CC BY
114
Бюллетень Брянского отделения РБО, 2016. № 1(7). С. 61-64.
Bulletin of Bryansk dpt. of RBS, 2016.
N 1(7). P. 61-64.
БИОТЕХНОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 581.52.342
ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ
RIBES NIGRUM L. (GROSSULARIA CEAE)
© А. А. Лебедев, Д. Н. Сковородников
A. A. Lebedev, D. N. Skovorodnikov
Optimization of micropropagation conditions of Ribes nigrum L. (Grossulariaceae)
ФГБОУВО «Брянский государственный аграрный университет» 243365, Брянская обл., Выгоничский р-н, с. Кокино, ул. Советская 2а Тел.: + 7 (48341) 2-46-31, e-mail: [email protected]
Аннотация. В данной статье показано влияние различных регуляторов роста на этапах микроразмножения Ribes nigrum L. (Grossulariaceae).
Ключевые слова: Ribes nigrum L., культура тканей, микроклональное размножение, цитокинины.
Abstract. This article reveals the effects of diffèrent growth regulators on stages of Ribes nigrum L. (Grossulariaceae) micropropagation.
Keywords. Ribes nigrum L, tissue culture, micropropagation, cytokinins.
Введение
Смородина чёрная - Ribes nigrum L. (Grossulariaceae) - одна из важнейших ягодных культур. Для получения высокого и качественного урожая необходим оздоровлённый и отвечающий всем современным стандартам посадочный материал.
Традиционно R. nigrum размножают одревесневшими и зелёными черенками. Это требует больших экономических затрат и площадей для выращивания, а главное не снимает такой проблемы, как наличие грибковых болезней и вирусов. Достижения в области культуры тканей и клеток привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения - клонального микроразмножения, то есть размножение в культуре in vitro. В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовать присущую ей то-типотентность, то есть под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму. Этот метод, несомненно, имеет ряд преимуществ перед традиционными способами размножения: получение генетически однородного посадочного материала, освобождение растений от вирусов, высокий коэффициент размножения и др. (Сельскохозяйственная..., 2003; Чхенкели, 2014).
На этапе введения в культуру разные исследователи использовали, в основном, 6-БАП. Лучшие результаты, по сведениям З. Т. Тарашвили (1985), были получены на среде с концентрацией 6-БАП - 0,5-1 мг/л. Также было изучено влияние регуляторов роста тидиазуро-на и картолина. Высокая концентрация тидиазурона (0,5-1 мг/л) привела к гибели культивируемых верхушек через 5-7 дней. Оптимальная концентрация картолина для индукции ростовых процессов у изолированных эксплантов смородины - 0,5 мг/л. Однако стимулирующее действие названных регуляторов роста на регенерационную способность эксплан-тов оказалось не выше, чем 6-БАП.
Растения R. nigrum, культивируемые in vitro, имеют характерные особенности в сравнении с другими ягодными культурами (например, Rubus idaeus L.). Таким отличием является
61
формирование коротких побегов на этапе собственно размножения при культивировании растений на питательной среде с цитокининами. В наших исследованиях высота растений у изучаемых сортов не превышала одного сантиметра и варьировала от 5,8 до 7,4 мм. Междоузлия образуемых побегов были очень короткими, а иногда растения имели и вовсе розе-точное строение (Skovorodnikov et al., 2013). Малый размер растений смородины вызывает определенные технологические трудности при черенковании побегов. Кроме того, жизнеспособность таких растений оказывается всегда ниже, чем у более крупных представителей.
Цель исследования: 1) оценить влияние регуляторов роста цитокининовой природы и витаминно минерального комплекса «Компливит» на различных этапах размножения смородины чёрной; 2) подобрать оптимальную концентрацию регулятора роста, а также оптимизировать этап размножения.
Материалы и методы
Работа проводилась в научно-образовательном центре биотехнологии Брянского государственного аграрного университета. Объектом исследования являлись сорта и элитные формы смородины чёрной, созданные на Кокинском опорном пункте ВСТИСП (авторы И. В. Казаков и Ф. Ф. Сазонов). Использовалась трехкратная повторность. Ниже представлено краткое описание некоторых генотипов.
Гамаюн - урожайность до 10-12 т ягод с гектара. Куст сильнорослый, сжатый, умеренной загущенности. Ягоды крупные (средняя масса 1,8 г, максимальная 4,5 г), одномерные, овальной формы, чёрные, блестящие; созревание дружное. Вкус кисло-сладкий, освежающий. Содержание витамина С - 171 мг%.
Исток - зимостойкий сорт среднераннего срока созревания. Урожайность до 12 т ягод с гектара (2,8-3,0 кг с куста). Сорт самоплодный, устойчивый к основным болезням, недостаточно устойчив к почковому клещу. Куст среднерослый, среднераскидистый, умеренной загущенности. Ягоды крупные (средняя масса 1,7 г, максимальная 4,2 г), округлой формы, чёрные, блестящие, созревание дружное. Вкус кисло-сладкий, освежающий. Содержание витамина С - 169 мг%. Сорт универсального назначения.
Подготовка и стерилизация растительного материала. Нарезку черенков смородины осуществляли осенью за несколько дней до изолирования эксплантов (сентябрь-октябрь). Заготовленный материал хранили в полиэтиленовых пакетах для предотвращения его подсыхания в бытовом холодильнике при температуре 4°С.
Перед изолированием черенки нарезались на сегменты с одной почкой длинной 2-4 см. Для удобства работы черенок расщепляли вдоль по центру, что предотвращало его проворачивание на предметном столике бинокуляра. нарезанные черенки стерилизовали в 0,1% растворе мертиолята (C9H9HgNaO2S) в качестве поверхностно-активного вещества в течение 3 минут на шейкере, с последующей пятикратной промывкой в стерильной дистиллированной воде.
После стерилизации черенки обсушивали на стерильных кружках фильтровальной бумаги в ламинарном шкафу.
Введение в культуру in vitro. Для введения в культуру in vitro использованы визуально здоровые растения смородины с доказанной сортовой принадлежностью.
Источниками эксплантов послужили одревесневшие однолетние черенки, терминальные и латеральные вегетативные почки, а также меристематические верхушки. В нашей работе с целью увеличения количества исходных эксплантов использовались как апикальные, так и боковые почки, которые имели численное преимущество и более крупные размеры.
Этап пролиферации или размножения. Новые растения смородины получены путём черенкования образовавшихся под действием цитокининов побегов. Одно субкультивирование длилось от 3 до 6 недель.
Результаты исследования
В качестве регуляторов роста использованы различные цитокинины (табл. 1). В ходе нашего исследования наилучшие результаты показало использование препарата СРРи (табл. 1).
Таблица 1
Влияние регуляторов роста растений цитокининовой природы на эффективность введения в культуру in vitro R. nigrum
№ п.п. Вариант Количество не тронувшихся в рост эксплантов, шт. Приживаемость эксплантов, % Размер эксплантов после 1 месяца культивирования, мм
1. Без гормонов 14,8±3,7 14,8±7,2 2,8±0,1
2. 6-БАП 0,2 мг/л 32,2±5,4 22,0±7,7 3,9±0,2
3. 6-БАП 0,5 мг/л 37,1±21,8 33,3±11,7 3,7±0,4
4. 6-БАП 1 мг/л 22,3±11,1 29,1±5,5 4,6±0,4
5. TDZ 0,05 мг/л 26,8±3,3 3,7±1,0 4,3±0,1
6. TDZ 0,1 мг/л 34,4±8,7 36,5±5,9 5,2±0,2
7. TDZ 0,2 мг/л 20±5,8 63,3±6,7 6,7±1,0
8. CPPU 0,2 мг/л 11,1±0,4 81,5±3,7 8,4±0,6
9. CPPU 0,5 мг/л 3,3±1,1 71,7±1,6 8,4±0,8
10. CPPU 1 мг/л 10±5,8 83,3±3,3 7,2±0,2
Увеличение размеров эксплантов (т. е. вытягивание побегов в длину) в культуре in vitro удалось достичь, используя в качестве дополнительного питательного компонента в среде МС витаминно-минерального комплекса «Компливит» (Фармстандарт..., 2015). Препарат в целом в сочетании с 6-БАП в концентрации 1 мг/л вызывал увеличение коэффициента размножения и высоты у испытанных генотипов. Растения формировали вытянутые побеги, что давало возможность применять черенкование по междоузлиям, листья увеличивались в размере и приобретали интенсивно зеленую окраску.
Высота растений на этапе собственно размножения in vitro варьировала от 5,9 до 18,3 мм, а коэффициент размножения от 1,3 до 2,8 (табл. 2).
Таблица 2
Коэффициент размножения и высота растений R. nigrum в культуре in vitro (6-БАП - 1 мг/л)
№ п.п. Генотип Коэффициент размножения Высота растений, мм
1. Гамаюн 2,5±0,4 18,3±1,5
2. Исток 2,2±0,3 6,5±0,5
3. Брянский агат 2,2±0,1 11, 0± 1, 4
4. Этюд 1,3±0,1 11,0±2,0
5. 5-4-3/08 2,8±0,3 7,2±0,3
6. 5-4-2/08 2,0±0,1 6,9±0,5
7. 63-35-1 1,4±0,1 7,8±0,7
8. 33-27-1 1,3±0,1 10,0±0,3
9. 55-41-5 2,3±0,2 12,0±0,7
10. 9-36-1/02 2,5±0,1 5,9±0,3
11. 28-03-2 1,6±0,1 8,4±0,6
12. 62-03-06 2,4±0,1 8,8±1,1
13. 62-03-7 2,3±0,3 8,5±0,6
Заключение
1. На этапе введения в культуру R. nigrum наилучшие, по сравнению с более ранними исследованиями, результаты показал регулятор роста CPPU в концентрации 0,2 мг/л. Растения имели хорошую приживаемость и крупный размер.
2. На этапе размножения применение препарата «Компливит» в сочетании с 6-БАП привело к увеличению коэффициента размножения и высоты эксплантов, что в дальнейшем облегчало работу при микрочеренковании.
3. Показатели роста и развития растений R. nigrum в культуре in vitro в значительной степени зависели от генотипа.
Список литературы
Сельскохозяйственная биотехнология / В. С. Шевелуха, Е. А. Калашникова, Е. С. Воронин и др.; Под. ред. В. С. Шевелухи. М., 2003. 469 с.
Тарашвили З. Т. Ускоренное размножение чёрной и красной смородины методом in vitro: Автореф. дис... канд. с.-х. наук: 06.01.07. М., 1985. 22 с.
Фармстандарт [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://pharmstd.ru. Дата обращения: 1.01.2016. Чхенкели В. А. Биотехнология: уч. пособие. СПб.: Проспект Науки, 2014. 336 с.
Skovorodnikov D. N., Sazonov F. F., Lebedev A. A. Effect of genotype of the black currant on the efficiency of propagation in culture in vitro // Vestnik OrelGAU. 2013. N 2 (41). P. 58-61.
References
Chkhenkeli V. A. Biotekhnologiya: uch. posobie. SPb.: Prospekt Nauki, 2014. 336 p. Farmstandart [Electronic resource]. URL: http://pharmstd.ru. Date: 1.01.2016.
Sel'skohozyajstvennaya biotekhnologiya / V. S. SHeveluha, E. A. Kalashnikova, E. S. Voronin i dr.; Pod. red. V. S. Sheveluhi. M., 2003. 469 p.
Tarashvili Z. T. Uskorennoe razmnozhenie chyornoj i krasnoj smorodiny metodom in vitro: Avtoref. dis... kand. s.-h. nauk: 06.01.07. M., 1985. 22 s.
Skovorodnikov D. N., Sazonov F. F., Lebedev A. A. Effect of genotype of the black currant on the efficiency of propagation in culture in vitro // Vestnik OrelGAU. 2013. N 2 (41). P. 58-61.
Сведения об авторах
Лебедев Андрей Александрович Lebedev Andrey Alexandrovich
аспирант Postgraduate student
Брянский государственный аграрный университет, Кокино Bryansk State Agrarian University, Kokino
E-mail: а[email protected] E-mail: а[email protected]
Сковородников Дмитрий Николаевич Skovorodnikov Dmitry Nikolaevich
кандидат с.-х. наук, доцент Ph. D. in Agriculture Science, Ass. Professor
Брянский государственный аграрный университет, Кокино Bryansk State Agrarian University, Kokino
E-mail: [email protected] E-mail: [email protected]
