1986, 56 (9): 930933.
8. Donlan R.M., Costertone J.W. Biofilms: survival mechanisms clinically relevant microorganisms. Clin. Microbiol. Rev. 2002, 15 (2): 167-193.
9. Eick S., Glockmann E.. Adherence of Streptococcus mutans to various restorative materials in a continuous flow system. J. Oral. Rehabil. 2004, 31: 278-285.
10. Quirynen M., Bollen C.M. The influence of surface roughness and surface-free energy on supra- and subgingival plaque formation in man. J. Clin. Periodontol. 1995, 22: 1.
Поступила 27.02.14
Контактная информация: Царев В.Н., д.м.н., проф.,
127473, Москва, ул. Делегатская, 2., стр. 1
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
С.Л.Мукомолов1,4, T.Tallo2,3, Е.В.Синайская1, П.Н.Кислый1, Г.Ф.Трифонова1, В.В.Герасимова1, H.Norder5
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭПИДЕМИОЛОГИЯ ГЕПАТИТА С В ЦЕНТРАХ ГЕМОДИАЛИЗА В САНКТ-ПЕТЕРБУРГЕ
1НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, Санкт-Петербург; 2Агенство
общественного здравоохранения Швеции, Стокгольм, Швеция; 3Национальный институт развития здоровья, Таллинн, Эстония; 4Санкт-Петербургский государственный университет; 5 Гетеборгский университет, Гетеборг, Швеция
Цель. Исследование молекулярной эпидемиологии гепатита С (ГС) в пяти отделениях гемодиализа (ОГД) в Санкт-Петербурге. Материалы и методы. В 2010 г. методом лимитированного сиквенирования NS5B региона генома вируса ГС были получены последовательности нуклеотидов у 93 выделенных изолятов, включая 67 изолятов от пациентов пяти ОГД и 26 изолятов от пациентов, у которых не было гемодиализа в анамнезе.
Филогенетический анализ выполняли с помощью пакета программ РНУЬЩ версия 3.69.
Эволюционные различия оценивали в программе DNADIST, используя алгоритм F84.
