CC BY
18О.Г. Парахневич1, Н.П. Янюк1, Т.В. Трухачева1, А.И. Жебентяев2
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОПУТСТВУЮЩИХ ПРИМЕСЕЙ В ГЛАЗНЫХ КАПЛЯХ ПРОЛОНГИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ НА ОСНОВЕ ТИМОЛОЛА ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ
1РУП «Белмедпрепараты», г. Минск 2Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет
Разработаны методики определения сопутствующих примесей в пролонгированной форме глазных капель Тимолол-лонг методами тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии. На основании валидационных данных установлено, что разработанные методики приемлемы и позволяют проводить контроль качества лекарственного средства Тимолол-лонг.
Подобраны условия пробоподготовки лекарственного средства для проведения анализа. Исследованы образцы лекарственного средства, полученные в условиях стрессовых испытаний: кипячение, кислотный (0,2 МHCl) и щелочной (0,2 MNaOH) гидролиз.
Разработанная методика определения сопутствующих примесей методом ТСХ позволяет разделять компоненты состава и надежно определять продукты разложения тимолола. Предложена система растворителей этилацетат — спирт метиловый — аммиака раствор концентрированный (80:18:4). Методика позволяет идентифицировать действующее вещество тимолол и консервант бензалкония хлорид. Методика провалидирована по основным параметрам: специфичность, повторяемость, предел обнаружения.
Подтверждена пригодность методики определения сопутствующих примесей тимолола методом ВЭЖХ в вязких растворах, содержащих гипромеллозу и повидон, по валидационной характеристике специфичность.
Ключевые слова: сопутствующие примеси, тимолол, капли глазные, ТСХ, ВЭЖХ, стрессовые испытания.
Вестник фармации №3 (61) 2013 ВВЕДЕНИЕ
С целью повышения терапевтической эффективности и потребительских свойств широко применяемого антиглау-комного средства тимолола малеата разработана пролонгированная форма глазных капель на его основе - лекарственное средство Тимолол-лонг [1]. Важным условием подтверждения качества разработанного лекарственного средства является проведение испытаний на соответствие показателям качества для глазных капель, предусмотренных в ТКП 123-2008 (02040). В зависимости от природы лекарственного вещества осуществляется контроль качества по показателю «Сопутствующие примеси» [2].
Тимолол малеат - неселективный бета-адреноблокатор, по своей структуре является левовращающим изомером, ^)-энантиомером. Химическое название: (2S)-1-[(1,1-диметилэтил)-амино]-[[4-(морфолин-4-ил)-1,2,5-тиадиазолил-3-ил] окси]пропан-2-ола ^)-бутендионат [3].
В субстанции тимолола малеата контролируется содержание ^)-энантиомера методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) по показателю «Энантиомерная чистота». Анализ выполняется с использованием хроматографиче-ской колонки, заполненной силикагелем OD для хиральных разделений, и спектро-фотометрического детектора при длине волны 297 нм [3,4]. Количественное содержание других примесей в субстанции ти-молола малеата контролируется методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) по показателю «Сопутствующие примеси», содержание любой примеси допускается до 0,4% [3,4]. В Американской Фармакопее регламентируется как содержание единичной примеси до 0,4%, так и суммарное содержание сопутствующих примесей до 1% [5].
В частной статье «Тимолол, глазные капли» содержание примесей контролируется по показателю «Сопутствующие примеси» методом ВЭЖХ [4]. Для определения примесей в глазных каплях на основе тимолола применяют также методы высокоэффективной тонкослойной хроматографии [6,7] и ультраэффективной жидкостной хроматографии [8,9].
Ранее нами разработана методика определения сопутствующих примесей
в глазных каплях Тимолол, раствор 2,5 и 5,0 мг/мл, методом ТСХ [10]. Данная методика разработана на основе методики, используемой для определения примесей в субстанции тимолола малеата. Корректировка методики позволила обеспечить эффективное разделение продуктов разложения тимолола и достоверно оценить содержание единичной примеси до 0,5% и суммарное содержание примесей до 1%.
Указанные методики определения сопутствующих примесей применимы для водных растворов тимолола, не содержащих в своем составе полимерных композиций. При анализе сопутствующих примесей в глазных каплях тимолола пролонгированного действия на основе полимерной композиции гипромеллозы и повидона методики нуждаются в усовершенствовании. Применение метода ВЭЖХ ограничивается использованием для анализа проб, содержащих гипромеллозу, так как полимер сорбируется на носителе, вследствие чего существенно сокращается количество анализов, на которые рассчитана хрома-тографическая колонка. При применении метода ТСХ отмечено ухудшение разделительно-абсорбционных свойств сорбента силикагеля, вследствие чего не достигается разделения компонентов состава лекарственного средства, содержащих гипро-меллозу. В связи с этим необходимо разработать процедуру пробоподготовки, чтобы устранить мешающее влияние полимера гипромеллозы, и подобрать условия проведения анализа, позволяющие четко разделять компоненты состава и определять продукты разложения тимолола.
Целью настоящего исследования является разработка методик ТСХ и ВЭЖХ определения сопутствующих примесей в глазных каплях пролонгированного действия тимолола на основе полимерной композиции гипромеллозы и повидона и проведение валидации методик испытаний.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Оценка содержания сопутствующих примесей в лекарственном средстве Тимолол-лонг проводилась методами ТСХ и ВЭЖХ.
Объекты исследования. Субстанция тимолола малеат (НД РБ 0108С-2010), образцы лекарственного средства Тимолол-лонг, 5 мг/мл.
Подготовку проб к анализу проводили путем удаления гипромеллозы из лекарственного средства при нагревании до температуры 70°С. Горячий раствор с образовавшимися сгустками полимера быстро фильтровали через бумажный фильтр «красная лента». Фильтрат охлаждали и использовали в качестве пробы для хрома-тографирования.
С целью получения продуктов разложения тимолола смоделированы условия стрессовых испытаний: кипячение в течение 12 ч с использованием обратного холодильника; кислотный и щелочной гидролиз 0,2 M раствором хлористоводородной кислоты и 0,2 М раствором гидроксида натрия, соответственно, с последующим кипячением растворов в течение 3 ч. Для стрессовых испытаний готовили модельный раствор, содержащий все компоненты состава ЛС, за исключением гипромеллозы.
Метод ТСХ. Для определения сопутствующих примесей методом ТСХ готовили растворы сравнения тимолола и бен-залкония хлорида. Субстанцию тимолола малеата растворяли в воде: раствор сравнения (а) (концентрация 5 мг/мл) и раствор сравнения (б) (концентрация 0,05 мг/мл). Раствор сравнения бензалкония хлорида готовили растворением в воде бензалко-ния хлорида (концентрация 0,1 мг/мл) и натрия хлорида (концентрация 2,3 мг/мл).
На хроматографическую пластинку со слоем силикагеля F254 (фирма Merck) наносили пробы лекарственного средства, освобожденного от гипромеллозы, или модельных растворов после стрессовых испытаний в количестве 100 мкг, раствора сравнения тимолола (б) - 1 мкг и 0,5 мкг. Для идентификации действующего вещества тимолола и консерванта бензалкония хлорида в одну точку наносили пробы раствора сравнения тимолола (а) в количестве 100 мкг и бензалкония хлорида в количестве 1 мкг. Пластинку хроматографирова-ли восходящим способом с последующим проявлением в парах йода в течение 2 ч.
С целью выбора оптимальных хрома-тографических условий разделения компонентов и фиксации продуктов разложения тимолола исследованы различные системы растворителей:
1) метиленхлорид - спирт метиловый - раствор аммиака концентрированный (80:20:1);
2) хлороформ - спирт метиловый -
раствор аммиака концентрированный (80:20:1);
3) этилацетат - спирт метиловый -спирт изопропиловый - раствор аммиака концентрированный (80:20:2:1);
4) этилацетат - спирт метиловый -раствор аммиака концентрированный (80:18:2);
5) этилацетат - спирт метиловый -раствор аммиака концентрированный (80:18:4).
Наиболее подходящей для выполнения поставленной цели оказалась система растворителей 5, которая включена в методику определения сопутствующих примесей в лекарственном средстве Тимолол-лонг. Методика определения сопутствующих примесей проверена по валидационным характеристикам: специфичность, сходимость, предел обнаружения.
Для подтверждения специфичности проводили сравнительную оценку результатов анализа, полученных с использованием системы растворителей 5 и фармакопейной методики на субстанцию тимолола малеат с использованием системы растворителей 1. На линию старта одной хрома-тографической пластинки наносили по 20 мкл (100 мкг) раствора лекарственного средства после кипячения и раствора сравнения тимолола (а), хроматографировали в системе растворителей 1. На вторую пластинку дополнительно наносили раствор сравнения тимолола (а) после кипячения и хроматографировали в системе растворителей 5.
Сходимость методики оценивали по результатам 6 параллельных испытаний одной серии лекарственного средства Тимолол-лонг, 5 мг/мл. На линию старта хроматографической пластинки наносили по 20 мкл (100 мкг) раствора лекарственного средства после кипячения и раствора сравнения тимолола (а), 20 мкл (1 мкг) и 10 мкл (0,5 мкг) раствора сравнения тимо-лола (б), рассчитывали значения Rf пятен тимолола и продуктов разложения.
Для установления предела обнаружения определяли минимальное количество нанесенной пробы, при котором тимолол может обнаруживаться в условиях хрома-тографирования по разработанной методике. На хроматографическую пластинку наносили пробы растворов тимолола в количестве 1 мкг, 0,75 мкг, 0,5 мкг, 0,25 мкг, 0,125 мкг, приготовленных последователь-
ным разведением раствора сравнения ти-молола (а).
Метод ВЭЖХ. Для определения сопутствующих примесей методом ВЭЖХ применяли жидкостный хроматограф «Shimadzu» (Япония), оснащенный спек-трофотометрическим детектором модели SPD-10AVP с диапазоном длин волн от 190 до 600 нм, двухканальным насосом модели LC-10ATVP и воздушным термостатом модели СТО-10 AVP. Хроматографическая колонка «Agilent» - Zorbax Eclipse XDB-C18 размером 250 х 4,6 мм (5 мкм), температура колонки 25°С. В качестве подвижной фазы использовали смесь 4,32 г/л раствора натрия октансульфоната - метанол в соотношении 42,5:57,50, доведенную уксусной кислотой до значения рН 3,0; скорость подвижной фазы - 1,0 мл/мин. Детектирование проводили при длине волны 295 нм; объем вводимой пробы - 20 мкл; время хроматографирования составляло 40 мин.
Исследовали лекарственное средство Тимолол-лонг, модельные растворы и растворы сравнения:
- раствор сравнения А: 1,0 мл лекарственного средства доводили до объема 250,0 мл раствором подвижной фазы;
- раствор сравнения Б: 1,0 мл лекарственного средства доводили до объема 500,0 мл раствором подвижной фазы;
- раствор сравнения В: раствор 300 г/л кислоты малеиновой в подвижной фазе;
- раствор сравнения Г: к 1,0 мл раствора сравнения А прибавляли 1,0 мл раствора сравнения В.
Количественную оценку дополнительных пиков на хроматограммах лекарственного средства проводили их сравнением с площадями основных пиков на хромато-граммах растворов сравнения А (0,4%) и Б (0,2%). Сумма площадей всех пиков примесей для лекарственного средства должна быть не более 2,5 площадей основного пика на хроматограмме раствора сравнения А (1%).
Для доказательства специфичности методики проведено стрессовое тестирование раствора субстанции тимолола малеата 6,84 мг/мл и модельных растворов лекарственного средства: кипячение в течение 12 ч; кислотный гидролиз 0,2 M раствором хлористоводородной кислоты и щелочной гидролиз 0,2 М раствором ги-дроксида натрия с последующим кипячением образцов в течение 1 и 3 ч. Анали-
зировали полученные растворы, раствор сравнения Г и раствор плацебо, приготовленный из всех компонентов кроме действующего вещества тимолола.
С целью идентификации примесей по методикам ТСХ и ВЭЖХ проводили удаление с пластин ТСХ слоя силикагеля с сорбированным на нем веществом примеси. Для этого использовали хроматограммы ТСХ модельного раствора ЛС, полученного после проведения щелочного гидролиза 0,2 М раствором гидроксида натрия в течение 3 ч кипячения. Хроматограммы облучали УФ-светом (254 нм) и определяли пятна примесей. Слой силикагеля, содержащий исследуемую примесь в виде пятна на пластине ТСХ, аккуратно удаляли и вносили в пробирку. Примеси экстрагировали 0,5 мл метанола в течение 30 мин при перемешивании на встряхивателе Т-22 (Чехия). К полученной смеси добавляли 0,5 мл воды, перемешивали и фильтровали через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм. Полученные пробы хроматографировали в условиях проведения анализа методом ВЭЖХ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Основными методами определения сопутствующих примесей в лекарственных средствах являются методы тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Для определения сопутствующих примесей методом ТСХ в лекарственном средстве Тимолол-лонг разработана процедура пробоподготовки, обеспечивающая удаление гипромеллозы из анализируемой пробы, так как в ее присутствии ухудшаются разделительно-абсорбционные свойства сорбента силикагеля (рисунок 1, хромато-грамма А). Гипромеллоза хорошо растворима в холодной воде и нерастворима в горячей. Удаление гипромеллозы из лекарственного средства Тимолол-лонг достигалось путем нагревания лекарственного средства до 70°С с последующим удалением осадка полимера при фильтровании. Полученный таким образом фильтрат был пригоден для проведения исследований (рисунок 1, хроматограмма Б).
Результаты проведенных исследований влияния температурного воздействия на стабильность действующего вещества тимолола методами ТСХ и ВЭЖХ до-
казали пригодность выбранных условий пробоподготовки. Анализ хроматограмм модельных растворов лекарственного средства: 1) не содержащих в своем составе гипромеллозу, 2) не содержащих ги-промеллозу и нагретых до 70°С; 3) содержащих гипромеллозу и нагретых до 70°С, с последующим удалением полимера при фильтрации, подтвердил, что при нагревании до 70°С не происходит разложения тимолола и увеличения количественного содержания примесей.
На первом этапе разработки методики определения сопутствующих примесей в лекарственном средстве Тимолол-лонг был использован метод ТСХ. В качестве под-
• • * •
А Б В Г Д Е
А - лекарственное средство Тимолол-лонг; Б - лекарственное средство Тимолол-лонг (100 мкг тимола), освобожденное от гипромеллозы; В - растворы сравнения тимолола (100 мкг тимола) и бензалкония хлорида; Г - раствор сравнения тимолола (1 мкг тимола); Д - раствор сравнения тимолола (0,5 мкг тимола); Е - раствор сравнения повидона.
Рисунок 1 - Хроматограммы, полученные с использованием системы растворителей: хлороформ - спирт метиловый - раствор аммиака концентрированный (80:20:1)
вижных фаз апробированы системы растворителей: метиленхлорид - спирт метиловый - раствор аммиака концентрированный (80:20:1) (система 1) [4]; хлороформ - спирт метиловый - раствор аммиака концентрированный (80:20:1) (система 2) [5].
По результатам исследования хромато-грамм лекарственного средства Тимолол-лонг, полученных при хроматографирова-нии в системах растворителей 1 и 2, установлено наличие на каждой хроматограмме пятна с Rf около 0,7, соответствующего по положению, форме и интенсивности окрашивания основному пятну на хромато-грамме раствора сравнения тимолола (а), и пятна, вытянутого от линии старта интенсивной окраски. Подтверждением того, что вытянутое пятно соответствует повидону, является идентичность пятен на хромато-граммах раствора сравнения повидона и лекарственного средства (рисунок 1, хро-матограммы Б и Е). При хроматографиро-вании как в системе растворителей 1, так и в системе 2, обнаруживаемые на хрома-тограммах пятна тимолола и повидона подобны между собой. Хроматографирование в системе растворителей 2 позволяет обнаруживать также основное пятно на хрома-тограмме раствора сравнения бензалкония хлорида 0,1), подобное пятно не наблюдается при хроматографировании в системе растворителей 1. Обнаружению пятна бензалкония хлорида на хроматограмме лекарственного средства при хроматогра-фировании в системе 2 мешает пятно пови-дона (рисунок 1, хроматограммы Б, В и Е). Таким образом, в системах растворителей 1 и 2 не наблюдается четкого разделения компонентов состава лекарственного средства Тимолол-лонг, что может также препятствовать обнаружению возможных продуктов разложения тимолола.
С целью лучшего разделения компонентов состава лекарственного средства Тимолол-лонг проведен поиск подходящей хроматографической системы. С этой целью исследованы системы растворителей: этилацетат - спирт метиловый - спирт изо-пропиловый - раствор аммиака концентрированный (80:20:2:1) (система 3) [6], этилацетат - спирт метиловый - аммиака раствор концентрированный (80:18:2) (система 4) [7] и предложенное нами соотношение растворителей: этилацетат - спирт метиловый - аммиака раствор концентрированный (80:18:4) (система 5).
Анализ полученных хроматограмм показал, что при хроматографировании в системе 3 пятно повидона, вытянутое от линии старта, затрудняет обнаружение бензалкония хлорида; а в системах растворителей 4 и 5 обеспечивается хорошее разделение компонентов, входящих в состав исследуемого лекарственного средства, что делает возможным обнаружение консерванта бензалкония хлорида ^ около 0,1). Однако заметное различие в разделительной способности хроматографи-ческих систем 4 и 5 обнаружилось при исследовании хроматограмм модельного раствора, полученного в условиях стрессового испытания - кипячение в течение 12 ч. При использовании системы раство-
Таким образом, система растворителей этилацетат - спирт метиловый -аммиака раствор концентрированный (80:18:4) позволяет четко разделять и идентифицировать компоненты состава лекарственного средства Тимолол-лонг, а также надежно определять продукты разложения тимолола.
При выполнении валидационных испытаний проводилась оценка специфичности сравнением результатов анализа, полученных с использованием системы
рителей 4 на хроматограмме модельного раствора обнаружено два продукта разложения тимолола, значения Rf которых составляли 0,8 и 0,18. В условиях хрома-тографирования системы 5 наблюдалось четкое разделение трех продуктов разложения со значениями Rf 0,8, 0,3 и 0,18, значение Rf основного пятна тимолола составляло 0,7. Такие же значения Rf тимо-лола и его продуктов разложения получены при исследовании модельных растворов тимолола после кипячения в системах растворителей 1 и 2.
В таблице 1 приведены результаты анализа хроматограмм, полученных при использовании исследуемых систем растворителей.
растворителей 5, и методики, применяемой для определения сопутствующих примесей в субстанции тимолола малеата с использованием системы растворителей 1. Результаты, полученные при хроматогра-фировании лекарственного средства после стрессовых испытаний - кипячение в течение 12 ч, оказались идентичными для двух систем: на хроматограммах, кроме основного пятна, обнаруживаются дополнительно три пятна продуктов разложения тимо-лола (рисунки 2 и 3). Отсутствие влияния
Таблица 1 - Состав систем растворителей для идентификации тимолола и бензалкония хлорида и обнаружения сопутствующих примесей в ЛС Тимолол-лонг методом ТСХ
Система растворителей Значения Rf Характеристика
Тимо- лол Продукты разложения тимолола Бензалкония хлорид пятна повидона
1 метиленхлорид - спирт метиловый - раствор аммиака концентрированный (80:20:1) 0,7 0,8 0,3 0,18 не обнаруживается вытянутое пятно от линии старта
2 хлороформ - спирт метиловый - раствор аммиака концентрированный (80:20:1) 0,7 0,8 0,3 0,18 не обнаруживается вследствие перекрывания
3 этилацетат - спирт метиловый - спирт изопропиловый - раствор аммиака концентрированный (80:20:2:1) 0,42 0,66 0,16 не обнаруживается вследствие перекрывания
4 этилацетат - спирт метиловый - аммиака раствор концентрированный (80:18:2) 0,7 0,8 0,18 0,1 пятно на линии старта
5 этилацетат - спирт метиловый - аммиака раствор концентрированный (80:18:4) 0,7 0,8 0,3 0,18 0,1
А - лекарственное средство после стрессовых испытаний; Б - раствор сравнения тимолола
Рисунок 2 - Хроматограммы, полученные в условиях системы 1
А - лекарственное средство после стрессовых испытаний; Б - раствор сравнения тимолола свежеприготовленный; В - раствор сравнения
тимолола после стрессового испытания; Г - раствор сравнения бензалкония хлорида; Д - раствор плацебо
компонентов плацебо на результат определения продуктов разложения в системе 5 было доказано при сравнении хромато-грамм лекарственного средства и раствора сравнения тимолола после стрессовых испытаний: пятна продуктов разложения на двух хроматограммах идентичны по положению, величине и интенсивности, на хроматограмме раствора плацебо эти пятна отсутствуют. Обнаруживаемое дополнительное пятно со значением Rf около 0,1 на хроматограмме лекарственного средства является пятном бензалкония хлорида. Идентификация этого пятна проведена
Рисунок 3 - Хроматограммы, полученные в условиях системы 5
сравнением с хроматограммами растворов бензалкония хлорида (рисунок 3).
В ходе проведения валидационных испытаний подтверждена сходимость методики. Получены сравнимые результаты в ходе проведения шести испытаний в одинаковых условиях хроматографирования: значения Rf пятна тимолола на хромато-граммах лекарственного средства соответствовали значениям Rf основных пятен растворов сравнения около 0,7); на хроматограмме лекарственного средства после стрессовых испытаний обнаруживалось одинаковое число пятен продуктов
разложения с приближенно повторяющимися значениями Rf 0,18; 0,3; 0,8 и наблюдалось четкое разделение пятен тимола и продуктов разложения. Среднее значение Rf бензалкония хлорида составляло 0,1.
При исследовании предела обнаружения установлено, что интенсивность основных пятен достаточна для визуального обнаружения при нанесении проб в количествах 1 мкг, 0,75 мкг и 0,5 мкг тимолола, при 0,25 мкг обнаруживается пятно слабой интенсивности, при 0,125 мкг пятно не обнаруживается.
Полученные результаты указывают на то, что разработанная методика количественного определения сопутствующих примесей позволяет определять продукты разложения тимолола в количестве от 0,25 мкг (0,25%) до 0,5 мкг (0,5%). Для количественной оценки предложено нормировать содержание любой примеси не более 0,5% и суммарное содержание примесей не более 1%.
С целью повышения уровня стандартизации и сопоставления с результатами, полученными при определении сопутствующих примесей методом ТСХ, оценку количественного содержания сопутствующих примесей в лекарственном средстве Тимолол-лонг проводили методом ВЭЖХ. Методика ВЭЖХ основана на методике, описанной в частной статье «Тимолол, капли глазные» Британской Фармакопеи, которая регламентирует наличие одной единичной примеси 0,4% и наличие двух примесей по 0,2%. Для выполнения этой методики рекомендуется использовать хроматографическую колонку размером 250^4,6 мм, заполненную эндкепирован-ным октилсилильным силикагелем (10 мкм). Использована хроматографическая колонка Zorbax Eclipse XDB-C18 размером 250^4,6 мм (5 мкм) при температуре 25° С. При проведении исследований подтверждена пригодность выбранной хроматогра-фической системы для проведения анализа. Эффективность хроматографической колонки, рассчитанная по пику тимолола на хроматограмме раствора сравнения А, составила 2000 теоретических тарелок; фактор асимметрии пика, рассчитанный по пику тимолола на хроматограмме раствора сравнения А - 2,5; разрешение между пиком кислоты малеиновой и пиком ти-молола на хроматограмме раствора сравнения Г - 5; относительное стандартное
отклонение, рассчитанное для площади пика тимолола из хроматограмм раствора сравнения А, не превысило 3%.
При исследовании специфичности методики установлено, что компоненты плацебо и малеиновая кислота не влияют на количественное содержание сопутствующих примесей в лекарственном средстве. На хроматограмме раствора плацебо отсутствовали пики со временами удерживания, совпадающими со временами удерживания пиков тимолола и продуктов его разложения на хроматограммах раствора субстанции тимолола малеата и модельного раствора лекарственного средства, полученных в условиях стрессовых испытаний (кипячение в течение 12 ч, щелочной в 0,2 М NaOH и кислотный в 0,2 М HCl гидролиз при кипячении (в течение 3 ч). На хроматограммах модельных растворов пики продуктов разложения тимолола отделены друг от друга и от вспомогательных компонентов ЛС. Определено, что пик со временем удерживания менее 2,5 минут принадлежит малеиновой кислоте и компонентам плацебо и не учитывается при определении сопутствующих примесей.
На рисунке 4 представлена хромато-грамма приготовленного лекарственного средства Тимолол-лонг. На хроматограм-ме кроме основного пика тимолола наблюдается наличие дополнительного пика со временем удерживания около 8,8 мин, содержание примеси составило менее 0,05%.
Присутствие гипромеллозы в пробах удлиняет время анализа из-за необходимости длительной отмывки колонки, поскольку остаточные количества гипромел-лозы влияют на ее разделительную способность, в результате сокращается срок ее использования. Поэтому нами был опробован прием по удалению гипромеллозы из ЛС Тимолол-лонг перед проведением анализа по показателю «Сопутствующие примеси» в соответствии с описанным выше способом. Полученные результаты показали, что хроматограммы ЛС, содержащего в составе гипромеллозу, и ЛС, освобожденного от гипромеллозы, являются полностью идентичными. Следовательно, удаление гипромеллозы из исследуемого образца предложенным способом не оказывает влияния на качественный и количественный состав возможных примесей. Этот вывод подтвержден при анализе модельного раствора ЛС после 12 ч кипяче-
ния. Для приготовления проб для анализа модельный раствор был разделен на две части. К одной из частей добавили гипро-меллозу, обеспечивая концентрацию в соответствии с составом ЛС Тимолол-лонг, и затем гипромеллозу удалили из образца. В соответствии с разработанной методикой ВЭЖХ в полученных растворах провели определение сопутствующих примесей. Показано, что по составу и количественному содержанию примеси полностью идентичны на обеих хроматограммах.
Таким образом, было подтверждено, что при определении сопутствующих примесей в лекарственном средстве Тимолол-лонг правомерно использовать предложенную нами пробоподготовку по удалению гипромеллозы из анализируемых образцов.
На хроматограммах модельных растворов лекарственного средства, полученных после кипячения в течение 12 ч, наблюдается образование дополнительных пиков (рисунок 5). Количественная оценка примесей представлена в таблице 2.
По результатам анализа можно выделить основные примеси, количества которых увеличиваются в процессе кипячения. Это примеси со временами удерживания около 2,8 и 5,7 мин, содержание которых составило менее 0,3%, и примеси со временами удерживания около 4,7 и 8,8 мин, содержание которых составило 1,6 и 3,6%, соответственно.
Увеличение содержания продуктов разложения тимолола отмечено в условиях щелочного гидролиза. При щелочном
-Detector 295nm '12.316
молол
\
\
v
7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 min
Рисунок 4 - Хроматограмма лекарственного средства Тимолол-лонг
Detector 2 55nm
молол
44
s
г \
ц V L \ _ i
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 min
Рисунок 5 - Хроматограмма модельного раствора лекарственного средства Тимолол-лонг после кипячения в течение 12 ч
0.0
2.5
5.0
50
45
Таблица 2 - Результаты анализа модельного раствора лекарственного средства Тимолол-лонг после кипячения в течение 12 ч
Наименование продукта Время удерживания, мин Площадь пика Содержание примесей, %
примесь 1 2,79 201802 0,25
примесь 2 3,76 51511 0,06
примесь 3 4,69 1230664 1,60
примесь 4 5,74 209874 0,27
примесь 5 8,83 2732064 3,60
тимолол 6 12,46 - -
разложении в течение 1 ч наблюдалось значительное увеличение содержания примеси со временем удерживания около 2,8 мин - до 3,2%. Дополнительные примеси со временами удерживания 4,7 и 8,8 мин составили 1,35% и 3,0%, соответственно.
После 3 ч кипячения в 0,2 М растворе натрия гидроксида кроме существенного увеличения содержания примесей со временами удерживания около 2,8 (25,2%); 4,8 (18,2%) и 8,9 (26,9%) мин наблюдается образование двух дополнительных примесей со временами удерживания около 7,7 мин (0,3%) и 11,6 мин (8,4%).
На рисунках 6 и 7 представлены хро-матограммы модельных растворов лекарственного средства, подвергнутых кипяче-
нию в течение 1 ч и 3 ч в присутствии 0,2 М NaOH. Количественная оценка продуктов разложения тимолола представлена в таблицах 3 и 4, соответственно.
На рисунке 8 представлена хромато-грамма модельного раствора лекарственного средства Тимолол-лонг, подвергнутого кипячению в течение 3 ч в присутствии 0,2 М HCl. В данных условиях ЛС стабильно, что подтверждается практически полным отсутствием дополнительных пиков продуктов разложения.
Модельные растворы лекарственного средства, для которых был проведен анализ сопутствующих примесей по разработанной методике ВЭЖХ, дополнительно проанализированы по методике ТСХ.
Detector A: '58 m 5 £
с с
1
\
[ \ / WL l \ J,
—7fr-
Рисунок 6 - Хроматограмма модельного раствора лекарственного средства Тимолол-лонг, подвергнутого кипячению в течение 1 ч в присутствии 0,2 М №ОН
Таблица 3 - Результаты анализа модельного раствора лекарственного средства
Наименование Время Площадь пика Содержание примесей, %
продукта удерживания, мин
примесь 1 2,82 2409732 3,20
примесь 2 4,72 1010472 1,35
примесь 3 8,82 2314746 3,00
тимолол 4 12,52 - -
50
0.0
2.5
5.0
7.5
0.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
25.0
27.5
30.0
32.5
35.0
37.5
m п
Рисунок 7 - Хроматограмма модельного раствора лекарственного средства Тимолол-лонг, подвергнутого кипячению в течение 3 ч в присутствии 0,2 М №ОН
Таблица 4 - Результаты анализа модельного раствора лекарственного средства Тимолол-_лонг, подвергнутого кипячению в течение 1 ч в присутствии 0,2 М №ОН_
Наименование продукта Время удерживания, мин Площадь пика Содержание примесей, %
примесь 1 2,84 18921557 25,2
примесь 2 4,81 13677857 18,2
примесь 3 7,78 204903 0,30
примесь 4 8,89 20173394 26,9
примесь 5 11,63 3615240 8,42
тимолол 6 13,0 - -
На хроматограммах модельного рас- кроме основного пятна тимолола ^ около
твора после 12 ч кипячения и модельно- 0,7) визуально обнаруживались дополни-
го раствора, подвергнутого кипячению в тельные пятна со значениями Rf около 0,8,
течение 3 ч в присутствии 0,2 М №ОН, 0,3 и 0,18.
Detecto A :295n 1
Е5 \
лт^А-__ V .i'
Рисунок 8 - Хроматограмма модельного раствора лекарственного средства Тимолол-лонг, подвергнутого кипячению в течение 3 ч в присутствии 0,2 М HCl
На хроматограмме модельного раство- со значениями Rf около 0,85, 0,8, 0,6, 0,3 и
ра, подвергнутого кипячению в течение 0,18 и было отмечено заметное уменьше-
3 ч в присутствии 0,2 М NaOH, наблюда- ние размера и интенсивности окрашивалось образование дополнительных пятен ния основного пятна тимолола.
ь
о
о.о
ь.о
о.о
о
2о.о
2Ь.о
зо.о
о
На хроматограмме модельного раствора, подвергнутого кипячению в течение 3 ч в присутствии 0,2 М HCl, не было обнаружено дополнительных пятен, кроме основного пятна тимолола. Полученные результаты свидетельствуют об устойчивости действующего вещества тимолола в кислой среде.
В отсутствие стандартов примесей тимолола не представлялось возможным идентифицировать полученные в условиях стрессовых испытаний продукты разложения тимолола в лекарственном средстве Тимолол-лонг. Однако в результате проведенного исследования по сопоставлению значений Rf пятен на хроматограммах ТСХ временам удерживания пиков на хромато-граммах ВЭЖХ удалось установить следующее: примеси с Rf около 0,18 соответ-
ствует примесь со временем удерживания около 2,8 мин; примеси с Rf около 0,3 соответствует примесь со временем удерживания около 4,7 мин; примеси с Rf около 0,6 соответствует примесь со временем удерживания около 7,8 мин; примеси с Rf около 0,8 соответствует примесь со временем удерживания около 8,8 мин, примеси с Rf около 0,85 соответствует примесь со временем удерживания около 11,6 мин.
На образование до трех основных продуктов разложения тимолола указывается исследователями в работах [6,8,9]. Продуктами разложения тимолола могут быть изотимолол, димер тимолола малеата, ги-дроксиморфолинотиадиазол [6,8] (рисунок 9). Однако, авторы работ [6,9] не исключают образование и других примесей.
/Ч
N. N HO H
ж 4 HC — COOH
Тимолола малеат, S-энантиомер
\\ // "V
_ 1-'—OCH—C—ch—
W
C-CH—NH HC —COOH
I
C(CH3)3
^s. Изотимолол
N N
HC — COOH
У ^N^-^-OCH-CH2 NH HC — COOH
\_/ CHOH
C(CH3)3
^s^ Димер тимолола малеата
NN NN
\\ // \\ И r~\
О -OCH2CHO^-N О
\_/ CH2NHC(CH3)3 \_/
CH2NHC(CH3)3
HC — COOH
II
HC — COOH
/4
N N
Гидроксиморфолинотиадиазол
N-
ОН
Рисунок 9 - Тимолола малеат и его продукты разложения
Принимая во внимание литературные данные и результаты, полученные нами при анализе модельных растворов после проведения стрессовых испытаний, мы предположили, что примесью, имеющей Rf около 0,8 или время удерживания око-
ло 8,8 мин, является изотимолол. Структура соединения указывает, что в полярной системе растворителей, используемой в методике ТСХ, данное вещество является более подвижным, чем тимолол, и соответственно имеет большее значение R„ чем
О
основное пятно. Низкие значения Rf продуктов разложения тимолола указывают, что образовавшиеся вещества менее подвижны, чем тимолол.
По полученным результатам анализа сопутствующих примесей методом ВЭЖХ можно предположить, что в модельных растворах после проведения стрессовых испытаний отсутствует такой продукт, как димер тимолола малеата. В условиях предлагаемой методики с использованием об-ращенно-фазовой ВЭЖХ время удерживания соединений растет с увеличением их неполярности. Структура соединения ди-мера тимолола малеата предполагает, что данное соединение имеет время удерживания большее, чем тимолол. На хромато-граммах исследуемых модельных растворов не было обнаружено пика, имеющего время удерживания большее, чем тимолол.
Следует отметить, что результаты изучения стабильности глазных капель Тимолол-лонг, полученные в течение 3 лет наблюдения в условиях долгосрочных испытаний, указывают на достаточно хорошую стабильность лекарственной формы. При исследовании лекарственного средства Тимолол-лонг на хроматограммах ВЭЖХ обнаружены два дополнительных пика со временами удерживания около 2,7 и 8,8 мин, содержание которых составило около 0,3% и 0,1%, соответственно. Наиболее вероятным продуктом разложения тимолола, имеющим время удерживания около 2,7 мин (или Rf 0,18), является 4-гидрокси-3-морфолино-1,2,5-тиадиазол.
Таким образом, разработанные условия выполнения методик с применением методов ВЭЖХ и ТСХ позволяют разделять и определять основные продукты разложения тимолола.
Метод ВЭЖХ является более чувствительным при определении количественного содержания единичных примесей тимолола. Подобранные условия хрома-тографирования позволяют проводить определение сопутствующих примесей тимолола в присутствии гипромеллозы. Освобождение лекарственного средства от гипромеллозы в условиях пробоподго-товки дает точные результаты определения сопутствующих примесей и может быть рекомендовано для выполнения анализа с целью увеличения срока использования дорогостоящих хроматографических колонок. Для методики ВЭЖХ нормировано
содержание единичной примеси не более 0,4% или двух примесей не более 0,2%, суммы примесей - не более 1%.
Методика ТСХ разрабатывалась и вали-дировалась с целью обеспечения хорошего разделения компонентов, входящих в состав вязких растворов тимолола, и достоверности результатов анализа, она проста в исполнении для проведения рутинных анализов и доступна с точки зрения применяемой аппаратуры. При этом правомерность её применения была подтверждена сопоставлением результатов анализа, полученных при использовании более современной и высокоточной методики ВЭЖХ: на хро-матограмме ТСХ фиксируются продукты разложения тимолола. Для интерпретации полученных результатов количественное содержание единичной примеси допускается не более 0,5%, суммы примесей - не более 1%. Разработанная методика включена в ФСП РБ 1522-10 на лекарственное средство «Тимолол-лонг, раствор (капли глазные) 5 мг/мл» для контроля качества по показателю «Сопутствующие примеси».
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. Разработаны и провалидированы методики определения сопутствующих примесей в пролонгированной форме глазных капель тимолола на основе полимерной композиции гипромеллозы и повидона методами ТСХ и ВЭЖХ. Методики позволяют разделять и определять основные продукты разложения тимолола. Для данных методик установлены нормы содержания единичной примеси (0,5% для ТСХ и 0,4% для ВЭЖХ) и суммы примесей в количестве 1%.
2. При использовании метода ТСХ достигнуто полное разделение компонентов, входящих в состав ЛС Тимолол-лонг, и продуктов разложения тимолола в условиях системы растворителей: этилацетат - спирт метиловый - аммиака раствор концентрированный (80:18:4). Методика позволяет дополнительно идентифицировать действующее вещество тимолол и консервант бензалкония хлорид.
3. Предложена процедура пробоподго-товки для ВЭЖХ методики, позволяющая наряду с получением достоверных результатов определения сопутствующих примесей в глазных каплях тимола пролонгированного действия продлить эксплуатационные сроки хроматографических колонок.
Вестник фармации №3 (61) 2013 SUMMARY
O.G. Parakhnevich, N.P. Yanyuk,
T.V. Trukhachоva, A.I. Zhebentyaev
DETERMINATION OF RELATED SUBSTANCES OF TIMOLOL-LONG EYE DROPS BY CHROMATOGRAPHIC METHODS
Techniques of related substances in the prolonged eye drops Timolol-long by methods of a thin layer and highly effective liquid chromatography are developed. On the basis of the received data of validation it was established that the developed techniques comprehensible and allow spending quality control of medicine Timolol-long.
Conditions of sample preparation of medicine for analyses are fined. The samples of medicine received in the conditions of stressful tests are investigated: boiling, acid (0,2 M of HCl) and alkaline (0,2 M NaOH) hydrolysis.
The technique of related substances by TLC method allows accurately to find the components of the formulation and reliably to fix the degraded products. The mobile phase ethyl acetate - methanol - ammonia (80:18:4) is suggested. The technique allows identifying the active substance timolol and preservative benzalconium chloride. The technique was validated with characteristics: specificity, repeatability, limit of detection.
Suitability of a technique of timolol related substances in viscous solutions containing hypromellose and povidone by HPLC method is confirmed according to the characteristic specificity.
Keywords: related substances, timolol, eye drops, TLC, HPLC, stressful test.
ЛИТЕРАТУРА
1. Разработка состава пролонгированных глазных капель тимолола / О.Г. Парах-невич [и др.] // Вестник фармации. - 2012. - №1 (55). - С. 45 - 53.
2. Фармакопейные статьи. Порядок разработки и утверждения: ТКП 123-2008 (02040) - Введ. 18.02.08. - Минск: Министерство здравоохранения Республики Беларусь, 2008. - С.23.
3. Государственная фармакопея Республики Беларусь: в 3 т. / УП «Центр экспертиз и испытаний в здравоохранении», 2006 - 2009. - Т. 1. Общие методы контроля качества лекарственных средств / УП «Центр экспертиз и испытаний в здравоох-
ранении»; под общ. ред. Г.В. Годовальни-кова. - Минск: Минский государственный ПТК полиграфии, 2006. - 656 с; - Т. 2. Контроль качества вспомогательных веществ и лекарственного растительного сырья / УП «Центр экспертиз и испытаний в здравоохранении»; под общ. ред. А.А. Шеряко-ва. - Молодечно: «Типография «Победа»,
2008. - 472 с.
4. British Pharmacopoeia 2009 [Электронный ресурс]. - Электрон., текстовые дан. и прогр. -Effective date: 1 January
2009. - CD-ROM version.
5. United States Pharmacopоeia 32 - National Formulary 27. The Official Compendia of Standards [Электронный ресурс]. - Электрон., текстовые дан. и прогр. - Official May 1, 2009.
- Электрон.опт. диск (CD-ROM).
6. Kulkarni, S.P. Stability indicating HPTLC determination of timolol maleate as bulk drug and in pharmaceutical preparations / S.P. Kulkarni, P.D. Amin // J. Pharm. Biomed. Anal. - 2000. - Vol. 23. - P. 983 - 987.
7. Densitometric and videodensitometric TLC determination of timolol and betaxolol in ophthalmic solutions / H. Hopkala [et al.] // Journal of planar chromatography. - 2003. -Vol. 16, № 4. - P. 280-285.
8. Sharma Nitish. A Novel and Rapid Validated Stability-Indicating UPLC Method of Related Substances for Dorzolamide Hy-drochloride and Timolol Maleate in Ophthalmic Dosage Form / Nitish Sharma, Surendra Singh Rao, A. Malleswara Reddy // Journal of Chromatographic Science. - 2012. - Vol. 50. - P. 745-755.
9. Collaborative study of a liquid chro-matographic method for the determination of R-timolol and other related substances in S-timolol maleate / Marini R.D. [et al.] // Ana-lytica Chimica Acta. -2005. -Vol. 546, № 2.
- P. 182-192.
10. Разработка технологии и оценка качества глазных капель тимолола / О.Г. Парахневич, [и др.] // Вестник фармации.
- 2009. - №2 (44). - С. 43 - 47.
Адрес для корреспонденции:
220007, Республика Беларусь, г. Минск, ул. Фабрициуса, 30, РУП «Белмедпрепараты», тел./факс 8(017)220 31 42, е-mail: nfc@belmedpreparaty. com. Парахневич О.Г.
Поступила 02.09.2013 г.
