CC BY
33
УДК 636.4.087.61
Канд. биол. наук Л.Е. КОЛЕСНИКОВ
(ФГБОУ ВО СПбГАУ, kleon9@yandex.ru) Инженер-микробиолог В.М. ШАПКИН (ФГБНУ ВНИИСХМ, vasyashappa@gmail.com) Аспирант А.О. ЗВЕРЕВ (ФГБНУ ВНИИСХМ)
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СИМБИОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ШТАММОВ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ ЛЮЦЕРНЫ (Sinorhizobium meliloti) В УСЛОВИЯХ СОЛЕВОГО СТРЕССА
Повышение плодородия почвы является одной из важнейших задач современной агрономической науки. Микроорганизмы играют существенную роль в минеральном питании растений, в том числе - в биологической азотофиксации. Несмотря на значительные успехи ученых, достигнутые в исследованиях по данной проблеме, практическое использование эффективных растительно-микробных систем остается пока на низком уровне [1].
В настоящее время наиболее интенсивно изучается эндосимбиоз, образуемый бобовыми растениями (сем. Fabaceae) и клубеньковыми бактериями, или ризобиями (сем. Rhizobiaceae) [2]. В данной системе оба организма получают пользу: растение - усваиваемый им азот в виде NH3-NH4+, а клубеньковые бактерии (ризобии) - органические соединения (дикарбоновые кислоты), необходимые для их жизнедеятельности в симбиотических образованиях - корневых клубеньках. На начальных стадиях инвазии и при нарушении регуляции бобово-ризобиальный симбиоз (БРС) имеет сходство с фитопатогенной системой, в становлении и развитии которой важную роль играют АФК и АФА - активные радикальные и нерадикальные формы кислорода и азота [3].
В клубеньках бобовых содержатся различные ферменты и метаболиты ("антиоксиданты"), которые предотвращают накопление потенциально токсичных концентраций активных форм кислорода (АФК) и предотвращают "окислительный стресс". Последний возникает, когда антиоксидантная система перегружена избыточным производством АФК, и проявляется накоплением продуктов окисления липидов, белков и ДНК. Антиоксиданты также защищают клеточные компоненты от повреждений АФА. Окисление (АФК) и нитрозирование (АФА) специфических белков могут иметь как сигнальные, так и регуляторные функции [4].
Наиболее распространенными водорастворимыми антиоксидантами в клубеньках являются аскорбиновая кислота (витамин C) и глутатион, со средней концентрацией 0,5-2 мМ. Аскорбат имеет способность ликвидировать свободные радикалы и другие АФК, также он необходим в аскорбат-глутатионовом цикле для детоксикации H2O2. Глутатион (GSH) является важным антиоксидантом; продуктом восстановления дисульфидной связи окисленного глутатиона (GSSG) с помощью фермента глутатионредуктазы (GR). Немаловажную роль играют также ферменты глутатионпероксидазы (GP), защищающие клетки от окислительного повреждения (ключевой фермент азотфиксации, нитрогеназа, является чувствительным к кислороду) [5].
Многие другие метаболиты, содержащиеся в клубеньках, также имеют антиоксидантные свойства, но их роль in vitro мало изучена. К таким можно отнести токоферолы (витамин Е) и убихинол-10, они присутствуют в мембранах клубеньковых клеток и действуют в качестве цепных антиоксидантов перекисного окисления липидов.
Цель исследования - анализ симбиотической активности двух азотфиксирующих штаммов Sinorhizobium meliloti в стандартных условиях и в условиях засоленности, а также определение антиоксидантной активности в клубеньках люцерны, образованных изучаемыми штаммами.
Материалы, методы и объекты исследования. Растительным материалом для исследования служила люцерна посевная Medicago sativa L. (сорт «Вега»). Для инокуляции растений использовали два азотфиксирующих штамма клубеньковых бактерий (Sinorhizobium meliloti) - природный штамм Ter57, выделенный из почв Голицкого заказника (Тернопольская обл., Украина), и лабораторный штамм СХМ1-188. Штаммы были получены из Всероссийской коллекции непатогенных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ФГБНУ ВНИИСХМ.
Растения люцерны выращивали в стерильных пробирках на агаризованной среде Красильникова-Кореняко при стандартных условиях и в условиях солевого стресса. Для создания стрессовых условий в питательную среду вносили 75 мМ NaCl. Однодневные проростки растений инокулировали 1 мл суспензии, содержащей клетки клубеньковых бактерий (107 - 108 клеток в мл). Растения выращивали при температуре 20-250С в теплице в течение 6 недель. Опыт проводили в 6 повторностях. Симбиотическую активность штаммов S. meliloti оценивали по сухой надземной массе инокулированных растений люцерны относительно контроля без инокуляции.
Клубеньки отбирали с каждого растения и объединяли в общую усредненную пробу. Гомогенизация навесок растительного сырья (4-10 мг) была осуществлена механическим путем.
Антиоксидантную активность исследуемых клубеньков оценивали по способности ингибировать аутоокисление гормона надпочечников адреналина in vitro, и тем самым предотвращать образование активных форм кислорода. Продукты окисления адреналина определяли спектрометрическим методом, основанном на экстинкции, при длине волны 347 нм [6].
Антиоксидантную активность (АОА) клубеньков выражали в процентах ингибирования аутоокисления адреналина и вычисляли по формуле:
АОА = ((Di - D2)/DI)*100 (%),
где D1 - оптическая плотность продуктов окисления адреналина, D2- то же в сочетании с растительным материалом. Величину АОА более 10% считали свидетельствующей о наличии антиоксидантной активности.
Кроме того, антиоксидантную активность выражали в милиграммах дигидрокверцетина (ДГК) в 1 г исследуемого материала. Для пересчета АОА в содержание эталонного вещества - дигидрокверцетина - вначале был построен калибровочный график, отражающий динамику накопления продуктов аутоокисления адреналина в присутствии эталонного раствора 5 мкМ дигидрокверцетина. Сравнение с калибровочным графиком результатов анализа растительного материала позволило провести указанный выше пересчет.
Для математического анализа данных использовали методы описательной статистики, реализованные в пакетах прикладных программ Statistica 8.0, IBM SPSS 21.0, Microsoft Excel 2016.
Результаты исследования. В контроле растения без инокуляции (КБИ) отличались меньшими размерами, желтоватой окраской, и их вегетативная масса составляла Мв=9,4±0,4 г. Растения люцерны, инокулированные штаммами клубеньковых бактерий Ter57 и СХМ1-188, в стандартных условиях были темно-зеленого цвета, крупными и отличались на 191,7% (Мв=27,3 ± 3,1 г, критерий Стьюдента - t=5,7) и 95,5% (Мв=18,3 ± 2,3 г, t=3,8) большей вегетативной массой по сравнению с контролем. Штамм Ter57 показал более высокое значение вегетативной массы растений, чем штамм СХМ1-188, в 1,5 раза.
В условиях солевого стресса контрольные растения люцерны (без инокуляции) проросли только в половине пробирок, и сухая вегетативная масса была равна 8,1 ± 0,6 мг. Растения, инокулированные штаммом Ter57, выросли только в 4-х из 6-и пробирок, и среднее значение их сухой массы составляло 12,5 ± 1,8 мг. Средняя сухая масса растений, инокулированных штаммом СХМ1-188, была 8,6 ± 0,7 мг, то есть в 1,54 раза меньше, чем при инокуляции штаммом Ter57 (рис.1).
Тег57 СХМ1 -188 КБ И Тег57 СХМ1-188 КБ И
Стандартные Солевой стресс
Условия
Рис. 1. Результаты измерения симбиотической активности штаммов ^ твЫоа (по показателю сухой надземной массы люцерны, мг)
Таким образом, при засолении только штамм Тег57 достоверно отличался от контроля без инокуляции по эффективности увеличения сухой массы растений (прибавка составила 54%).
В стандартных условиях растения люцерны, инокулированные штаммами Тег57 и СХМ1-188, образовывали в среднем клубеньков 6 ± 1,1 шт. и 6,2± 1,1 шт. на растение соответственно. В условиях солевого стресса - 4,8 ± 1,0 и 5,5 ± 0,5 шт. на растение соответственно. В контроле клубеньки не образовывались. В условиях солевого стресса в вариантах с инокуляцией растений штаммами Ter57 и СХМ1-188 число клубеньков недостоверно снижалось по сравнению со стандартными условиями (на 20,8% при 1=0,8 и на 10,8% при 1=1,7).
ю -
Тег5/ СХМ1-188 КБИ Тег57 СХМ1-188 КБИ
Стандартные Солевой стресс
Условия
Рис. 2. Результаты измерения симбиотической активности штаммов & твЫоа (по показателю число клубеньков на растение, шт.)
В среднем, по числу клубеньков на растение, штамм СХМ1-188 оказался эффективнее штамма Тег57 на 2,8% в нормальных условиях, но менее эффективен, на 15,8% - в условиях солевого стресса (рис.2).
Е—1 Ь-О £ О ^
С— 3 О X 1=; !=: с о
и £
и рц
Ё к Е £
о В
'Контроль ■Соленой стркс
ОД 0Г03 0г0б 0.04 0Г02 0
Нормальны г условия
10
12345673?
минуты
Рис. 3. График изменения оптической плотности при исследовании АОА в клубеньках люцерны,
штамм Тег57
8Г
и
с =
к г.
2 5
70% 60% 50% 40%
Ш
\ \ —_,зр-ь т
Солевой стресс
у 9
П
И <
I зо%
20%
10% 0%
Нормальные условия
Контроль
№—№Ь ——ОН—ОН—ОМ—0% —ОИ —№ — № ■ 1 3 3 4 5 6 1 £ 9 10
Шнуты
Рис. 4. АОА в клубеньках люцерны, штамм Тег57
Антиоксидантная активность в клубеньках измерялась в течение 10 мин. при длине волны 347 нм (рис. 3). Клубеньки, отобранные с растений, выращенных в нормальных условиях, обладают меньшей антиоксидантной активностью на 11% по сравнению с клубеньками, полученными с растений, выращенных в условиях солевого стресса.
Степень активности антиоксидантных веществ в вытяжке резко снижалась после первых 3 мин. взаимодействия со свободными радикалами (образовавшимися в процессе аутоокисления адреналина), а к 8-й мин. сводилась к нулю. Тогда как вытяжка из клубеньков растений, выращенных в солевом стрессе, показала устойчивое пролонгированное действие,
и даже на 10-ю мин. измерений показывала мощный антиоксидантный эффект (рис. 4). Клубеньки, обладающие большей АОА, имеют большие показатели содержания антиоксидантов в пересчете на мг дигидрокерцетина (ДГК). В условиях солевого стресса при антиоксидантной активности, достигающей 74%, в клубеньках содержится эквивалент 29,1 мг эталонного антиоксиданта ДГК, а в стандартных условиях, при 63% АОА - только 14,9 мг.
Выводы. На основании полученных данных выявлено, что штамм Ter57 Sinorhizobium meliloti по симбиотической эффективности превышал лабораторный штамм СХМ1-188 как в стандартных условиях, так и в условиях солевого стресса. В солевых условиях штамм Ter57 способствовал образованию у растений люцерны помимо белых клубеньков небольшого количества розовых клубеньков, тогда как воздействие штамма СХМ1-188 приводило к формированию только белых клубеньков. В условиях солевого стресса в клубеньках люцерны, инокулированной штаммом Ter57, выявлено большее накопление антиоксидантных веществ по сравнению со стандартными условиями выращивания культуры.
Литература
1. Атласова Л.Г. Симбиотическая деятельность клубеньковых бактерий сортов и селекционных линий люцерны в условиях Центральной Якутии // Научные ведомости. Серия естественные науки. - 2011. - № 9 (104). -Выпуск 15/2. - С. 100-104.
2. Жуков В.А., Рычагова Т.С., Штарк О.Ю., Борисов А.Ю., Тихонович И.А. Генетический контроль специфичности взаимодействия бобовых растений с клубеньковыми бактериями // Экологическая генетика. - 2008. - том VI. - № 4. - С. 12-19.
3. Полесская О.Г. Растительная клетка и активные формы кислорода. - М.: Книжный дом «Университет», 2007. - 140 с.
4. Mittler R., Vanderauwera S., Gollery M., Van Breusegem F. Reactive oxygen genenetwork of plants// Trends Plant Sci. - 2004. - V 9. - P. 490-498.
5. Matamoros M.A., Loscos J., Coronado M.J., Ramos J., Sato S., Testillano P.S. Biosynthesis of ascorbic acid in legume root nodules//Plant Physiol. - 2006. - V 141. - P. 1068-1077.
6. Патент № 2144674 РФ. Способ определения антиоксидантной активности супероксидисмутазы и химических соединений. Сирота Т.В.: заявл: 1999-02-24, опубликов.: 20.01.2000.
Literatura
1. Atlasova L.G. Simbioticheskaia deiatel'nost' clubenkovykh bakterii sortov i selektcionny'kh linii liutcerny' v usloviiakh Central'noi' Iakutii // Nauchny'e vedomosti. Seriia estestvenny'e nauki. - 2011. - № 9 (104). -Vypusk 15/2. - S. 100-104.
2. Zhukov V.A., Rychagova T.S., Shtark O.Iu., Borisov A.Iu., Tihonovich I.A. Geneticheskii kontror spetcifichnosti vzaimodei'stviia bobovykh rastenii' s clubenkovymi bakteriiami//E'kologicheskaia genetika. - 2008. - tom VI. - № 4. - S. 12-19.
3. Polesskaia O.G. Rastitel naia cletka i aktivny e formy' kisloroda. - M.: KnizhnyT dom «Universitet», 2007. - 140 s.
4. Mittler R., Vanderauwera S., Gollery M., Van Breusegem F. Reactive oxygen genenetwork of plants// Trends Plant Sci. - 2004. - V 9. - P. 490-498.
5. Matamoros M.A., Loscos J., Coronado M. J., Ramos J., Sato S., Testillano P.S. Biosynthesis of ascorbic acid in legume root nodules // Plant Physiol. - 2006. - V 141. - P. 1068-1077.
6. Patent № 2144674 RF. Sposob opredeleniia antioksidantnoi aktivnosti superoksidismutazy' i himicheskikh soedinenii\ Sirota T.V.: zaiavl: 1999-02-24, opublikov.: 20.01.2000.
