CC BY
34
Удэ и п. Майск Курумканского района Республики Бурятия: автореф. дис. ... канд. вет. наук. — Барнаул, 2005. — 18 с.
3. Барышников П.И., Бондарев А.Ю., Новиков Б.В. Инфекционные болезни диких птиц в лесостепной области Алтайского края // Ветеринария. — 2012. — № 6. — С. 28-31.
4. Белоусова Р.В., Сюрин В.Н. Роль перелетных птиц в распространении вирусов в природе: лекция. — М., 1977. — 53 с.
5. Коровин Р.Н., Зеленский В.П., Гроше-ва Г.А. Лабораторная диагностика болезней птиц: справочник. — М.: Агропромиз-дат, 1989. — 256 с.
6. Vellegas P. Viral diseases of the respiratory system // Poultry Science. — 1998. — Vol. 77 (8). — R. 1143-1145.
7. Львов Д.К., Ильичев В.Д. Миграции птиц и перенос возбудителей инфекций. — М.: Наука, 1979. — 271 с.
8. Яхонтов А.А. Зоология для учителя. Хордовые / под ред. А.В. Михеева. — М.: Просвещение, 1985. — 256 с.
References
1. Agoltsov V.A. Kandidoz, aspergillez i mukoroz zhivotnykh (diagnostika i mery
bor'by): avtoref. dis. ... d-ra vet. nauk. — N. Novgorod, 2006. — S. 12.
2. Bagryatsova A.L. Mikrobiologicheskiy monitoring sinantropnykh ptits v g. Ulan-Ude i p. Maysk Kurumkanskogo rayona Respubliki Buryatiya: avtoref. dis. ... kand. vet. nauk. — Barnaul, 2005. — 18 s.
3. Baryshnikov P.I., Bondarev A.Yu., Novikov B.V. Infektsionnye bolezni dikikh ptits v lesostepnoy oblasti Altayskogo kraya / / Veterinariya. — 2012. — № 6. — S. 28-31.
4. Belousova R.V., Syurin V.N. Rol pere-letnykh ptits v rasprostranenii virusov v pri-rode: lektsiya. — M., 1977. — 53 s.
5. Korovin R.N., Zelenskiy V.P., Grosheva G.A. Laboratornaya diagnostika bolezney ptits: spravochnik. — M.: Agropromizdat, 1989. — 256 s.
6. Vellegas P. Viral diseases of the respiratory system // Poultry Science. — 1998. — Vol. 77 (8). — R. 1143-1145.
7. Lvov D.K., Ilichev V.D. Migratsii ptits i perenos vozbuditeley infektsiy. — M.: Nauka, 1979. — 271 s.
8. Yakhontov A.A. Zoologiya dlya uchitelya. Khordovye / pod red. A.V. Mi-kheeva. — M.: Prosveshchenie, 1985. — 256 s.
+ + +
УДК 619:578.835.1
А.И. Боронбаева, Р.З. Нургазиев, Е.Д. Крутская A.I. Boronbayeva, R.Z. Nurgaziyev, Ye.D. Krutskaya
ОПТИМИЗАЦИЯ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ЯЩУРА ТИПА О
REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION OPTIMIZATION TO DETERMINE FOOT-AND-MOUTH DISEASE VIRUS OF TYPE O
Ключевые слова: вирус ящура, ПЦР, ПЦР в реальном времени, праймер, типизация.
На начальной стадии экспериментов по оптимизации ПЦР в реальном времени исполнителями для каждого типа вируса ящура подбирались и оптимизировались праймеры. Анализировались продукты амплификации ПЦР. Установлено, что в исследованных пробах из двух предполагаемых типов вируса (О, А) присутствовал только тип О. Для усиления специфичности ПЦР в классическом варианте была обработана концепция повышения ее специфичности и проверена экспериментально. Усовершенствованная ПЦР в реальном времени проявила высокую чувствительность, специфичность и воспроизводимость. Сконструированные праймеры рекомендованы для диагностики ящура, вызванного вирусом типов А и О.
Keywords: foot-and-mouth disease virus, polymerase chain reaction (PCR), real-time PCR, primer, type assignment.
At the initial stage of the experiments on realtime PCR optimization, the primers for each type of foot-and-mouth disease virus were selected and optimized. PCR amplification products were analyzed. It was found that in the tested samples of two suspected virus types (O, A) the type O only was present. To enhance the specificity of PCR in the classic version, the concept of increasing its specificity was processed and verified experimentally. Improved real-time PCR showed high sensitivity, specificity and reproducibility. The designed primers are recommended for the diagnosis of foot-and-mouth disease caused by virus types A and O.
Боронбаева Аида Ильичевна, с.н.с., лаб. вирусологии и биотехнологии, Кыргызский НИИ ветеринарии им. А. Дуйшеева, Кыргызский национальный аграрный университет им. К.И. Скрябина, г. Бишкек, Кыргызская Республика. E-mail: aida. [email protected], [email protected]. Нургазиев Рысбек Зарылдыкович, д.в.н., проф., член-корр. НАН КР, ректор, Кыргызский национальный аграрный университет им. К.И. Скрябина, г. Бишкек, Кыргызская Республика. E-mail: [email protected].
Крутская Екатерина Дмитриевна, к.в.н., доцент, лаб. вирусологии и биотехнологии, Кыргызский НИИ ветеринарии им. А. Дуйшеева, Кыргызский национальный аграрный университет им. К.И. Скрябина, г. Бишкек, Кыргызская Республика. E-mail: [email protected].
Boronbayeva Aida Ilyichevna, Leading Staff Scientist, Kyrgyz Research Veterinary Institute named after A. Duysheyev, Kyrgyz National Agricultural University named after K.I. Skryabin, Bishkek, Kyrgyz Republic. E-mail: [email protected], aida. boronbaeva@mail. ru.
Nurgaziyev Rysbek Zaryldykovich, Dr. Vet. Sci., Prof., Corresponding Member of Natl. Acad. of Sci. of Kyrgyz Republic, Rector, Kyrgyz National Agricultural University named after K.I. Skryabin, Bishkek, Kyrgyz Republic. E-mail: [email protected]. Krutskaya Yekaterina Dmitriyevna, Cand. Vet. Sci., Assoc. Prof., Kyrgyz Research Institute of Veterinary Medicine named after A. Duysheyev, Kyrgyz National Agricultural University named after K.I. Skryabin, Bishkek, Kyrgyz Republic. E-mail: [email protected].
Введение
В последние годы в Кыргызской Республике наряду с ростом численности животных отмечается рост числа неблагополучных ферм по инфекционным болезням. Особенную озабоченность вызывает сохранность молодняка раннего возраста. Определенную роль в возросшей заболеваемости животных играют неудовлетворительные условия ухода, содержания и кормления, а неудовлетворительная профилактика болезней — также недостаток профилактических средств, вакцин, диагностических наборов для поддержания эпидемиологического благополучия. Неудовлетворительное состояние здоровья животных негативно отражается на продуктивности и качестве животноводческой продукции.
Из регистрируемых на территории инфекционных болезней особую обеспокоенность вызывают периодические вспышки ящура новых подтипов, ранее не встречавшихся в Кыргызской Республике.
Основными источниками заноса вируса ящура являются в первую очередь нелегальный завоз и продажа животных, продуктов животноводства и кормов, миграция людей, активное движение автотранспорта [6].
Возбудителем ящура является РНК-содержащий вирус из семейства пикорна-вирусов. Вирион вируса ящура, размером вирионов около 20 нм, имеет сферическую форму, геном не фрагментирован и заключен в икосаэдрический капсид. По антигенной структуре вирус подразделяется на 7 серотипов — А, О, С, Азия-1, CAT-1, CAT-2 и CAT-3 [1]. На территории СНГ обычно встречаются вирусы типов А, О и Азия-1. В Кыргызской Республике встречаются все три серотипа ящура A и Азия-1), в последние годы циркулировали типы
О и А. Животные, переболевшие ящуром одного типа, могут повторно заболеть в случае заражения вирусом другого типа.
Характерными клиническими признаками болезни являются кратковременная лихорадка, появление афт и эрозий на слизистой оболочке ротовой полости, на кончике венчика и межкопытцевой щели, носовом зеркальце, вымени. Возможно переболе-вание животных со стертыми клиническими признаками. У новорожденных телят ящур может протекать в сверхострой форме, со смертельным исходом, без образования афт. Ящуром может болеть и человек [1, 2].
Материалы и методы
Работа выполнена в лаборатории вирусологии и биотехнологии Научно-исследовательского института ветеринарии им. А. Дуйшеева. В качестве патологического материала были использованы клинические образцы (носовые смывы), собранные от больных животных во время вспышки ящура в регионах Кыргызской Республики в 2010-2012 гг.
Выделение РНК вирусов проводили специальным коммерческим набором американского производства Axygen (AxyPrepTMBodyFluid, Viral DNA/RNA miniprepkit, cat. № AP-MN-BF-VNA-250) в соответствии с наставлением по его применению. После выделения РНК проводили обратную транскрипцию коммерческим набором Qiagen ^at. № 205311) по инструкции к применению данного набора.
Метод ПЦР выполнялся в классическом виде и в реальном времени (RT-PCR).
Для оптимизации температурного режима амплификации использовали амплифика-тор MiniOpticon (Bio-Rad) с функцией температурного градиента.
Для детекции полученного ПЦР продукта использовали 2,5%-ный агарозный гель на
1x ТАЕ буфере с бромистым этидием. Учет результатов проводили в гельдоку-ментирующей системе BIO-RAD GelDoc XRTM + imagingsystem [3-5].
Результаты и их обсуждение
Для достижения специфичности и чувствительности ПЦР были подобраны оптимальные праймеры, короткие нуклеотид-ные последовательности от 18 до 25 нук-леотидных оснований, то есть комплементарная часть исследуемого генетического материала. После выравнивания нуклеотид-ных последовательностей с использованием алгоритма Clustal W были получены консервативные участки генов. Данный процесс был проведен для каждого из исследованных типов в индивидуальном порядке. После получения консервативных участков гена праймеры сконструировали вручную, без использования каких-либо дополнитель-
Последовательность
ных программ, но учитывали при этом все требования их построения. Основанием для ручного выбора праймеров была высокая вариабельность генома вируса ящура. Результаты представлены в таблице 1.
Для оптимизации условий постановки ПЦР нами поставлен ряд экспериментов с подобранными праймерами. Входе экспериментов были подобраны температура отжига праймеров, время денатурации и концентрация ионов магния. Также был выбран оптимальный вариант температурного режима амплификации фрагментов генома вируса ящура (табл. 2).
Анализ продуктов амплификации ПЦР проводили с помощью 2,5%-ный агарозно-го геля. Наличие фрагментов ПЦР продукта в геле длиной 519 п.н. и 539 п.н. свидетельствовало о присутствии РНК вируса ящура типов А (516 п.н.) и О (539 п.н.) в исследуемой пробе.
Таблица 1
лученных праймеров
Название Последовательности праймеров Размер ПЦР продукта
FMD-OF 5'-CCACTGTTGAGAACTACGGTGG -3' 539 bp.
FMD-OR 5'-CCAAAGAGGCCG GGG GCA GTA-3'
FMD-A F 5'-TCA GCA GAC CCT GTC ACC ACC -3' 516 bp.
FMD-A R 5'-GCG CAC GAG AAG CTC GTG GA -3'
Таблица 2
Температурный режим амплификации фрагментов генома вируса ящура
Стадии амплификации Температура, °С Время Количество циклов
Денатурация 94 30 с 35-40
Отжиг 55 45 с
Элонгация 72 45 с
Финальная элонгация 72 5 мин. 1
1 2 3 4 5 6 7
Тигт-О
Рис. 1. Харатеристика ПЦР продукта в классическом варианте: 1 — маркер; 2-5 — образцы; 6 — отрицательный контроль; 7 — положительный контроль
Как показали результаты экспериментов, с помощью разработанных праймеровнам удалось выявить только тип О возбудителя ящура, на другие типы получены отрицательные результаты.
На втором этапе исследований для проверки специфичности реакции с подобранными праймерами мы провели ПЦР в реальном времени.
Одним из самых современных и экспрессивных вариантов ПЦР является ПЦР в реальном времени. Название отражает общий смысл новой модификации. ПЦР в реальном времени основан на количественной детекции флуоресцентного сигнала, который увеличивается пропорционально количеству ПЦР-продукта. Результат постановки ПЦР в реальном времени можно регистрировать в процессе реакции, в каждый момент времени. Исторически существуют два метода флуоресцентного определения количества ампликонов: использование химических агентов, неспецифически связывающихся с ДНК; использование флуоресцентных зондов (ТадМап зонды и молекулярные маяки (Мо1еси1агЬеасо^), или их называют молекулярными скорпионами (Мо1еси1а^согрю^). При этом неспецифические красители связываются с двойной спиралью ДНК и не связываются с односпи-ральными молекулами. Наиболее известным и широко используемым является краситель SibrGreen.
Ввиду того, что разрабатываемую ПЦР планировали использовать в режиме реального времени с красителем SibrGreen, необходимо было минимизировать образование неспецифических фрагментов, возникающих при постановке ПЦР, с пробами патологического материала. В результате была предложена концепция повышения специфичности реакции путем введения ряда условий, ограничивающих неспецифические реакции с использованием предельных температур, обеспечивающих синтез специфического ампликона, т.е. температуры денатурации, отжига и элонгации.
Проведение ПЦР в режиме реального времени с градиентом температуры от 80 до 95°С показало выраженную зависимость предельно высокой температуры денатурации от размера ампликона. Так, для ам-
пликона размером 539 п.н. синтез блокировался при температуре денатурации 86еС. При более высоких температурах синтезировались неспецифические фрагменты, хотя О для длинных фрагментов возрастало (табл. 3).
Таблица 3 Параметры синтеза ПЦР продуктов при различных температурахденатурации
Температура денатурации С (1)
95,0 30,62
94,1 28,92
92,1 27,47
89,4 20,71
86,0 14,64
83,2 20,03
81,2 20,07
80,0 19,96
Аналогичный подход был использован для подбора оптимальной температуры элонгации. Таким образом, был подобран следующий температурный режим ПЦР реакции в реальном времени.
Таблица 4
Температурный режим к амплификации фрагментов генома вируса ящура типа О в ПЦР RT
Стадии амплификации Температура, °С Время Количество циклов
Удержание 95 1 мин.
Денатурация 94 15 с 35
Отжиг 60 20 с
Элонгация 72 15 с
Далее со всеми исследуемыми пробами провели ПЦР в реальном времени (рис. 2).
Проведенные исследования по оптимизации и подбору праймеров для типизации вируса ящура типов А и О показали их пригодность для выявления РНК возбудителя в исследуемых образцах. В нашем патологическом материале был выделен тип О вируса ящура. Сконструированные праймеры проявили высокую чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов. Полученные праймеры можно использовать при диагностировании типов А и О вируса ящура. Также был подобран оптимальный температурный режим параметров ПЦР в реальном времени с красителем SibrGreen.
/
/ / //
ш\
/ //
ff ff
и ■
м // /и
/ // / я/ /¿У А//
бклоф 6(*1 Мр I Вклада ВкВа | ВиВа Прлвм Ойрмцов I
15 IS II 13
я а к »
2В М 3(1 31 32 33 34 35
Рис. 2. Характеристика полученного ПЦР продукта в реальном времени: 1 — отрицательный контроль; 2 — положительный контроль; 3-7 — исследуемые образцы
Библиографический список
1. Бессарабов Б.Ф., Воронин Е.С. Инфекционные болезни животных / под ред. А.А. Сидорчука. — М.: КолосС, 2007. — 671 с.
2. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Диагностика вирусных болезней животных. — М.: Агропромиздат, 1991. — 528 с.
3. Hoffmann B., Beer M., Reid S.M., Mertens P., et al. A review of RT-PCR technologies used in veterinary virology and disease control: sensitive and specific diagnosis of five livestock diseases notifiable to the World Organization for Animal Health / / Vet. Microbiol. — 2009. — Vol. 139 (1-2). — P. 1-23.
4. Reid S.M., Hutchings G.H., Ferris N.P., De Clercq K. Diagnosis of foot-and-mouth disease by RT-PCR: evaluation of primers for serotypic characterisation of viral RNA in clinical samples // J. Virol. Methods. — 1999. — Vol. 83 (1-2). — P. 113-123.
5. Reid S.M., Grierson S.S., Ferris N.P., Hutchings G.H., Alexandersen S. Evaluation of automated RT-PCR to accelerate the laboratory diagnosis of foot-and-mouth disease virus // J. Virol. Methods. — 2003. — Vol. 107 (2). — P. 129-139.
6. Обострение эпизоотической ситуации по ящуру в Азии / В.М. Авилов, Т.З. Бай-биков, В.Н. Герасимов и др. / / Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантропо-нозными болезнями животных: сб. ст. Междунар. науч.-практ. конф. к 75-летию со дня рождения И.А. Бакулова. — Покров, 2000. — С. 47-49.
Reference
1. Bessarabov B.F., Voronin E.S. In-fektsionnye bolezni zhivotnykh / pod red. A.A. Sidorchuka. - M.: KolosS, 2007. -671 s.
2. Syurin V.N., Belousova R.V., Fomi-na N.V. Diagnostika virusnykh bolezney zhivotnykh. — M.: Agropromizdat, 1991. — 528 s.
3. Hoffmann B., Beer M., Reid S.M., Mertens P., et al. A review of RT-PCR technologies used in veterinary virology and disease control: sensitive and specific diagnosis of five livestock diseases notifiable to the World Organization for Animal Health / / Vet. Microbiol. — 2009. — Vol. 139 (1-2). — P. 1-23.
4. Reid S.M., Hutchings G.H., Ferris N.P., De Clercq K. Diagnosis of foot-and-mouth disease by RT-PCR: evaluation of primers for serotypic characterisation of viral RNA in clinical samples // J. Virol. Methods. — 1999. — Vol. 83 (1-2). — P. 113-123.
5. Reid S.M., Grierson S.S., Ferris N.P., Hutchings G.H., Alexandersen S. Evaluation of automated RT-PCR to accelerate the laboratory diagnosis of foot-and-mouth disease virus // J. Virol. Methods. — 2003. — Vol. 107 (2). — P. 129-139.
6. Obostrenie epizooticheskoy situatsii po yashchuru v Azii / V.M Avilov, T.Z. Baybikov, V.N. Gerasimov i dr. // Diagnostika, profilaktika i mery borby s osobo opasnymi, ekzoticheskimi i zooantropo-noznymi boleznyami zhivotnykh: sb. statey mezhdunar. nauchno-prakt. konf. k 75-letiyu so dnya rozhdeniya I.A. Bakulova. — Pokrov, 2000. — S. 47-49.
+ + +
