CC BY
98
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2010 Биология Вып. 1 (1)
УДК 579.22+579.695
ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОЦЕССА ИММОБИЛИЗАЦИИ КЛЕТОК АЛКАНОТРОФНЫХ РОДОКОККОВ НА ХВОЙНЫХ ОПИЛКАХ В УСЛОВИЯХ КОЛОНОЧНОГО БИОРЕАКТОРА
М. С. Куюкинаа,ъ, И. Б. Ившинаа Ь, М. К. Серебренникова3
а Пермский государственный университет, 614090, Пермь, ул. Букирева, 15, e-mail: [email protected] b Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13, e-mail: [email protected]
Подобран оптимальный режим проведения иммобилизации клеток родококков на гидрофо-бизованных хвойных опилках в условиях лабораторного колоночного биореактора. Показано, что в иммобилизованном состоянии клетки родококоов сохраняют высокую дыхательную активность в присутствии модельной нефти.
Ключевые слова: алканотрофные родококки, иммобилизованные клетки, колоночный биореактор, респирометрия, модельная нефть
Метод адсорбционной иммобилизации клеток микроорганизмов широко используется в различных отраслях биотехнологии, в том числе процессах биокатализа, а также при решении экологических проблем (Козляк и др., 1991). Иммобилизованные микроорганизмы характеризуются повышенной жизнеспособностью, устойчивостью к действию неблагоприятных факторов внешней среды и высокой каталитической активностью, которая во многих случаях возрастает в несколько раз по сравнению со свободными клетками (Синицин и др., 1994). Кроме того, иммобилизация позволяет концентрировать большие количества биомассы и избегать ее значительных потерь, что важно в условиях биореактора, а также при внесении бактериальных клеток в окружающую среду (Podorozhko et al., 2008).
В настоящее время метод адсорбции используется преимущественно для иммобилизации микроорганизмов, участвующих в очистке загрязненного воздуха или сточных вод (Пирог и др., 2005). Наиболее эффективно применение адсорбированных микроорганизмов в системах биофильтров и мембранных биореакторов, предназначенных для обработки жидких и летучих промышленных отходов (Prieto et al., 2002).
Актинобактерии рода Rhodococcus широко используются в биотехнологических процессах. Родо-кокки способны синтезировать поверхностноактивные трегалозолипиды (биосурфактанты), витамины, ферменты, усваивать многие труднодоступные и токсичные для других микроорганизмов органические субстраты, расти в экстремальных условиях среды (Ившина, 1997). Представители от-
© М. С. Куюкина, И. Б. Ившина, М. К. Серебренникова, 2010
69
дельных видов (R. erythropolis, R. ruber и R. opacus) родококков являются активными биодеструкторами нефтяных углеводородов и других ксенобиотиков (Ившина и др., 2006). Закрепление клеток родококков на поверхности носителя позволит более эффективно очищать загрязненную воду от нефти и нефтепродуктов. При этом необходимым условием результативности процесса биодеструкции является достижение высокой численности иммобилизованных клеток и их прочное закрепление на поверхности носителя. В этой связи цель настоящей работы -подбор оптимального режима адсорбционной иммобилизации клеток алканотрофных родококков на органическом носителе в условиях лабораторного колоночного биореактора для последующего использования их в биотехнологии очистки нефтезаг-рязненной воды.
Материалы и методы
В работе использовали штаммы R. ruber ИЭГМ 615 и R. opacus ИЭГМ 249 из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, www.iegm.ru/ iegmcol). Клетки родококков выращивали в 250-мл колбах Эрленмейера, содержащих 100 мл мясопептонного бульона (Oxoid Ltd, Англия) на орбитальном шей-кере (160 об/мин) при 28°С в течение 24 ч. Непосредственно перед иммобилизацией бактериальные клетки отмывали от питательной среды натрий-фосфатным буфером следующего состава, г/л: Na2HPO4 - 3.53; KH2PO4 - 3.39.
В качестве адсорбента клеток родококков использовали твердый органический носитель -хвойные опилки с размером частиц d = 1-3 мм. С целью повышения сродства органического материала к клеткам алканотрофных родококков и углеводородному субстрату носитель предварительно обрабатывали смесью олифы и Rhodococcus-биосурфактанта в соотношении 1:1 (Патент РФ 2298033). Непосредственно перед использованием носитель отмывали дистиллированной водой и стерилизовали автоклавированием (121оС, 15 мин).
Процесс иммобилизации клеток родококков проводили в лабораторном колоночном биореакторе (рис. 1), представляющем собой стеклянную колонку (12.0^1.4 см), заполненную гидрофобизо-ванными опилками (2 г). Колонка соединялась при помощи силиконовых трубок с колбой, содержащей суспензию (2.0*107 кл/мл; 200 мл) клеток R. ruber ИЭГМ 615 и R. opacus ИЭГМ 249, отобранных в равном соотношении. Клеточная суспензия подавалась в колонку с помощью перистальтического насоса через нижнее входное отверстие со скоростью 0.6; 1.2; 2.0 и 2.8 мл/мин, орошала носитель в направлении снизу-вверх, вытекала из колонки через верхнее выходное отверстие и возвращалась в колбу. Таким образом, биореактор являлся замкнутой циркуляционной системой с переменной скоростью потока. Процесс иммобилизации осуществляли при комнатной температуре и контролировали путем измерения оптической плотности (ОП 600 нм) клеточной суспензии с помощью спектрофотометра Lambda EZ 201 (Perkin Elmer, США) в течение 7 сут. Все эксперименты проводили в трехкратной повторности.
Определение каталитической активности иммобилизованных клеток родококков проводили с использованием 6-канального респирометра Micro-Oxymax® (Columbus, США). Оценивали скорость дыхания (в мкл мин-1), а также количество потребленного кислорода и углекислого газа (в мкл) иммобилизованными клетками родококков в
присутствии модельной нефти. В качестве модельной нефти использовали 2% водную эмульсию смеси углеводородов (н-декан, н-ундекан, н-додекан, н-тетрадекан, н-гексадекан, н-гептадекан, н-нонадекан - по 12%, пристан - 6%, нафталин, аценафтен, фе-нантрен, антрацен - по 2%), стабилизированную
0.1% раствором твина 60. Углеводородную эмульсию подвергали УЗ-обработке ^ошргер 150, SANYO, Япония) в течение 2 мин и вносили в колонки с иммобилизованными клетками родокок-ков и неинокулированным носителем, используемым в качестве контроля. Заполненные колонки помещали в измерительные камеры респирометра. Измерения респираторной активности проводили при 22±2оС, интервал между измерениями составлял 0.42 ч.
Результаты и их обсуждение
Анализ динамики иммобилизационного процесса в условиях колоночного биореактора (рис. 2) свидетельствует о том, что закрепление клеток ро-дококков на органическом носителе происходит наиболее интенсивно в течение первых суток эксперимента, в результате чего иммобилизуется от 18 до 36% бактериальных клеток. В дальнейшем наблюдается постепенное замедление процесса клеточной адсорбции и последующая стабилизация показателя оптической плотности суспензии на постоянном уровне, что свидетельствует о достижении уровня адсорбционного насыщения носителя. Следует отметить довольно большие величины доверительных интервалов средних значений показателя оптической плотности суспензии родо-кокков в аналогичных колонках, которые, вероятно, обусловлены неравномерностью распределения адсорбированных бактериальных клеток на поверхности носителя вследствие клеточной ко-агрегации и мозаичности распределения гидрофобных участков материала носителя (Podorozhko et а1., 2008). При этом обнаруживаются существен-
Рис. 1. Колоночный биореактор (А) и экспериментальная установка (Б) по изучению процесса иммобилизации
клеток родококков:
1 - подача жидкости в колонку; 2 - стеклянный фильтр; 3 - гидрофобизованные опилки с иммобилизованными
клетками родококков; 4 - выход жидкости из колонки; 5 - суспензия клеток родококков; 6 - перистальтический на-
сос; 7 - колонка
Оптимизация процесса иммобилизации клеток алканотрофныхродококков ... 71
Время, ч
Рис. 3. Динамика респираторной активности иммобилизованных клеток родококков в условиях колоночного биореактора.
Варианты опыта: 1, 4 - адсорбированные клетки; 2, 3 - неинокулированный ноститель (контроль)
Рис. 2. Динамика процесса иммобилизации клеток родококков в колоночном биореакторе.
Скорость подачи клеточной суспензии в биореактор, мл/мин: А - 2.8; Б - 1.2; В - 0.6; Г - 2.0
ные различия в степени иммобилизации родокок-ков в зависимости от скорости подачи клеточной суспензии в биореактор. Так, наиболее высокая (57%) степень клеточной адсорбции регистрируется при скорости подачи суспензии, равной 2.0 мл/мин, в то время как соответствующие показатели при низкоскоростных (0.6 и 1.2 мл/мин) режимах работы биореактора составляют 46 и 41%, соответственно. Установлено, что дальнейшее увеличение (до 2.8 мл/мин) скорости подачи клеточной суспензии в биореактор не приводит к повышению эффективности иммобилизационного процесса. В частности, показатель оптической плотности суспензии родококков возрастает незначительно к концу наблюдения (рис. 2), что может быть обусловлено физико-химическим процессом вымывания материала носителя и биологическим процессом фрагментации клеточного мицелия при высокоскоростном режиме работы биореактора (Куюкина и др., 2007).
В результате респирометрических исследований установлено, что родококки в иммобилизованном состоянии характеризуются высокой каталитической активностью в отношении модельной нефти. Так, динамика дыхательной активности адсорбированных клеток родококков (рис. 3) характеризуется равномерным увеличением количества потребленного кислорода и выделенного углекислого газа, суммарные величины которых к концу эксперимента превышают контрольные показатели в 5 и 20 раз, соответственно. Кроме того, в условиях колоночного биореактора удельная скорость потребления О2 иммобилизованными родококками достигает 0.6, а выделения СО2 - 1.6 мкл/мин-мг сухих клеток (рис. 4). Такая высокая скорость клеточного дыхания в присутствии нефтяных углеводородов поддерживается в течение 460 ч инкубирования, что свидетельствуют о функциональной стабильности иммобилизованных клеток родокок-ков и перспективности их использования для очистки нефтезагрязненной воды.
■ Скорость потребления О2 ▲ Скорость выделения СО2
Время, ч
Рис. 4. Скорость дыхания иммобилизованных клеток родококков в присутствии модельной нефти
Заключение
Определены оптимальные условия проведения иммобилизации клеток алканотрофных родокок-ков на гидрофобизованных древесных опилках в
условиях лабораторного колоночного биореактора. Установлено, что данный процесс при заданном режиме (2.0 мл/мин) подачи клеточной суспензии в биореактор и концентрации клеток (2.0х107 кл/мл) завершается на 5-е сутки и характеризуется высокой (57%) степенью иммобилизации родококков на органическом носителе. Посредством респирометрии показано, что родококки в иммобилизованном состоянии проявляют стабильно высокую каталитическую активность в отношении нефтяных углеводородов, поддерживаемую в течение трех недель. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о возможности использования иммобилизованных клеток родококков в биотехнологическом процессе очистки нефтезаг-рязненной воды и перспективности осуществления данного процесса в колоночном биореакторе.
Исследование выполнено при поддержке грантов ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. и программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».
Библиографический список
Ившина, И.Б. Бактерии рода Rhodococcus (иммунодиагностика, детекция, биоразнообразие) : дис. ...докт. биол. наук. / Ившина Ирина Борисовна. Пермь, 1997. 197 с.
Ившина, И.Б. Алканотрофные родококки как катализаторы процесса биодеструкции непригодных к использованию лекарственных средств / И.Б. Ившина, М.И. Рычкова, Е.В. Вихарева [и др.] // Прикл. биохим. микробиол. 2006. № 4. С. 443-447.
Козляк, Е.И. Физико-химические основы иммобилизации клеток методом сорбции (Обзор) / Е.И.
Козляк, М.М. Якимов, И.Б. Уткин [и др.] // Прикл. биохим. микробиол. 1991. Т. 27, вып. 6. С. 788-801.
Куюкина, М. С. Кинетическая модель процесса иммобилизации на твердом носителе / М.С. Куюкина, И.Б. Ившина, М.А. Осипенко [и др.] // Рос. журн. биомеханики. 2007. Т. 11, № 2. С. 79-87.
Пирог, Т.П. Использование иммобилизованных на керамзите клеток нефтеокисляющих микроорганизмов для очистки воды от нефти / Т.П. Пирог, Т.А. Шевчук, И.Н. Волошина, Н.Н. Гре-гирчак // Прикл. биохим. микробиол. 2005. Т. 41, № 1. С. 58-63.
Пат. 2298033 Российская Федерация. Композиция для получения носителя иммобилизованных микроорганизмов, расщепляющих углеводороды, и способ получения носителя / Подорожко Е.А., Куюкина М.С., Ившина И.Б., Филп Д.К., Лозинский В.И. Приоритет изобретения 19.04.2005. Зарег. в Госреестре изобр. 27.04.2007.
Синицын, А.П. Иммобилизованные клетки микроорганизмов / А.П. Синицын, Е.И. Райнина, В.И. Лозинский, С.Д. Спасов. М.: Изд-во МГУ, 1994. 288 с.
Podorozhko, E.A. Hydrophobised sawdust as a carrier for immobilisation of the hydrocarbon-oxidizing bacterium Rhodococcus ruber / E.A. Podorozhko, V.I. Lozinsky, I.B. Ivshina [et al.] // Biores. Tech-nol. 2008. Vol. 99. P. 2001-2008.
Prieto, M.B. Biodegradation of phenol in synthetic and industrial wastewater by Rhodococcus eryt-hropolis UPV-1 immobilized in an air-stirred reactor with clarifier / M.B. Prieto, A. Hidalgo, C. Rodriguez-Fernandez [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V. 58. P. 853-859.
Поступила в редакцию 29.03.2010
Optimization of the immobilization process for alkanotrophic rhodococci on a sawdust carrier in the column bioreactor
M.S. Kuyukina, doctor of biology, professor
Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990; [email protected]; (342)2396489
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences. 13, Golev str.,
Perm, Russia, 614081; [email protected]
I.B. Ivshina, doctor of biology, professor, correspondent member of RAS Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990; [email protected]
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences. 13, Golev str., Perm, Russia, 614081; [email protected] M.K. Serebrennikova, student
Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990; [email protected]
An optimal regime of the immobilization process for Rhodococcus cells on a hydrophobized pine sawdust was developed in laboratory column bioreactor conditions. Immobilized rhodococcal cells were shown to maintain high respiration rates during three weeks in the presence of model oil hydrocarbons.
Key words: alkanotrophic rhodococci; immobilized cells; column bioreactor; respirometry; model oil.
Куюкина Мария Станиславовна, доктор биологических наук, профессор
Ившина Ирина Борисовна, доктор биологических наук, профессор, чл.-корр. РАН, зав. лабораторией ГОУВПО «Пермский государственный университет»
ГУ РАН «Институт экологии и генетики УрО РАН»
Серебренникова Марина Константиновна, студент ГОУВПО «Пермский государственный университет»
