CC BY
18БЮТЕХНОЛОПЯ ТА БЮБЕЗПЕКА
Лещук Н.В., УДК 631.526.32:635(477)
кандидат сльськогосподарських
Шаюк Л.В.,
кандидат бюлог1чних наук, Майстер Н.В.
УкраТнський шститут експертизи сорлв рослин
Основы напряЛи трансгенезу в ово%1внщтЫ та башташщтвя: теор1я та практика
Висвтлено прюритетн1 напрями селекци овочевих та баштанних рослин. Обфунтовано широке р1зноман1ття метод1в переносу чужор1дно! генетично! шформаци за створення трансгеннихрослин овочевих / баштанних вид'в. Розкрито суть метод1в 1дентифкаци нових г1брид1в як продукт1в генной нженери: роду капусти, пом1дора 1ст1вного, моркви, кабачка, салату поавного, гороху поавного, квасол1 звичайно1, баклажана та перцю однор1чного. Наведено головн1 напрями трансгенезу сорт1в ботан1чних таксон1в овочевих / баштанних рослин у м1жнароднш та втчизнянш практищ. Вивчено м1жнародну практику державно1 апробаци та реестраци генетично модифкованих конструкцш у бюлог1чних об'ектах (сорти рослин) та в продуктах аньо1 переробки. Проведено монторинг продукт1в харчування / фармаколог1чних речовин, створених на основ1 генетично модифкованих конструкцш сорт1в / г1брид1в групи овочевих I баштанних рослин.
Ключовi слова:
методи трансформацп генноТ шформаци, ГМО, напрями трансгенезу овочевих рослин.
Вступ. Сучасному перюду науково-техычного прогресу характеры! швидк темпи роз-витку нов1тн1х технолопй, до яких належить I генна шженер1я. У розвинених краТнах £вропи, США, 1зраТлю, Японп, Китаю та П1вденноТ КореТ дана галузь е прюритетним напрямом д1яль-ност1 у науковм I виробничм сферах бютехнологп [1]. У вс1х програмних документах страте-г1чного характеру, що прийма-ються останн1ми роками ООН, £С, урядами окремих краТн, пе-редбачен1 положення проблем дослщження генетично моди-фкованих орган1зм1в та Тхнього практичного застосування [2].
В УкраТы генна 1нженер1я, як складова нов1тн1х б1отехнолог1й, також вщнесена до пр1оритетних напрям1в розвитку науки I тех-н1ки й стратепчних пр1оритет1в нновацмноТ д1яльност1. Овоч1в-ництво також зумовлюе досить неоднозначне сприйняття про-цесу поширення сфери застосування продукцп з генетично модифкованими складовими як
спец1ал1стами галузей науки та виробництва, представниками управлнських державних структур, так I широкими верствами населення.
Негативне ставлення частини суспшьства до досягнень генноТ нженерп пов'язане, насампе-ред, з вщсутыстю переконливих науково обфунтованих гарант1й щодо безпеки генетично моди-ф1кованих орган1зм1в (ГМО) для здоров'я людини та довюлля за-галом.
Науково обфунтоване за-перечення досягаеться шляхом ч1ткоТ регламентацп порядку ве-дення науково-досшдних роб1т щодо ГМО у закритих системах, установлення правил вивтьнен-ня генетично модифкованих ор-ган1зм1в у довк1лля, проведення ТхньоТ польовоТ апробацп та дер-жавноТ реестраци, цивкшзовано-го розм1щення ГМО у продукцп на ринку, здмснення постмного багатор1вневого контролю за до-триманням та виконанням в1д-пов1дних нормативно-правових положень тощо [3]. Особливо
це актуально для сорт1в овочевих I баштанних рослин, товарна продукц1я яких е сировиною для харчовоТ (особливо дитяче, д1-етичне харчування), переробноТ та фармаколопчноТ промисло-востк
Результати дослiджень.
Швидке поширення здобутюв генноТ ¡нженерп у св1т1 не могло оминути й УкраТну. У 80-т1 роки ХХ стол1ття в краТн проводились роботи з отримання асиметрич-них соматичних г1брид1в I ци-брид1в.
У результат! вивчення м1ж-видових I м1жтрибних пбрид1в отриман1 важлив1 результати в1дносно невипадкового про-сторового розташування хромосом. Виявлене та вивчене явище двобатьювського успадкування цитоплазматичних ген1в у соматичних пбридах було зарее-стровано в СРСР як вщкриття п1д № 362. У 1984 р. за цикл досл1-джень галузевоТ програми «Разработка фундаментальных основ клеточной (генетической) инженерии растений» ряд науковц1в
Ochobhí напрями трансгенезу в obo4Íbhi/i^tbí та баштанництвi: теорт та практика
(Ю.Ю. Глеба, 1.К. Комарницький, В.А. Сидоров) вiдзначенi Державною премiею СРСР [4].
Сьогодн серед вiтчизняних науковцiв вiдсутня консолща^я щодо створення та практичного використання генетично моди-фiкованих органiзмiв.
Немало вчених i суспiльних ди ячiв стверджують про пщвище-ну небезпечысть використання продукцiT, створено!' на основi ГМО. Така позицiя гальмуе роз-виток бiотехнологiчноT' галузi УкраТ'ни.
Запровадження заборони на використання продукцп, отри-манот з використанням генетично модифкованих органiзмiв, може стати причиною зник-нення лiкiв, фармпрепаратiв та нших продуктiв, якi не мають альтернативи. Необхiднi науковi експериментальнi досшдження для зважених та обГрунтованих висновюв щодо формування позитивно!' чи негативно!' думки суспшьства.
Аналiз мiжнародних i вiтчиз-няних нормативно-правових документiв сприяв напрацю-ванню необхiдноT' iнформацiT' для подальшо''' роботи, зокрема, розробки методолопчних засад щодо визначення впливу генетично модифкованих органiзмiв на довкiлля та здоров'я людини.
Отже, враховуючи зростаю-чий нтерес до бiотехнологiчноT' продукцп овочiвництва та збшь-шення посiвних площ пiд ГМ-культурами, у рамках державних нщатив потрiбно поглибити науковi дослiдження з оцiнки ризику за умов упровадження генночнженерно''' дiяльностi.
На основi вищезазначеного, учасники процесу розроблення та комерцiалiзацiT ГМО i продук-тiв, створених з 'х використанням, формують свое ставлення до згаданих процеав, наполяга-ючи на бшьш чи менш жорстко-му 'х регулюваннi.
Вiтчизняне законодавство, нормативно-правова та методична база, що стосуеться здм-снення генно-шженерно''' дiяль-ностi, процедури оцнки ризикiв ГМО, реестрацп та регулювання обiгу ГМО за багатьма ключо-вими позицiями не вiдповiдае кнуючм мiжнароднiй практицi. Тiльки в результат тривалого, глибокого, рiзностороннього дослiдження проблеми вчен Укра'ни зможуть дати вщповщь на всi питання суспiльства.
Досягнення сучасно'' генно'' нженерп в овочiвництвi Укра-|'ни базуеться на створены од-ые'' з найбiльших у свт колек-цiй клiтинних лнм, екстрактiв i банку зародково'' плазми рос-лин свтово''' флори: стмюсть до гербiцидiв, шкiдникiв i понижено'' температури; модифiкацiя жирно-кислотного складу олп; здатнiсть до продукування фар-макологiчних бiлкiв i виробни-цтва бюдеградуючих полiмерiв; чоловiча стерильнiсть / в^нов-лення фертильностi [5].
Головы напрями трансгенезу сор^в овочевих рослин поля-гають у створеннi трансгенних сор^в, гiбридiв i лiнiй стмких до:
- гербiцидiв (томат, капуста бшоголова, перець, морква, горох, спаржа, салат);
- вiрусiв (томат, кабачок, опрок, диня, перець, горох, квасоля, салат);
- шкiдливих комах (томат, капуста бшоголова, баклажан, горох);
- фтопатогенних грибiв (томат, морква);
- фтопатогенних бактерiй (томат, диня);
- високих концентрацм солей у Грунтовому розчин (диня);
- тдвищено''' лежкост плодiв (томат, перець, диня);
- тдвищеного амiнокислотного складу рослин (квасоля);
- пониження вмiсту нiтратiв
i пщвищення вмкту залiза (салат);
- створення форм Í3 чоловiчою цитоплазматичною та ядерно-цитоплазматичною стериль-ыстю (кабачок, капуста бшо-голова).
Використовуючи досягнення геномiки, розробки нових швидких методiв сиквенсу та визначення функцм генiв постiйно зростае кiлькiсть корисних генiв, що використовуються в геннiй iнженерiT рослин.
З усього рiзноманiття мето-дiв переносу чужорщно'т' гене-тично'т' iнформацiT' за створення трансгенних сор^в овочевих i баштанних рослин найширше застосовуються:
- агробаю^альна та бюбалк-тична трансформащя;
- уведення генiв у iзольованi протопласти;
- пакування ДНК у лтосоми;
- мкрон'екцп ДНК, електропо-ра^я;
- використання векторiв на основi вiрyсiв;
- вакуумна iнфiльтрацiя ДНК у незркш сyцвiття.
На ниышньому етапi актуаль-нi розробки 1нституту клiтинноT' бiологiT' та геннот нженерп НАН Укратни з отримання соматич-них гiбридiв i генетично модифи кованих рослин видiв, що мають важливе практичне значення: гороху поавного, тома^в, кар-топлi, баклажана, капусти.
Для окремих овочевих культур традицмы методи отримання ГМ рослин е довготривалими та малоефективними, однак новi технологiT дають можливiсть прискорити тх одержання. В таких експериментах використо-вують мiжвидовy гiбридизацiю, у якiй один з партнерiв - дикий вид (Nicotiana africana, Arabidop-sis thaliana, Oryhophragmus viol-aceus), що легко трансформуеть-ся i дае нестабшьний пбрид з культурним видом. Пiд час к-
Основы напрями трансгенезу в 0B04iBHi/i^mi та баштанництвi: теорiя та практика
Закрите 1-^ Польова Вивтьнення
використання експертиза 1-L— на ринок
Лабораторт
ПРОДУКТ
Рис. Послщовшсть створення ГМ продуктiв овочiвництва вiд лаборатори до виходу продукту.
нування такого нестабiльного гiбрида вщбуваеться перенос трансгена з первинного трансформанта на комерцмний сорт та елiмiнацiя (загибель) генетич-ного матерiалу дикого виду. Для таких рослин актуальним зали-шаеться використання системи сайт-специфiчно'' рекомбнацп бактерiофага Р1 та мобшьних ге-нетичних елементiв у конструк-цiях для трансформаций що дае можливiсть направленого переносу геыв. Перенесення генiв з первинного трансформанта у комерцмний сорт стае можли-вим через 1-2 поколння замiсть 5-8 поколiнь.
Новим перспективним пщ-ходом генно' нженерп рослин являеться створення векторiв на основi мiнi-хромосом рослин. Використання штучних хромосом рослин допомагае долати бiльшiсть недолив iснуючих систем, а саме: обмежену ем-нiсть, убудовування трансгена в геном рецитента, нестабшь-ну експреаю. Мiнi-хромосомнi вектори рослин, що автономно реплкуються, створять можли-вiсть одноетапного переносу багатьох генiв з метою надання рослинам комплексних ознак.
Сучасн напрями трансгенезу сор^в рослин групи овочевих i баштанних рослин зумовле-нi особливостями генетично'' трансформац'' пластично'' ДНК. Переваги трансформацп пласто-мiв полягають у багатокопмова-ност молекул хлоропластиково'' ДНК, високий рiвень продук-цп трансгенiв; материнському
успадковуваны пластидного генома; сайт-специф1чному меха-н1зму убудовування трансген1в; прокар1отичному типу експресп ген1в i можливост1 полщистрон-но'' експресп.
Сьогодн1 вдосконалюються бютехнолопчы п1дходи отри-мання ГМ рослин вид1в з роди-ни Fabaceae, а саме: розроблено споаб видшення та культиву-вання мезоф1льних протопласт1в гороху пос1вного (Pisum sativum L.). Використовуючи метод елек-тропорацп протопласт1в, отри-мано трансгенн1 кл1тинн1 л1н1Т та рослини гороху, що м1стять гени Ac, npt II, Ds-елемент та gus. За допомогою методу бомбарду-вання м1крочастинками золота отримано трансгенн рослини гороху, що м1стять селективн1 гени npt II та gus. Стабшьна 1нтеграц1я перенесених ген1в у геном отри-маних кл1тинних л1н1й та рослин доведена за допомогою юлькох молекулярно-бюлопчних та бю-х1м1чних метод1в: ПЛР, блотин-г1бридизац1'' за Саузерном, NPT II ELISA, тесту на GUS-активыаъ та визначення активной NPT.
Перенесен! в геном гороху гени Ac та npt II стабшьно успад-ковуються та експресуються в наступних покол1ннях. Методики трансформацп л1н1й гороху розроблено за допомогою A.tumefaciens, електропорац1'' протопласт1в i бомбардування м1крочастинками золота.
За допомогою агробактер1-ально'' трансформац1'' отримано трансгенн рослини гороху, що м1стять гени Ac, npt II, Ds-елемент
та gus; трансгены рослини лю-церни (M. lupuline L.), що м1стять ген nptII. Використовуючи для трансформацп «shooty» мутант A.tumefaciens pGV2206, отримано високорегенерацмы л1н1Т гороху.
Залишаючи поза увагою так1 позитивы сторони застосу-вання ГМ сорт1в овочевих, як спрощення технолог1й вирощу-вання, в1дсутн1сть забруднення навколишнього середовища пестицидами, значне п1дви-щення врожайност1, зниження енергозатрат, соб1вартост1, ц1н на продукти харчування, наве-демо приклади ГМ конструкцм, що використовуються як проду-центи ц1нних фармаколог1чних речовин.
Так, з використанням Аgrobac-terium-опосередкованоТ трансформацп вченими створено трансгенн рослини цикор1ю Cichorium intybus (сорт Пала росса) з цшьовим геном ifn- a2b, що кодуе нтерферон, з частотою трансформацп експлант1в 26,9%.
Загальна схема створення ГМ продукт1в овоч1вництва представлена на рисунку.
Методом Аgrobacterium-опо-середкованоТ трансформацп отримано рослини салату Lactuca sativa (сорт1в £ралаш, Руб1нове мереживо та Сыжин-ка) з генами, що кодують ту-беркульозн1 антигени ESAT6 та ESAT6:Ag85B(^A) з частотою трансформацп в1д 18% (Сн1жин-ка) до 62% (£ралаш).
Трансгенн1 рослини салату латук, що кодують туберкульозн1 антигени та цикор1ю з генами, що шифрують 1нтерферон, мо-жуть бути використан як Тст1в-н1 вакцини для профшактики захворювання на туберкульоз та л1кування в1русних захворю-вань.
Упровадження сучасних бю-технолог1й для пщвищення ефективност1 селекцп овоче-
Основы напрями трансгенезу в obo4Ïbhi^bî та баштанництвi: теорiя та практика
вих рослин g актуальним. Для цього n0Tpi6H0, насамперед, створити вiдповiдну фнансово-матерiальну базу й розробити перспективну програму стльно!' прац бiотехнологiв i селекцю-нерiв.
Висновки. Необхiдно врегу-льовувати питання щодо досли дження, виробництва та викорис-тання ГМО i продукцп з ïx умiстом. Розв'язання цих проблем потре-
буе прийняття виважених ршень щодо забезпечення нешюдливо-го (незагрозливого) використан-ня ГМ рослин i продуклв !'хньо!' переробки. Обов'язково врахо-вувати як переваги, так i можливi негативнi наслiдки вщ застосу-вання ГМО.
Актуальними напрямами створення ГМ сорлв овочевих культур g надання !'м стмкос-т до бiотичниx та абiотичниx
факторiв, пiдвищення лежкостi, покращення амiнокислотного складу i вмкту мiкроелементiв. Напрацювання у контекст но-вiтнix бiотеxнологiй дають мож-ливiсть швидко виявляти потен-цiйно кориснi гени, придатнi для використання в геннм нженерп рослин, а, використовуючи пер-спективнi тдходи, отримання ГМ сортiв стае можливим через одне два поколння.
ВИКОРИСТАНА Л1ТЕРАТУРА
1. Holdrege C. Understanding the unintended effects of genetic manipulation. An introduction // Unintended Effects of Genetic Manipulation - A Project of The Nature Institute. - New York, 2008.
2. Картахенский протокол по биобезопасности к конвенции о биологическом разнообразии. - Монреаль: секретариат Конвенции о биологическом разнообразии. 2000. - 40 с.
3. Сорочинський Б.В. Непередбачен ефекти генетич-них модифкацм рослин та методи ïx аналiзу /
Б.В. Сорочинський, О.М. Бурлака, В.Д. Науменко, А.С. Секан // Цитология и генетика. - 2011. - № 5. -С. 65-75.
4. Джеймс К. Основные положення обзора «Статус коммерческих Биотехнологических / ГМ культур в мире: 2009 год». http: www.isaaa.org/ publications/ briefs/41/ highlights/pdf/ Brief41-Highlights-Russian, pdf.
5. Matzke M.A., Mette M.F., Matzke A.J.M. Transgene silencing by the host genome defense: implications for the evolution of epigenetic control mechanisms in plants and vertebrates // Plant Mol. Biol. - 2000. - 43. - P. 401-415.
Владиславу АндршоВшу -70!
Колективи державно!' системи охорони прав на сорти рослин та Укра!'нського нституту експертизи сор^в рослин сердечно втають ведомого вченого у галузi овочiвництва академка НААН, доктора стьськогосподарських наук, професора, заступника академка-секретаря Вщдтення рослинництва НААН Кравченка Владислава Андрмовича з 70^ччям в^д Дня народження!
Бажаемо Вам, Владиславе Андрмовичу, мщного здоров'я, прихильност дол^ невичерпно!' енергп й наснаги. Нехай Ваша наполеглива i самовщдана праця й надалi приносить щедрi здобутки, а на життевому шляху незмнними супутниками будуть тднесений настрм та щира вдячысть ств^чизниюв за добрi справи на благо аграрно!' науки Укра'ни.
