CC BY
38
©ЛАЗАРЕНКО Л.И., ЖУКОВ Е.Л., КРУГОМ С. В., ПУЗЫРЬ А.П., МАНАШЕВ Г.Г., БОНДАРЬ В.С.
ЭФФЕКТ ДЕЙСТВИЯ ДЕТОНАЦИОННЫХ НАНОАЛМАЗОВ НА ЗДОРОВЫЕ ТКАНИ ПАРОДОНТА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ И ПРИ ИХ ВОСПАЛИТЕЛЬНО-ДЕСТРУКТИВНЫХ
ИЗМЕНЕНИЯХ
Л.И. Лазаренко, Е.Л. Жуков, С. В. Кругом, А.П.Пузырь, Г.Г.Манашев,
В. С.Бондарь
Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого, ректор - д.м.н., проф. И.П. Артюхов; Институт биофизики СО РАН, директор - чл.-корр. РАН, д.ф.- м.н. А.Г. Дегерменджи; Институт фундаментальной биологии и биотехнологии ФГОУ ВОП «Сиб. фед. университет», ректор -академик РАН, д.б.н. Е.А. Ваганов; Краевое патологоанатомическое бюро,
начальник - В. Д. Соколов.
Резюме. Исследовано воздействие наноалмазов детонационного синтеза на ткани пародонта крыс в условиях нормы и при пародонтитоподобных изменениях. Показано, что введение наноалмазов в ткани здорового пародонта не приводит к их патологическим изменениям. Впервые установлено, что инъекции наноалмазов в ткани пародонта на фоне их воспалительнодеструктивных изменений, оказывают положительный лечебный эффект, нарастающий с повышением концентрации наночастиц. Обсуждаются возможные механизмы терапевтического действия наночастиц.
Ключевые слова: ткани пародонта, пародонтит, наноалмаз, гидрозоль.
Пародонтит (воспалительно-деструктивный процесс в тканях пародонта) относится к числу наиболее распространенных стоматологических патологий [1, 5]. По данным литературы, в последнее время наблюдается заметный рост этой группы заболеваний, (более 90% случаев) [6]. Независимо от этиологии,
пародонтит, при отсутствии своевременной диагностики и эффективных методов лечения, в конечном итоге может привести к полной утрате зубов.
Для лечения пародонтитов современная стоматология располагает широким набором средств и методов, применяемых на разных стадиях развития заболевания. Тем не менее, в клинической практике лечебные мероприятия комплексного характера (включая хирургическое вмешательство) не всегда осуществимы из-за отсутствия необходимого оборудования, трудоемкости процедур и дороговизны применяемых препаратов [7]. Исходя из этого, совершено очевидна актуальность разработки простых методов терапии заболеваний пародонта, поиск и создание новых эффективных лечебных средств. Оправдана разработка препаратов полифункционального действия, позволяющих не только стабилизировать патологический процесс, но и оказывающих восстановительное действие на ткани пародонта, например, способных связывать и нейтрализовать медиаторы воспаления, улучшать кровоснабжение, содержать лечебные вещества, способствующие репарации поврежденной ткани.
Для специалистов, работающих в данном направлении, несомненный интерес могут представлять частицы наноалмаза, получаемые при детонации сильных взрывчатых веществ [8]. Физико-химические свойства наноалмазов (прежде всего, их полиморфная химически активная поверхность [12, 13]) позволили применять этот наноматериал как полифункциональный адсорбент для связывания, сепарации и очистки биомолекул [2, 14] и создания нового класса индикаторных и диагностических тест-систем [15]. В медицине наноалмазы могут найти применение как новый энтеросорбент и носитель лекарственных препаратов [3, 15].
В Институте биофизики СО РАН из наноалмазов, производимых в России методом взрыва, получены модифицированные наноалмазы, адаптированные для медико-биологических исследований и обладающие высокой коллоидной устойчивостью в дисперсионных средах [4]. Результаты разноплановых экспериментов, проведенных ранее на животных [9, 10, 11], свидетельствуют о
высокой биосовместимости и малой токсичности этого наноматериала. Наличие наночастиц с такими свойствами открывает возможности поиска новых вариантов их применения в различных областях практической медицины, например, в стоматологии. В связи с этим, целью данной работы являлось изучение эффекта действия детонационных наноалмазов на ткани пародонта подопытных животных в условиях нормы и при экспериментально индуцированном воспалении как модели пародонтитоподобных изменений.
Материалы и методы
Исследования проведены на базе вивария Красноярского государственного медицинского университета им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого. Эксперименты выполнены на взрослых крысах линии Вистар (половозрелые особи весом 180-200 гр.), полученных из питомника «Рассвет» (г. Томск). До начала эксперимента животных выдерживали две недели на карантине, в течение которого осуществляли отбраковку ослабленных крыс. После этого животные были случайным образом распределены на 5 групп (по 8 особей), содержащихся в раздельных клетках. Условия содержания в виварии были одинаковыми для всех животных - они находились на одинаковом пищевом рационе, их доступ к пище и питью был свободным. Суточный рацион питания крыс состоял из влажной каши с добавкой витаминов группы А, В, С, сухой зерновой смеси, свежих овощей и фруктов.
Распределение животных по группам: контрольная группа - 1, опытные группы с моделью пародонтита - 2-5. Развитие пародонтита инициировали следующим образом. Под ингаляционным наркозом (применение эфира) у крыс производили надрез круговой связки зуба штопфер-гладилкой производства фирмы ОАО «Можайский медико-инструментальный завод». В искусственно созданный пародонтальный карман вводили зубной камень, полученный при снятии зубных отложений у пациентов стоматологической поликлиники КрасГМУ с диагнозом хронический генерализованный пародонтит 2-ой степени (установлен в соответствии с классификацией ВОЗ). Препараты зубного камня использовали для операции в течение 5 часов от момента получения. Глубину
пародонтальных карманов измеряли с помощью пародонтологического зонда, производимого указанной выше фирмой.
В послеоперационном периоде динамику развития воспалительнодеструктивных изменений в тканях пародонта у крыс 2 - 5 групп оценивали на 7 и 14 сутки по клиническим и морфологическим показателям. В те же сроки исследовали состояние тканей пародонта контрольных животных. Далее животным делали инъекции гидрозолей наноалмазов для изучения действия наночастиц на ткани здорового пародонта и при их воспалении. В работе использовали модифицированные наноалмазы, полученные в ИБФ СО РАН [4]. Гидрозоли с известной концентрацией наноалмазов готовили добавлением деионизованной воды к навеске порошка наночастиц, после чего их стерилизовали автоклавированием и хранили при +4оС. Деионизованную воду получали с помощью системы очистки воды (модель Nanopure system) фирмы Sybron-Barnstead (США).
В ткани пародонта животных с интервалами 3-4 дня вводили по 0,15-0,2 мл гидрозоля наноалмазов со следующей концентрацией наночастиц: 1 группа -5 мас.%; 2-4 группы - 0,25 мас.%, 1 мас.% и 5 мас.% соответственно. Для сравнительной оценки действия наночастиц на патологически измененные ткани пародонта в качестве контроля использовали животных группы 5, которым инъекции наноалмазов не делали. Клинико-морфологическую оценку состояния тканей пародонта животных на фоне инъекций наноалмазов проводили на 21 и 28 сутки. В эти же временные сроки по 4 крысы из каждой группы выводили из эксперимента методом декапитации с соблюдением принципов эвтаназии (применение эфирного наркоза), брали образцы тканей пародонта и помещали в 10% раствор нейтрального формалина. Затем на кафедре патологической анатомии им. П.Г. Подзолкова (КрасГМУ) из образцов по стандартной методике (окрашивание гематоксилин-эозином и по методу Ван Гизон) готовили гистологические препараты и проводили их изучение.
Для обработки полученных количественных данных вычисляли среднее арифметическое (М), его стандартное отклонение (о) и среднюю ошибку (m).
При статистическом анализе достоверности различий морфометрических показателей использовали непараметрические критерии. Внутригрупповые различия зависимых переменных оценивали с помощью критерия Фридмана (для сравнения нескольких зависимых переменных) и критерия Уилкоксона (для парных сравнений в группах).
Результаты и обсуждение
Как показали исследования, у всех прооперированных животных в течение двух недель после операции наблюдалось развитие воспалительных изменений в тканях пародонта (табл. 1). На 7 сутки выявлялись гиперемия и отек десен, глубина пародонтальных карманов составляла 2,4±0,05 мм. На 14 сутки десны приобрели синюшный оттенок, появилось серозно-гнойное отделяемое из пародонтальных карманов, глубина которых увеличилась до 2,7±0,06 мм, диагностировалась подвижность нижних фронтальных зубов в вестибуло-оральном направлении (2 степень по классификации ВОЗ).
У контрольных животных (группа 1) в течение этого периода наблюдений изменений в тканях пародонта не было выявлено: слизистая оболочка десен была бледно-розового цвета без патологических явлений, глубина пародонтальных карманов составляла 1,0±0,05 мм. При инъекциях гидрозолей наноалмазов (концентрация наночастиц 5 мас.%) этой группе животных в течение последующих 2 недель не было выявлено изменений клиникоморфологических характеристик: десны имели бледно-розовый цвет без
патологических изменений; глубина пародонтальных карманов составляла 1,0±0,05 мм; отделяемого из пародонтальных карманов и подвижности зубов не отмечалось. При осмотре десен выявлена локализация наноалмазов в месте инъекций в виде небольшого круглого образования, имеющего темный цвет. Надо отметить, что полученные данные хорошо согласуются с результатами проведенных ранее исследований на разных видах животных и использованием модифицированных наноалмазов [9,10,11], которые свидетельствуют в пользу высокой биосовместимости и малой токсичности этого наноматериала.
Установлено, что инъекции наноалмазов в ткани пародонта при их воспалительных изменениях (2-4 группы) оказывают положительный эффект действия, возрастающий с повышением концентрации наночастиц в гидрозоле (табл. 1). Через неделю после начала инъекций (21-е сутки) выявлено по группам: во второй (концентрация наноалмазов 0,25 мас.%): гиперемия и отек десен, их кровоточивость при пальпации; гнойное отделяемое из пародонтальных карманов, глубина которых составляли 2,7±0,15 мм; регистрировалась подвижность нижних фронтальных зубов 1-2 степени. В группе 3 (концентрация наноалмазов 1 мас. %) отмечено: гиперемия и отек десен и десневых сосочков; размер пародонтальных карманов составляет 2,6±0,13 мм, имелось серозное отделяемое и кровоточивость при пальпации; констатировалось подвижность нижних фронтальных зубов 1-2 степени. В группе 4 (концентрация наноалмазов 5 мас. %) регистрировалось: ярко-розовый цвет десен и десневых сосочков; отмечалось кровоточивость и серозное отделяемое при пальпации пародонтальных карманов, глубина которых составляла 2,2±0,11 мм; была подвижность нижних фронтальных зубов 1-2 степени. При этом следует отметить, что у животных группы 5, которым инъекции наноалмазов не делали, на 21-е сутки отмечается нарастание воспалительно-деструктивных изменений в тканях пародонта, что характеризовалось выраженной синюшностью десен, образованием свищей, обильным гнойным отделяемым и появлением подвижности зубов в вестибуло-оральном направлении. На 28 сутки эксперимента у крыс 2 и 3 групп не было выявлено как положительных, так и отрицательных изменений в тканях пародонта, наблюдаемые клинико-морфологические признаки были такие же, как и на 21-е сутки (см. выше). Это может свидетельствовать в пользу стабилизации воспалительного процесса под действием наночастиц. При этом у животных 4 группы наблюдался явный положительный терапевтический эффект действия наноалмазов: десны и десневые сосочки имели бледно розовый цвет, размеры пародонтальных карманов составляли 1,7±0,08 мм, отделяемого из них не наблюдалось. Однако при этом сохранялась подвижность зубов в вестибуло-
оральном направлении. Следует подчеркнуть, что на 28-е сутки у животных 5 группы помимо выявленных ранее (21-е сутки) клинико-морфологических изменений, регистрировалась подвижность зубов 2-3 степени. Более того, на 26е сутки для двух крыс из этой группы был зарегистрирован летальный исход.
При гистологическом исследовании тканей пародонта крыс 1 группы в месте введения наночастиц определялись скопления групп макрофагов, цитоплазма которых был заполнена гранулами коричневого цвета (наноалмазами). В тканях пародонта животных 2 и 3 групп преобладали явления альтеративной и экссудативной стадий воспаления: очаги некроза, выраженная инфильтрация сегментоядерными лейкоцитами, развитие грануляционной ткани. В тканях пародонта 4 группы отмечалось преобладание пролиферативной стадии воспаления: развитие грануляционной ткани с более выраженными процессами организации. В 5 группе при микроскопии тканей пародонта отмечалось выраженное прогрессирующее воспаление с обширными очагами некроза с тенденцией к микроабсцедированию, с переходом воспаления на костную ткань зубной альвеолы.
Исходя из анализа полученных данных, можно сделать следующее заключение. Установлено, что инъекции гидрозолей детонационных наноалмазов не оказывают выраженного токсического действия на ткани здорового пародонта подопытных животных. По крайней мере, двухнедельные инъекции наночастиц в ткани пародонта крыс не приводят к сколько-нибудь существенному изменению их клинико-морфологических признаков. В тоже время, инъекции этого наноматериала в ткани пародонта с воспалительнодеструктивными изменениями сопровождаются положительным лечебным эффектом, который зависит от концентрации наночастиц в гидрозоле. Мы полагаем, что терапевтическое действие наноалмазов может объясняться следующими возможными механизмами. Во-первых, возможно связывание и нейтрализация медиаторов воспаления за счет их адсорбции на поверхности наноалмазов. Во-вторых, можно предположить, что ионы двухвалентных металлов (прежде всего Са, М^, Бе), обнаруживаемые на поверхности
наночастиц в виде микропримесей, могут оказывать стабилизирующее действие на стенки кровеносных сосудов, тем самым нормализуя процессы кровоснабжения в очаге воспаления. Наконец, нельзя исключить, что наночастицы с адсорбированными медиаторами воспаления могут активно фагоцитироваться макрофагами в очаге воспаления, что также будет усиливать противовоспалительный эффект.
EFFECT OF DETONATING NANODIAMONDS ON TISSUES OF ANIMAL PARODENTIUM IN THE STATE OF NORM AND IN INFLAMMATORY AND DYSTROPHIC CHANGES L.I. Lazarenko, E.L. Zhukov, S.V. Krugom, A.P. Puzyr, G.G. Manashev, V.S.
Bondar
Krasnoyarsk state medical university named in honor of V.F. Vojno-Yasenetskij
Influence of nanodiamonds of explosion synthesis on rat parodentium in normal condition and in dystrophic changes was investigated. It was revealed that use of nanodiamonds in health tissues of parodentium does not lead to pathological changes. First it was determined that injections of nanodiamonds in parodentium tissues on the basis of inflammatory and destructive changes have medical effect. Mechanisms of action of nanoparticles were discussed.
Литература
1. Безрукова И.В., Дмитриева Н.А., Герчикова Л.Н. Клинико-лабораторная оценка эффективности применения в комплексной терапии воспалительных заболеваний пародонта комбинированного препарата цифран СТ //Стоматология. - 2005. - №1. - С. 13-15.
2. Бондарь В.С., Позднякова И.О., Пузырь А.П. Применение наноалмазов для разделения и очистки белков // Физика тверд. тела. - 2004. - Вып.4. - С.737-739.
3. Бондарь В.С., Пузырь А.П. Возможность и перспективы создания новых нанотехнологий на основе частиц детонационных наноалмазов: медико-
биологический и технический аспекты // Конструкции из композиционных материалов. - 2005. - Вып.4. - С.80-94.
4. Бондарь В.С., Пузырь А.П. Наноалмазы для биологических исследований // Физика тверд. тела. - 2004. - Т.46, Вып.4. - С.698-701.
5. Иванов В.С. Заболевания пародонта. - М.: Медицина, 2001. - С 299.
6. Курякина Н.В., Кутепова Т.Ф. Заболевания пародонта. - Н.Новгород, 2003. -С 5-25.
7. Люлякина Е.Г., Орлова Е.Е. Современные методы лечения заболеваний пародонта: сб. тр. //Акт. вопр. стоматологии. - Красноярск, 2001. - С. 36-37.
8. Ставер А.М., Губарева Н.В., Лямкин А.И. Ультрадисперсные алмазные порошки, полученные с использованием энергии взрыва // Физика горен. и взрыва. - 1984. - №3. - С.100-104.
9.Пузырь А.П., Бондарь В.С., Селимханова З.Ю. и др. Результаты исследования возможного применения детонационных наноалмазов в качестве энтеросорбента // Сиб. мед. обозрение. - 2004. - Т.2-3, № 31-32. - С.25-28.
10.Пузырь А.П., Бондарь В.С., Селимханова З.Ю. и др. Динамика некоторых физиологических показателей лабораторных мышей при длительном пероральном введении суспензий наноалмазов // Сиб. мед. обозрение. - 2004. -Т.4, №33. - С.19-23.
11.Тян А. Г. Морфологическая характеристика органов экспериментальных животных при пероральном введении детонационных наноалмазов: дис. ... канд. мед. наук. - Красноярск, 2005. - С. 96-103.
12.Чиганова Г.А. Исследование поверхностных свойств ультрадисперсных алмазов // Коллоид. журнал. - 1994. - №2. - С.266-268.
13.Чиганова Г. А. Структура и свойства ультрадисперсных алмазов детонационного синтеза // Неорганич. материалы. - 1999. - №5. - С.581-586.
14. Purtov K.V., Burakova L.P., Puzyr A.P., Bondar V.S. Interaction of linear and ring forms of DNA molecules with nanodiamonds synthesized by detonation // Nanotechnology. - 2008. - Vol.19. - Р.1-3.
15. Puzyr A.P., Baron A.V., Purtov K.V. et al. Nanodiamonds with novel properties: a biological study // Diamond and Related Materials. - 2007. - Vol.16. - P.2124-2128.
Таблица 1
Динамика изменения глубины пародонтальных карманов (М ± т) у
исследуемых групп животных в ходе эксперимента
Группа животных Показатели изменения патологического процесса в исследуемых группах в разные сроки наблюдений (сутки)
7 14 21 28
1 1,0±0,05 1,0±0,05 1,0±0,05 1,0±0,05
2 2,4±0,09 2,7±0,15 2,7±0,15 2,7±0,15
3 2,4±0,09 2,7±0,10 2,6±0,13 2,6±0,13
4 2,4±0,11 2,7±0,11 2,2±0,11* 1,7±0,08*
5 2,4±0,10 2,7±0,12 3,4±0,13* 4,2±0,19*
2-5 2,4±0,05 2,7±0,06
Примечание: (*) - достоверно значимое отличие показателей между сроками наблюдений и группами.
