CC BY
54
УДК 633.11.581.143.5.631.
оптимизация гормонального состава питательной среды для культивирования
TRITICUMAESTIYUML. IN VITRO
Е.Д. НИКИТИНА, кандидат сельскохозяйственных 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) - это аук-
наук, ученый секретарь
В.Н.МУХИН, ведущий специалист Алтайский НИИ сельского хозяйства, Научный городок, 35, Барнаул, 656910, Россия E-mail: [email protected]
Резюме. Определено оптимальное содержание гормонов в дифференцирующей питательной среде, обеспечивающее реализацию морфогенетического потенциала культуры незрелых зародышей, для четырех сортов мягкой яровой пшеницы: Скала, Спектр, Зарница и Жница. Растения-доноры выращивали в селекционных теплицах арочного типа в зимне-весеннюю вегетацию. Для индукции каллуса использовали экспланты размером 1,5-1,7 мм, которые пассировали на среду Линсмайер и Скуга, содержащую 0,8% агара, 3% сахарозы и 2 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д). Клеточные культуры инкубировали в темноте при температуре 26±1°С. Через 30-35дн., согласно схеме полного факторного эксперимента типа 32, каллусы пересаживали на дифференцирующую среду, дополненную гормонами 2,4-Д на уровнях 0,5; 2,5; 4,0 мг/л и кинетином (6-фурфуриламинопурин) на уровнях 0,5; 2,25; 4,0 мг/л. Повторность каждого из 9 вариантов - четырехкратная. В результате получено 20 математических моделей (4 сорта х 5 этапов регенерации) в виде полиномиальных уравнений второго порядка. оптимальные значения факторов не одинаковы для культур анализируемых генотипов и различных этапов регенерации. Для каллусных тканей сортов Скала и Спектр оптимум по кинетинудля всех этапов регенерации, за исключением частоты морфогенеза, равен 0,5 мл/л. Оптимальные значения по 2,4-Д для этих же сортов, за исключением ризогенеза у сорта Спектр, определились в интервале 2,3-3,2 мг/л, для клеточных культур сортов Зарница и Жница - 0,5-1,9 мг/л. Для реализации регенерационных возможностей любых генотипов рекомендуемый интервал концентрации кинетина составляет 0,51,9 мг/л, 2,4-Д - 1,9-3,2 мг/л. Уровень экзогенных гормонов, необходимых для стеблевой дифференциации ниже, чем для корнеобразования. При концентрации гормонов в среде по 0,5 мг/л частота эмбриоидо-гемморизогенеза составила 87,7%, ризогенеза - 12,3%.
Ключевые слова: яровая мягкая пшеница, культура незрелых зародышей, морфогенез, регенерация растений, регуляторы роста, полный факторный эксперимент типа 32. Для цитирования: Никитина Е.Д. Мухин В.Н. Оптимизация гормонального состава питательной среды для культивирования Triticum aestivum L. in vitro //Достижения науки и техники АПК. 2015. Т. 29. № 6. С. 44-48.
Стабильная регенерация растений - необходимое условие использования культуры ткани.
Гипотеза Скуга и Миллера [1] и ее подтверждение в экспериментах определили широкое использование ауксинов и цитокининов для индукции разных форм морфогенеза in vitro. Считается, что наиболее характерное действие ауксинов - активирование фазы развития клеток. Однако в процессе роста клеток они оказывают свое влияние не только в фазе растяжения, но и могут индуцировать или тормозить процесс деления.
син, который наиболее часто используют для индукции «меристематической» активности. Он был определен Озиас-Акинсом и Вэсилом [2] лучшим гормоном для роста каллуса и регенерации растений в культуре незрелых зародышей мягкой пшеницы. Это положение было подтверждено другими исследователями [3, 4]. Гормон 2,4-Д усваивается медленней, чем индоли-луксусная кислота (ИУК) или нафтилуксусная кислота (НУК) и поэтому он лучше подходит для поддержания морфогенетического состояния. Режим применения гормонов для индукции и пролиферации каллуса, а также морфогенеза относится к числу критических. Известно, что перенос каллуса со среды с высоким содержанием ауксина на среду, содержащую менее активный гормон, либо с более низким или нулевым уровнем, индуцирует эмбриоидогенез. Ингибирова-ние или стимуляция морфогенетических процессов ауксинами определяется возрастом или стадией тканевой культуры, а также остаточным уровнем эндогенного гормона [5].
Эванс с коллегами обобщил данные по природе и количеству цитокининов, необходимых для индукции морфогенеза [6]. При этом они не нашли доказательств того, что указанные соединения нужны для инициации эмбриоидогенеза. Некоторые сообщения [7, 8] показывают, что цитокинины способствуют созреванию соматических зародышей, особенно развитию семядолей, и стимулируют прорастание эмбриоидов.
В научной литературе широко обсуждается вопрос об эффективности определенных сочетаний и концентраций фитогормонов в индукции морфогенетических процессов каллусных культур разных видов растений, в том числе незрелых зародышей пшеницы [9-11]. В этих работах осуществляется эмпирический подбор гормонального состава питательных сред, основной недостаток которого - несистемность используемых вариантов, что может привести к некорректным выводам в результате анализа полученных данных. Для целенаправленного поиска оптимального варианта стимуляторов морфогенеза целесообразно использовать методы планирования эксперимента.
Цель наших исследований - определить оптимальные концентрации гормонов в дифференцирующей питательной среде, обеспечивающие реализацию морфогенетических потенций культуры незрелых зародышей мягкой яровой пшеницы, на основе применения полного факторного эксперимента (ПФЭ) типа 32.
Условия, материалы и методы. По результатам предварительного изучения материалом для исследования выбраны 4 сорта мягкой яровой пшеницы с высоким морфогенетическим и регенерационным потенциалом in vitro: Скала, Зарница, Жница, Спектр.
Таблица 1. Уровни факторов и интервалы варьирования
Наименование Натуральные значения Кодовые значения
кинетин, мг/л 2,4-Д, мг/л Х1 Х2
Интервал варьирования 1,75 1,5 1 1
Основной уровень 2,25 2,0 0 0
Верхний уровень 4,0 3,5 + 1 + 1
Нижний уровень 0,5 0,5 -1 -1
Растения-доноры выращивали в селекционных теплицах арочного типа в зимне-весеннюю вегетацию.
Для индукции каллуса использовали незрелые зародыши размером 1,5-1,7 мм, которые пассировали на среду Линсмайер и Скуга [12], содержащую 0,8% агара, 3% сахарозы, 2 мг/л 2,4-Д. Клеточные культуры выращивали в темноте при температуре 26±1°С. Через 30-35 дн. их пересаживали на дифференцирующую среду, дополненную гормонами 2,4-Д и кинетином (6-фурфуриламинопурин). Концентрация регуляторов роста в средах соответствовала матрице планирования эксперимента (табл. 1).
Согласно цели исследования в качестве параметра оптимизации (отклика) была выбрана частота морфогенетического процесса в культуре незрелых зародышей, а в качестве факторов - концентрации фитогормонов ауксиновой и цитокининовой природы: кинетин (х1) и 2,4-Д (х2).
Корректность применения методов математического планирования в нашем случае обоснована выполнением необходимых предпосылок относительно отклика и факторов. Предварительный анализ изучаемого процесса показал нелинейный характер воздействия указанных факторов на отклик, что послужило основанием для выбора трехуровневого плана. Это обеспечивает воспроизводимость опыта при неизменных условиях его проведения, а также возможность фиксации уровней факторов при их одновременном варьировании, что позволяет в результате реализации экспериментов выразить связь между входным и выходным параметром (функцией отклика) в виде полиномиального уравнения второго порядка:
У = V в,Х+ в,Х2+в11ХХ2+в11Х2+в1Х22; V = 1_5
где вj1 в]2, в]и, в]22, в112- оценки коэффициентов уравнения регрессии, соответствующие отклику у и характеризующие линейные и квадратичные эффекты, а также эффекты взаимодействия факторов х1 и х2; в0 - свободный член уравнения; у - выраженные в процентах показатели: У1 - морфогенез (отношение числа морфогенных линий к общему числу каллусов); У2- эмбриоидо-гемморизогенез (отношение числа эмбриоидов и почек к числу морфогенных каллусов); У3 - ризогенез (отношение числа ризогенных каллусов к числу морфогенных каллусов); У4 - частота
регенерации_1 (отношение числа регенерантов к числу морфогенных каллусов; У5 - частота регенерации_2 (отношение числа регенерантов к числу эмбриоидо-гемморизогенных каллусов).
Построение матрицы плана ПФЭ 32, вычисление коэффициентов, проверку адекватности моделей, нахождение экстремальных точек функции отклика осуществляли согласно таблицам и формулам, приведенным в работе [13]. Графическое представление поверхностей откликов получено с помощью приложения STATGRAPHICS.
При описании путей морфогенеза использовали терминологию, предложенную Т.Б. Батыгиной [14]: эм-бриоидогенез - процесс развития зародышеподобной биполярной структуры (эмбриоида), образующейся асексуально из соматической и половой клеток; а также органогенез предусматривает разделение на два процесса, а именно, гемморизогенез - сопряженное развитие почек и корней; ризогенез - развитие корней.
Для перевода натуральных значений варьирующих факторов в кодовые использовали формулу кодирования:
X = (х- _ х10)/((х™х - х т/п)/2),
где X - кодовое значение /-го фактора; х - натуральное текущее значение /-го фактора; х00 - нулевой уровень фактора.
Согласно плану эксперимента с двумя факторами, которые варьировали на трех уровнях (9 вариантов с четырьмя параллельными наблюдениями в каждой точке), для каждого из четырех сортов и этапов регенерации было реализовано 144 опыта, в результате чего получили 20 математических моделей.
результаты и обсуждение. Абсолютные значения коэффициентов регрессии оценивают линейные и нелинейные эффекты факторов, а знаки при них - направление влияния на отклик. Анализ коэффициентов полиномиальных уравнений регрессии (табл. 2) показывает следующее: повышение концентрации кинетина увеличивает частоту индукции морфогенетических и ризогенных структур, что оказалось характерным для каллусных тканей всех тестируемых сортов. Для эмбриоидо-гемморизогенеза и регенерации растений имеет место обратная реакция на этот гормон. Действие ауксина на этапы регенерации зависит от
Таблица 2. коэффициенты математической модели
Сорт Этап регенерации Коэффициент модели
в0 в1 в2 в11 В22 В12
69,9 0,03* 2,83 1,07* 10,95 0,35*
74,2 -8,46 5,43 8,97 -10,57 1,21*
23,2 5,69 -4,05 -11,05 12,65 0,87*
517,7 -102,98 117,95 -38,55 -93,98 -50,51
457,1 -130,66 118,40 11,1* -140,45 -46,98
75,2 7,08 -1,55* -0,98* 0,46* 6,55
80,6 -8,37 8,88 -3,95 -7,58 8,90
28,5 13,83 -10,73 0,12* -3,82 -3,0
545,1 -116,58 92,97 -7,60* -107,28 -79,59
433,3 -155,61 111,90 21,17 -115,91 -53,98
63,8 1,85 5,55 -7,09 -19,47 3,54
99,8 -7,43 -33,04 -38,58 -23,74 12,50
17,1 2,31* 32,62 21,13 13,95 -9,19
489,3 -64,94 -27,43 -170,47 -168,41 6,25*
237,4 -51,25 -56,45 -76,10 -37,53 28,13
68,5 2,05 9,27 -10,04 -11,18 2,4
64,5 -6,51 -24,07 -11,87 8,25 -3,13*
35,8 6,79 24,02 12,15 -8,8 3,13*
431,2 -43,89 62,5 -79,72 -134,3 0,00*
264,8 -49,04 -13,32 -71,75 -68,49 4,19*
Скала
Спектр
Зарница
Жница
* - незначимые коэффициенты при 5% уровне. Достижения науки и техники АПК. 2015. Т 29. № 6
2
3
4
5
2
3
4
5
2
3
4
5
2
3
4
5
Таблица 3. ранги влияния факторов на совокупность регенерационных процессов
Сорт Фактор
кинетин (х1) 2,4-Д (х) взаимодействие
Скала Спектр Зарница Жница II I IV II I IV II I IV
генотипических особенностей исходных сортов, что отражается в различных знаках коэффициента в2.
рис. 1. Типичные графики отклика и изолиний его равных значений математических моделей оптимизации; а) поверхность отклика; б) уровни равных значений в зависимости от концентрации кинетина (Х1) и 2,4-Д (Х2); Хр Х2 - кодированные.
Наличие значимых коэффициентов квадратичных эффектов и эффекта взаимодействия в большинстве моделей подтверждают гипотезу о нелинейном характере влияния изучаемых факторов на отклик. Отзывчивость клеточных культур на действие обоих гормонов оказалась различной по степени, но стабильной по соотношению ее между сортами, как для главных эффектов, так и для их взаимодействия.
По результатам двухфакторного дисперсионного анализа (генотип, гормоны) были определены доли влияния и взаимодействия факторов, по которым проведено ранжирование (табл.3). Как видно, наиболее отзывчив на гормональные воздействия сорт Спектр. Кроме того, наблюдается равенство рангов в образцах по доле влияния гормонов и их взаимодействия, что, на наш взгляд, указывает на равноценность их участия в инициации регенерационных процессов.
Представляет интерес геометрическая интерпретация полученных математических моделей. Их анализ показал, что поверхности откликов в 11-и случаях имеют гиперболическую форму с седловыми точками и экстремальными значениями на границах эксперимента, в 8-и - эллипсоидальную с максимумом во внутренней области факториального пространства и в одном - эллипсоидную с минимумом (рис. 1).
Экстремальные значения факторов определяли исходя из критериев оптимизации процессов получения максимальной частоты для морфогенеза, эмбриоидо-гемморизогенеза, регенерации и минимальной для ризогенеза. При этом сканированием поверхности
отклика плоскостью, параллельной плоскости факториального пространства, анализировали изолинии с максимальным или минимальным (в соответствии с критерием оптимизации) значением отклика. Из уравнений изолиний x=f(x) рассчитывали координаты экстремальных точек (рис. 2).
Результаты анализа показывают, что оптимальные значения факторов не одинаковы для культур анализируемых сортов и различных этапов регенерации. Так, для каллусных тканей сортов Скала и Спектр оптимум по кинетину на всех этапах регенерации, за
исключением общей частоты морфогенеза, равен минимальному значению в эксперименте, а именно 0,5 мг/л. Оптимальные значения по 2,4-Д для этих же сортов, за исключением ризогенеза у сорта Спектр, определились в интервале 2,3-3,2 мг/л. Низкий уровень концентрации ауксина (0,5 мг/л) для оптимума по частоте корнеобразования у Спектра объясняется наличием отрицательного взаимодействия гормонов (в12 = -3,0, см. табл. 2).
Для клеточных культур сортов Зарница и Жница, соответствующие значения оптимума по 2,4-Д находятся в интервале 0,5-1,9 мг/л, по кинетину - 1,9-2,5 мг/л.
Одной из причин неоднозначного влияния гормонов на морфогенетические процессы in vitro может быть их эндогенный уровень. Работ по изучению связи между содержанием натив-ных гормонов в тканях и морфогенезом недостаточно, но имеющиеся данные [15, 16] подтверждают предположение о том, что наличие в тканях достаточного количества определенного гормона, к примеру, ци-
Рис. 2. Оптимальные значения стимуляторов роста формообразовательных процессов in vitro: +■ - морфогенез; ■-эмбриоидо-гемморизогенез; А-ризогенез; ф -генерация_1 растений.
Таблица 4. влияние концентраций фитогормонов на морфогенетические процессы в культуре незрелых зародышей ^ аestivum
Концентра- Частота образования (%)
ция гормона, мг/л морфогенных каллусов эмбриоидо-гемморизогенных каллусов ризогенных каллусов
кинетин (х1) 2,4-Д (х) Скала Спектр Зарница Жница среднее Скала Спектр Зарница Жница среднее Скала Спектр Зарница Жница среднее
0,5 0,5 81,3 79,5 28,6 37,5 56,7 84,3 82,9 100 83,4 87,7 15,7 17,2 0 16,7 12,4
2,25 0,5 72, 71,1 41,5 45,1 57,7 36,3 40,8 100 100 69,3 63,8 59,2 0 0 30.8
4,0 0,5 81,8 80,1 32,1 41,6 58,9 73,4 70,4 50,0 83,4 69,3 26,6 29,6 50,0 16,7 30,7
0,5 2,0 73,2 71,4 80,4 76,4 75,4 95,8 100 58,4 69,1 80,8 4,2 0 41,6 31,0 19,2
2,25 2,0 67,9 65,8 26,7 38,1 49,6 83,8 85 100 58,4 81,8 16,2 15,0 0 41,6 18,2
4,0 2,0 70,9 86.4 70,2 71,0 74,6 62,5 29,9 63,8 42,5 49,7 37,5 70,2 36,3 57,5 50,4
0,5 3,5 80,3 51,4 16.7 33,1 45,4 75,0 81,3 0 41,7 49,5 25,0 18,8 100 58,4 50,6
2,25 3,5 90,6 90,6 84,4 100 91,4 83,0 96,4 51,8 51,8 70,8 17,0 3,6 48,2 48,2 29,3
4,0 3,5 82,3 78,3 34,4 46,7 60,4 68,7 80,8 0 29,2 44,7 31,3 19,2 100 70,9 55,4
токинина, может объяснить образование стебля и его развитие при отсутствии этого компонента в среде. При добавлении гормона в среду происходит лишь ингибирование образования почек.
линию, с варьированием от 3,2 до 8,2 растений в зависимости от генотипа (табл. 5). Образование корней на этой среде было невысоким и равнялось 19,2% (табл. 4). Следует отметить, что указанные дозы гормонов
Таблица 5. влияние концентраций фитогормонов на регенерацию растений в культуре незрелых зародышей ^ аestivum
Концентрация гормона, мг/л кинетин (х1)\2,4-Д (х2)
Частота регенерации (%) - отношение числа растений к числу
морфогенных каллусов_
Спектр Зарниц^ Жница I среднее
эмбриоидо-гемморизогенных каллусов Скала I Спектр \Зарница\ Жница I среднее
Скала
0,5 0,5 243,5 245,7 225,0 166,7 220,2 288,4 297,9 237,5 200,0 290,5
2,25 0,5 145,0 152,1 279,2 218,8 198,8 400,0 375,0 279,2 218,8 318,3
4,0 0,5 228,4 252,1 112,5 100,0 173,3 312,5 370,9 200,0 125,0 254,4
0,5 2,0 778,4 820,0 337,5 322,7 564,7 814,2 820,0 589,6 467,5 672,8
2,25 2,0 402,5 423,8 79,9 183,3 272,4 471,3 500,0 312,5 312,5 399,1
4,0 2,0 212,3 89,6 142,5 144,9 147,6 350,0 300,0 225,0 354,2 307,3
0,5 3,5 493,8 523,8 0,0 100,0 279,4 771,8 646,7 0,0 250,0 417,1
2,25 3,5 542,8 483,3 278,0 255,4 389,9 654,2 553,7 539,6 493,8 560,3
4,0 3,5 290,7 314,2 0,0 50,1 163,8 438,2 388,8 0,0 175,0 250,5
Если органогенез можно индуцировать с помощью ауксинов или цитокининов, то эмбриоидогенез фактически независим от экзогенных фитогормонов [17]. Обычно эмбриогенные зоны возникают в каллусной ткани на питательной среде, инициирующей каллусо-генез. Развитие эмбриоидов начинается тогда, когда из среды устраняется дедифференцирующий фактор (2,4-Д или другие ауксины). Развивающийся зародыш не нуждается в экзогенных гормонах, так как он сам продуцирует стимуляторы роста. Вполне вероятно, что изменчивость реакции изученных сортов в зависимости от доз ауксина и цитокинина объясняется особенностями их гормонального статуса.
Для формирования эмбриоидо-гемморизогенных структур требуются более низкие концентрации регуляторов роста, чем для корней (табл. 4). Ранее мы установили [18], что процесс образования эмбриоидов и побегов в каллусе - это доминирующий фактор, определяющий уровень регенерации растений в культуре незрелых зародышей пшеницы, а между ризогенезом и частотой регенерации отмечена обратная взаимосвязь. В связи с этим следует создавать условия культивирования клеточных линий, обеспечивающие проявление доминантных положительных коррелятивных связей. Культивирование каллусов на среде, содержащей 0,5 мг/л кинетина и 2,0 мг/л ауксина, позволило получить в среднем по сортам 5,6 растений на одну морфогенную
эффективны для реализации регенерационного потенциала у всех изученных сортов.
выводы. Повышение концентрации кинетина в питательной среде увеличивает частоту индукции морфогенетических и ризогенных структур в каллус-ных тканях всех тестируемых сортов. Для эмбриоидо-гемморизогенеза и регенерации растений имеет место обратная реакция на этот гормон. Эффективность действия ауксина (2,4-Д) на морфогенез и регенерацию растений определяется генотипическими особенностями исходных сортов
Оптимальные значения регуляторов роста не одинаковы для культур анализируемых сортов и различных этапов регенерации. Для реализации регенерационных возможностей сортов яровой мягкой пшеницы рекомендуемые интервалы концентраций составляют 0,51,9 мг/л по кинетину и 1,9-3,2 мг/л по 2,4-Д. Уровень экзогенных гормонов, необходимых для стеблевой дифференциации ниже, чем для корнеобразования. При концентрации регуляторов роста в среде по 0,5 мг/л частота эмбриоидо-гемморизогенеза составила 87,7%, ризогенеза - 12,3%.
Культивирование каллусов на среде, содержащей 0,5 мг/л кинетина и 2,0 мг/л ауксина, позволило получить максимальное число растений-регенерантов у всех генотипов. Среднее значение по сортам составило 5,6 растений на одну морфогенную линию.
Литература
1. Skoog F., Miller C.O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro // Sympos. Soc. Exp. Biol.: Proceed. 1957. N. 2. V. 11. P. 118-131.
2. Ozias-Akins P., Vasil I.K. Plant regeneration from cultured immature embryos and inflorescences of Triticum aestivum (wheat): Evidence for somatic embryogenesis // Protoplasma. 1982. N. 2. V. 110. P. 95-105.
3. Eapen S., Rao P.S. Organogenesis and plantlet formation from callus cultures of different cultivars of bread wheat (T. aestivum) // Proc. Indian Pat. Sci. Acad. 1982. N. 3. P. 371-377.
4. Effect of 2,4 dichlorphenoxyacetic acid and NaCI on the establishment of callus and plant regeneration in durum and bread wheat /A Pellegrineschi, R.M. Brito, S. McLean, D. Hoisington //Plant Cell. Tissue. Organ Cult. 2004. N. 3. 1. V. 77. P. 245-250.
5. Evans D, Sharp W, Flick C. Growth and behavior of cell cultures: embryogenesis and organogenesis // Plant Tissue Culture, methods and applications in agriculture. New York. London, 1981. P. 45-113.
6. Круглова Н.Н., Катасонова А.А. Незрелый зародыш пшеницы как морфогенетический компетентный эксплант// Физиология и биохимия растений. № 2. Т.41. 2009. Р. 124-131.
7. Шаяхметов И.Ф. Культура клеток и тканей пшеницы in vitro и соматический эмбриогенез: Автореф. дисс....д-ра биол. наук. СПб., 2001. 45 с.
8. Gupta S., Rashobte A.M. Down-stream components of cytokinin signaling in plant and the role of cytokinin throughout the plant // Plant Cell Rep. 2012. N. 5. V. 31. P. 801-812.
9. Никитина Е.Д. Роль гормонального состава питательных сред в реализации морфогенетического потенциала клеточных культур T. аestivum // Сб. научных трудов «Сельскохозяйственные ресурсы Алтайского края и повышение эффективности их использования». Барнаул: РАСХН. Сиб. отд-ние, 2000. С. 88-93.
10. Файзиева С.А. Регенерационная активность разных генотипов пшеницы и эгилопса в культуре in vitro: Автореф. дисс.... канд. биол. наук. Душанбе, 2009. 28с.
11. Effect of plant growth regulators on direct shoot regeneration of wheat immature embryonic explants/A. Mokhtari, H. Alizadeh, B. Samadi, M. Omidi, Z. Moeini // Journal of Agricultural Engineering and Biotechnology. 2013. Iss. 3. V.1. P. 74-80.
12. Linsmaier E., Skoog F. Organic growth factor regularments of tobacco tissue culture //Physiol. Plant. 1965. N. 1. V. 18. P. 100-127.
13. Лисенков А.Н. Математические методы планирования многофакторных медико-биологических экспериментов. М.: «Медицина», 1979. С.264-266.
14. Батыгина Т.Б., Васильева В.Е. Размножение растений. СПб.: Изд-во Санкт-Петербургск. ун -та, 2002. 232 с.
15. Копертех Л.Г. Бутенко Р.Г. Нативные фитогормоны экспланта и морфогенез пшеницы in vitro // Физиология растений. 1995. № 4. Т. 42. С. 555-558.
16. Содержание эндогенных гормонов в тканях кукурузы, способных и неспособных к морфогенезу in vitro / Ю.И. Долгих, Пустовойтова Т.Н., Жданова Н.Е., Осипова Е.А. //II Международная конференция «Физиология растений - основа фитобио-технологии». Пенза, 15-21 сентября 2003 г. Тезисы докладов. М.: ИФР РАН, 2003. С. 389.
17. Зайнутдинова Э.М. Эмбриоидогенез видов рода Triticum aestivum в каллусной культуре in vitro: автореф. дисс....канд. биол. наук. Уфа, 2005. 27с.
18. Никитина Е.Д. Формообразовательные процессы в культуре незрелых зародышей Triticum aestivum L. и их взаимосвязь // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. 2014. №4 (114). С.48-52.
OPTIMIZATION OF HORMONE COMPOSITION OF NuTRIENT MEDIuM FOR TRITICUM AESTIVUM L. CULTIVATION IN VITRO
E.D. Nikitina, V.N. Mukhin
Altai Research Institute of Agriculture, Nauchny gorodok, 35, Barnaul, 656910, Russia
Summary. The investigations were carried out to determine the optimal content of hormones in the differential nutrient medium providing the realization of morphogenetic potencies of immature embryos culture of four spring soft wheat varieties Skala, Spektr, Zarnitsa and Zhnitsa. Donor plants were grown in breeding greenhouses of arched type during winter-spring vegetation period. For callus induction the explants 1.5...1.7 mm in size were used, which were subsequently passed to Linsmaier and Skoog medium, possessing 0.8 % of agar, 3 % of sucrose and 2 mg/l of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Cell cultures were incubated in darkness at the temperature 26 ± 1degrees. In 30.35 days in accordance with the scheme of complete factorial experiment of 3E2 type calluses were passed to differential medium supplemented with 2,4-D at the levels of 0.5, 2.5, 4.0 mg/l and with kinetin (6-furfurylaminopurine) at the levels of 0.5, 2.25 and 4.0 mg/l. Number of replications for each of 9 variants is four. As a result 20 mathematic models (4 varieties x 5 stages of regeneration) designed as polynomial equations of second order were obtained. The optimal values of factors are not equal for cultures with genotypes analyzed and for different regeneration stages. For callus tissues of varieties Skala and Spektr the optimum on kinetin for all regeneration stages was 0.5 ml/l except for the morphogenesis. Optimal values of 2,4-D for the same varieties, except for rhizogenesis of Spectr variety, were within 2.3.3.2 mg/l. For cell cultures of Zarnitsa and Zhnitsa they were 0.5.1.9 mg/l. Recommended concentration intervals are 0.5..1.9 mg/l of kinetin and 1.9.3.2 of 2,4-D. The level of exogenic hormones necessary for stem differentiation is lower than the one for root formation. When the hormone concentration was 0.5 mg/l the frequency of embryoido-hemmorhizogenesis was 87.7 %, of rhizogenesis - 12.3 %.
Keywords: spring soft wheat, immature embryos culture, morphogenesis, plants regeneration, growth regulators, complete factorial experiment of 3E2 type.
Author Details: E.D. Nikitina, Cand. Sc. (Agr.), Scientific Secritary (e-mail: [email protected]); V.N. Mukhin, Lead Specialist.
For citation: Nikitina E.D., Mukhin V.N. Optimization of hormone composition of nutrient medium for Triticum Aestivum l. cultivation in
vitro // Dostizheniya nauki i tekhnikiAPK. 2015. V. 29. № 6. pp. 44-48 (In Russ).
вниманию соискателей ученых степеней и других заинтересованных лиЦ!
Редакция журнала «Достижения науки и техники АПК» издает монографии и другую книжную продукцию с редактированием и всеми выходными данными.
Цены договорные. Заявки отправлять по адресу: 101000, г. Москва, Моспочтамт, а/я 166. Тел.: (495) 557-13-01, (916) 241-63-43. E-mail: [email protected]
J
