CC BY
45
Hygiene & Sanitation (Russian Journal). 2016; 95(11)
_DOI: http://dx.doi.org/10.1882/0016-9900-2016-95-11-1105-1107
Original article
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 614.72:632.952]-074:543.544.45
Волкова В.Н., Мухина Л.П., ЧистоваЖ.А., Федорова С.Г.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛИОКСИНА Б В ВОЗДУШНОЙ СРЕДЕ И В СМЫВАХ С КОЖНЫХ ПОКРОВОВ ОПЕРАТОРОВ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
ФБУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора, 141014, Мытищи
Полиоксин B - эффективный ингибитор синтеза хитина клеточной стенки многих фитопатогенных грибов рекомендуется в качестве фунгицида для борьбы с фитопатогенными организмами, наносящими ущерб растениеводству. Для определения экспозиции работающих с пестицидами разработан метод измерения концентраций полиоксина B в воздухе рабочей зоны, в атмосферном воздухе населенных мест и смывах с кожных покровов операторов, основанный на высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектором (длина волны детектирования 270 нм), включающий отбор проб воздушной среды на сорбционные трубки ORBOTM-44, заполненные сорбентом XAD-2, экстракцию полиоксина сорбента смесью метиловый спирт-вода в соотношении 95:5, смыв с поверхности кожных покровов этиловым спиртом способом обмыва, концентрирование, количественный хроматографический анализ. Нижние пределы количественного определения полиоксина B в воздухе рабочей зоны 0, 2 мг/м3 при аспирации 2 дм3 воздуха, атмосферном воздухе 0,016 мг/м3 при аспирации 25 дм3 воздуха, смывах с кожных покровов 0,4 мкг/смыв, диапазон линейности определяемых концентраций 0,2-2,4 мкг/см3, суммарная погрешность измерения концентраций полиоксина B в воздушной среде составляет 17%; в смывах с кожных покровов - 6%. Метод апробирован в натурных исследованиях при определении экспозиционных уровней полиоксина в пробах воздуха рабочей зоны, атмосферного воздуха в пределах санитарного разрыва, смывов с кожных покровов работающих и воздушных сносов, отобранных при обработке роз в теплице и при мониторинге фитосанитарного состояния растений через день после обработки.
Ключевые слова: полиоксин B, воздушная среда, смывы с кожных покровов операторов, аналитический контроль экспозиции.
Для цитирования: Волкова В.Н., Мухина Л.П., Чистова Ж.А., Федорова С.Г. Определение полиоксина Б в воздушной среде и в смывах с кожных покровов операторов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Гигиена и санитария. 2016; 95(11): 1105-1107. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0016-9900-2016-95-11-1105-1107
Volkova V.N., Mukhina L.P., Chistova Zh.A., Fedorova S.G.
DETERMINATION OF POLIOKSIN B IN THE AIR ENVIRONMENT AND IN WASHOUTS FROM SKIN OF OPERATORS BY HPLC
F.F. Erisman Federal Research Center of Hygiene, Mytischi, 141014, Russian Federation
Polyoxin B being an effective inhibitor of synthesis of chitin of the cell wall of many phytopathogenic fungi, is recommended as a fungicide for control of phytopathogenic organisms that cause damage to crop. For the determination of the exposure of employees working with pesticides there was developed the method of the measurement of concentrations of polyoxin B in air of working area, atmospheric air of populated areas and washouts from the operators' integuments, based on high performance liquid chromatography with ultraviolet detector (detection wavelength of270 nm), including sampling air environment in the sorption tube ORBOTM-44, filled with sorbent XAD-2, extraction of the sorbent with polyoxin by a mixture of carbinol-water (in a ratio of 95:5,on volume), washout from the surface of the skin with ethyl alcohol by way of washing, concentrating, quantitative chromatographic analysis. Lower limits of the quantification ofpolyoxin B in the air ofworking area -0.2 mg/m3 at the aspiration of 2 dm3 of air, atmospheric air - 0.016 mg/m3 at the aspiration of 25 dm3 of air, in washouts from the operators' integuments - 0.4 ¡g/wash, the linear range of the defined concentrations accounted for of 0.2 - 2.4 ¡g/cm3, the total error of measurement of the concentrations of polyoxin B in air is 17%; in washouts from the operators' integuments - 16%. The developed method was approbated for the determination of polyoxin in samples of air of working zone, atmospheric air within the sanitary gap, washouts from the operators' integuments and air drift samples taken under processing of roses in the hothouse and in the monitoring of the phytosanitary condition of the plants every other day after treatment.
Keywords: polyoxin B; air; washouts from the operators' integuments; analytical exposure control.
For citation: Volkova V.N., Mukhina L.P., Chistova Zh.A., Fedorova S.G. Determination of polioksin B in the air environment and in washouts from skin of operators by HPLC. Gigiena i Sanitaria (Hygiene and Sanitation, Russian Journal) 2016; 95(11): 1105-1107. (In Russ.). DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0016-9900-2016-95-11-1105-1107
For correspondence: Valentina N. Volkova, MD, PhD, senior researcher of the department of an analytical control methods of the F.F. Erisman Federal Research Center of Hygiene, Mytischi, 141014, Russian Federation. E-mail: [email protected]
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Acknowledgment. The study had no sponsorship. Received: 10 March 2016 Accepted: 04 October 2016
Для корреспонденции: Волкова Валентина Николаевна, канд. хим. наук, ст. науч. сотр. отд. аналитических методов контроля ФБУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора, 141014, Мытищи. E-mail: [email protected]
1гиена и санитария. 2016; 95(11)
DOI: http://dx.doi.org/10.1882/0016-9900-2016-95-11-1105-1107
Оригинальная статья
Введение
В настоящее время наряду с широким применением в медицине антибиотики используют и в сельскохозяйственной практике, например для борьбы с фитопатогенными организмами, наносящими ущерб растениеводству [1].
Полиоксины - нуклеозидные антибиотики, продуцируемые Streptomyces cacaoi. Комплекс полиоксинов состоит из смеси по крайней мере 14 соединений, отличающихся по структуре положением трех заместителей в углеродном скелете и обозначаемых буквами латинского алфавита от A до N [2].
Основными компонентами полиоксиновой группы являются полиоксин A и полиоксин B. Полиоксин A не обладает антигрибковой активностью даже при высоких концентрациях [3].
Полиоксин B - 5-(Е)-(2-амино-5-0-карбамоил-2-дезокси-L-ксилонамидо)-1,5-дидезокси-1-(1,2,3,4-тетрагидро-5-гидроксиметил-2,4-диоксопирими-дин-1-ил)-Р^-алло-фур-ануроновая кислота (наименование по ИЮПАК) - наиболее эффективный ингибитор синтеза хитина клеточной стенки многих фитопатогенных грибов, относящихся к Alternaría, Cochliobolus, Pircularia [1], рекомендуется в качестве фунгицида для профилактики, защиты и лечения от комплекса болезней на томатах, огурцах защищенного грунта и злаковых культурах. На рисунке представлена структурная формула полиоксина Б.
Н0оС
>f NH
к. Л,
1 IVjU N
CONH -С -Н
H2N -с-н И
н -С -ОН У А
но "С -н но он
polyoxin В: R =~СН2ОН
CH2OCONH2
Полиоксин B выделен в 1965 г., тогда же была определена его структура [4]. Препараты на основе полиоксина B широко используют в разных странах [1, 5].
Внедрение в сельское хозяйство новых средств защиты растений возможно лишь после их всестороннего токсиколого-гигие-нического изучения и гигиенической регламентации, что является основой для предотвращения неблагоприятного воздействия пестицидов на здоровье работающих и населения, а также санитарное состояние окружающей среды [6].
Важным этапом регистрационных испытаний препаратов является гигиеническое исследование условий труда путем установления экспозиционных уровней действующих веществ в пробах воздушной среды, смывов с кожных покровов в натурном эксперименте и последующей оценки риска неблагоприятного воздействия на работающих, проводимой в соответствии с методическими указаниями МУ 1.2.3017-121.
Методы контроля полиоксина в воздушной среде отсутствуют. В литературе представлены методы определения полиоксина высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) в воде и почве [7], в продуктах биосинтеза [9], в техническом продукте [8], микробиологический метод определения полиоксина Б в продуктах ферментации [3].
Цель работы заключалась в разработке метода измерения концентраций полиоксина в воздушной среде и смывах с кожных покровов операторов с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии и ультрафиолетового детектора для оценки экспозиции работающих с пестицидом в условиях сельскохозяйственного производства.
Материал и методы
Использованы аналитический стандартный образец полиоксина B (содержание основного компонента 97,6%), вода квалификации для ВЭЖХ фирмы Panreac (Испания), метанол фирмы J.T. Baker (США), спирт этиловый ректификованный производ-
1 Оценка риска воздействия пестицидов на работающих. Методиче-
ские указания.МУ 1.2.3017-12. М.: Федеральный центр гигиены и эпи-
демиологии Роспотребнадзора, 2012.
ства ЗАО «Эколаб». Для отбора проб воздуха применены сорб-ционные трубки ORBOTM-44, заполненные сорбентом XAD-2 (100/50 мг) фирмы SUPELCO (США), для проведения смывов использованы салфетки из белой хлопчатобумажной бязи, для фильтрования проб - мембраны микропористые капроновые - ММК (размер пор 0,45 мкм) производства НПФ БиоХром и стекловата фирмы Panreac (Испания).
Смыв с кожи осуществляли тканевой салфеткой с помощью пинцета, в качестве смывающей жидкости применяли 20 см3 этилового спирта, помещенного в емкость с герметичной крышкой. При определении полиоксина в пробе смыва вещество еще дважды экстрагировали с салфетки этанолом (по 10 см3).
Идентификацию и количественное определение полиокси-на B выполняли на жидкостном хроматографе «Agilent 1200» (США), снабженном диодно-матричным детектором, бинарным насосом, вакуумным дегазатором, термостатированным колоночным отделением и стандартным автосамплером. Оптимальный режим хроматографического разделения: хроматографическая колонка стальная (длина 150 мм, внутренний диаметр 4,6 мм), заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми ал-кильными группами для удерживания гидрофильных соединений (ZorbaxSB-AQC18), зернением 5 мкм; температура колонки 25 °С; изократическое элюирование - подвижная фаза: метанол-вода (15:85, по объему); скорость потока элюента 0,7 см3/мин; объем вводимой пробы 20 мм3. Детектирование проводили при рабочей длине волны 270 нм.
Основной раствор полиоксина с концентрацией 100 мкг/см3 и раствор для внесения в модельные образцы с концентрацией 10 мкг/см3 были приготовлены в метаноле и хранились в морозильной камере при температуре -18°C в течение месяца.
Рабочие растворы для калибровки с концентрациями полиоксина 0,2, 0,5, 1,0, 2,0 и 2,4 мкг/см3 готовили в подвижной фазе и хранили при температуре 4 ± 2°C не более 2 дней.
Статистический анализ включал определение средней величины и среднего квадратичного отклонения по результатам исследования модельных проб воздушной среды и смывов с внесением полиоксина Б с использованием стандартной программы Microsoft Excel в среде Windows 2010.
Результаты
Разработка метода измерения концентраций полиоксина в воздушной среде и смывах с кожных покровов операторов включала обоснование условий отбора проб воздушной среды, пробоподго-товку образцов воздуха и смывов с кожных покровов операторов и последующий ВЭЖХ-анализ.
С целью обоснования способа отбора проб проведена предварительная оценка агрегатного состояния полиоксина в воздушной среде с использованием расчетных методов [10], основанных на величине давления насыщенных паров вещества при конкретной температуре (менее 1,33 • 105 мПа при 25°C) и молекулярной массе (507,41). Расчетное значение естественной летучести полиок-сина составляет 1,45 • 104 мг/м3, что существенно превышает рекомендуемые гигиенические нормативы: ОБУВ в воздухе рабочей зоны 2,0 мг/м3, в атмосферном воздухе 0,02 мг/м3. На основании этого сделано заключение о значимости присутствия полиоксина в воздушной среде в виде аэрозоля и паров.
В качестве фильтрующего материала для концентрирования аэрозольной и парообразной фракций вещества были использованы сорбционные трубки, заполненные сорбентом XAD-2. Возможные потери в процессе аспирации воздуха с объемным расходом 2 дм3/мин оценены экспериментально после нанесения на фронтальную секцию сорбента сорбционной трубки 2,0 мкг полиоксина, проведения аспирации воздуха (20°C) со скоростью 2 дм3/мин в течение 12,5 мин (объем пробы воздуха 25 дм3). По завершении аспирации содержимое фронтальной и задней секции сорбента подвергали экстракции, упаривали и анализировали на содержание полиоксина. Вещество в экстракте задней секции не было идентифицировано, потери во фронтальной секции не отмечены, что указывает на отсутствие проскока и подтверждает эффективность выбранного способа отбора проб воздушной среды.
Важной задачей количественного анализа химических веществ является выбор оптимального способа перевода аналита в анализируемый раствор. В качестве экстрагента для извлечения полиоксина с экспонированных сорбционных трубок на основе структуры вещества, параметров растворимости в органических
растворителях и воде апробированы метанол, а также его смеси с водой. Установлено, что при применении смеси метиловый спирт-вода в объемном соотношении 95:5, использовании ультразвуковой ванны (2 мин) и механическом встряхивании (10 мин) полнота извлечения полиоксинас трубок составляла 88-99%.
Для выбора рабочей длины волны детектора выполнено сканирование спектра поглощения полиоксина в ультрафиолетовой области (220-320 нм), показавшее четкий максимум поглощения при 270 нм, который и был использован для детектирования соединения.
Подбор оптимальных условий хроматографирования полиоксина заключался в выборе хроматографической колонки и подвижной фазы. Использование стандартной колонки с обращенной фазой на основе привитого октадецилсилана (ZorbaxSB-C18, длина 25 см, внутренний диаметр 4,6 мм, зернение 5 мкм), рекомендованной авторами [11], при варьировании состава подвижной фазы метанол-вода (содержание метанола изменяли от 10 до 30%) и скорости потока элюента не привело к формированию пика полиоксина. Основываясь на данных литературы [7], наше внимание было обращено на новое поколение колонок для ВЭЖХ, содержащих сорбент с привитыми гидрофильными группами. Нами была апробирована колонка ZorbaxSB-AQC18 (150x4,6 мм) зернением 5 мкм, подвижная фаза метанол-вода 15:85, по объему со скоростью потока элюента 0,7 см3/мин, температура колонки 25°C. В указанных условиях хроматографирования полиоксин Б формирует четкий пик при времени удерживания 2,3-2,4 мин.
Калибровочный график зависимости площади хроматографи-ческого пика (S) в мЕА • с от концентрации (C) в мкг/см3 полиок-сина, построенный в диапазоне концентраций от 0,2 до 2,4 мкг/ см3, выражается линейным уравнением S = 31,00588 • C - 0,54404 (коэффициент корреляции 0,99996), соотношение сигнал-шум на пределе обнаружения 25:1, среднеквадратичное отклонение не превышает 4,5%.
Разработка метода измерения концентраций полиоксина в смывах с кожных покровов основана на методических рекомендациях №3056-84 от 26.07.842, а также Методических указаниях МУ 1.2.3017-121 и данных литературы [12].
Для оценки показателей точности и прецизионности определения вещества в аналитических пробах использовали метод добавок (внесено-найдено), позволяющий достичь более точное количественное определение и исключить влияние матричной основы на величину аналитического сигнала. Для приготовления модельных проб воздушной среды на сорбционные трубки наносили полиоксин по всему диапазону измерений (0,4-4 мкг), используя раствор полиоксина в метаноле с концентрацией 10 мкг/ см3 при варьировании наносимой аликвоты и аспирации воздуха. Установленный диапазон полноты экстракции полиоксина с трубок составляет 88-99%, средняя величина 91,8%. Среднее квадратичное отклонение повторяемости 2,3%.
В качестве биологической модели для создания экспонированного смыва использована подготовленная изолированная свиная кожа, близкая по анатомо-физиологическим свойствам коже человека, на фиксированные участки которой наносили дозированные количества определяемого вещества в виде раствора полиоксина в метаноле с концентрацией 10 мкг/см3 в количестве 0,4; 0,8; 2,0 и 4,0 мкг. Исходя из физико-химических свойств полиоксина, обоснована целесообразность использования спирта этилового ректификованного в качестве смывающей жидкости с поверхности кожных покровов.
Полнота смыва находится в диапазоне 83-103%, средняя величина полноты смыва 88,5%, среднее квадратичное отклонение повторяемости 6,2%.
Суммарная погрешность измерения, концентраций полиокси-на B, оцененная согласно [13], в воздушной среде составила 17%; в смывах с кожных покровов - 16%. Пределы повторяемости в воздушной среде и смывах с кожных покровов 12 и 13%, воспроизводимости 17 и 18% соответственно.
Обсуждение
Как упоминалось выше, целью работы являлась разработка метода измерения концентраций полиоксина B в воздушной среде и смывах с кожных покровов операторов с использованием ВЭЖХ, который обеспечивал бы контроль в воздухе рабочей
2 Разработка методов определения вредных веществ на коже. Мето-
дические рекомендации, утв..26.07.84, №3056-84.
Hygiene & Sanitation (Russian Journal). 2016; 95(11)
_DOI: http://dx.doi.org/10.1882/0016-9900-2016-95-11-1105-1107
Original article
зоны и атмосферном воздухе рекомендуемых гигиенических нормативов.
Разработанный метод измерения концентраций полиоксина B, обеспечивающий нижний предел количественного определения в воздухе рабочей зоны (0,2 мг/м3 при аспирации 2 дм3 воздуха, в атмосферном воздухе 0,016 мг/м3 при аспирации 25 дм3 воздуха, в смывах с кожных покровов 0,4 мкг/смыв), метрологически аттестован (свидетельство об аттестации № POC-CRU.0001.310430/0241.26.10.15) и утвержден в установленном порядке.
Созданный метод, апробирован в натурных исследованиях при определении экспозиционных уровней полиоксина в пробах воздуха рабочей зоны, атмосферного воздуха в пределах санитарного разрыва, смывов с кожных покровов работающих и воздушных сносов, отобранных при обработке роз в теплице с нормой расхода препарата 250 г/1000 л воды и при мониторинге фитоса-нитарного состояния растений через день после обработки.
Полученные данные, накопленные при проведении натурных исследований, использованы для оценки риска здоровью операторов в рамках регистрационных испытаний нового пестицида. Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Литер атур а (п.п. 2-4, 7-9, 11 см. References)
1. Егоров Н.С. Учение об антибиотиках. М.: Наука; 2004.
5. Митани С., Сугимото К., Такии Я. Фунгицидная композиция для сельского хозяйства и садоводства и способ предотвращения заболеваний растений. Патент РФ 2484630; 2009.
6. Ракитский В.Н., Ильницкая А.В., Юдина Т.В., Федорова С.Г., Березняк И.В., Липкина Л.И. Определение фактических экспозиционных уровней для оценки риска воздействия пестицидов на здоровье работающих. Гигиена и санитария. 2002; 81(6); 76-8.
10. Муравьева С.И, Буковский М.И., Прохорова Е.К. и др. Руководство по контролю вредных веществ в воздухе рабочей зоны: Справ. изд. -М.: Химия; 1991.
12. Попова А.Ю., Ракитский В.Н., Юдина Т.В., Федорова Н.Е., Березняк И.В., Чистова Ж.А. Гигиенический и аналитический контроль загрязнения кожных покровов работающих с пестицидами. Медицина труда и промышленная экология. 2015; (10): 8-13.
References
1. Egorov N.S. The doctrine of the antibiotics. [Uchenie ob antibiotikakh]. Moscow: Nauka; 2004. (in Russian)
2. Zhao C., Huang T., Chen W., Deng Z. Enhancement of the diversity of polyoxins by a thymine-7-hydroxylase homolog outside the polyoxin biosynthesis gene cluster. Appl. Environ. Microbiol. 2010; 76(21); 7343-7.
3. Sun L., Chen W., Deng Z., Zhong J.J. Microbiological assay for quantitative determination of polyoxin B. Process Biochem. 2009; 44(3): 361-4.
4. Isono K., Nagatsu J., Kawashima Y., Suzuki Y. Studies on polyoxin, antifungal antibiotics. Agric. Biol. Chem. 1965; 29(9): 848-54.
5. Mitani S., Sugimoto K., Takei J. Fungicidal composition for agriculture and horticulture and method of preventing plant diseases. Patent RF 2484630; 2009. (in Russian)
6. Rakitskiy V.N., Il'nitskaya A.V., Yudina T.V., Fedorova S.G., Bereznyak I.V., Lipkina L.I. Determination of actual exposure levels for assess the risk of the action pesticides on workers' health. Gigiena i sanitariya. 2002; 81(6); 76-8. (in Russian).
7. Tao N., Gong D.X., Yang Y.C., Wu Y.H., Yang L.H. A method on analysis of polyoxin in paddy soil and water. Journal of Instrumental Analysis (China). 2012; 31(6): 715-9.
8. Yu F., Song X., Jiang J., Liu W., Lei Z. Analysis of polyoxin B by HPLC. Agrochemicals (China). 2008; (3): 188-9.
9. Chen W., Huang T., He X., Meng Q., You D., Bai L. et al. Characterization of the polyoxin biosynthetic gene cluster from Strreptomyces ca-caoi engineered production of polyoxin H. J. Biol. Chem. 2009; 284(16); 10627-38.
10. Murav'eva S.I, Bukovskiy M.I., Prokhorova E.K. et al. Guidelines for the control of hazardous substances in workplace air: Ref. ed. [Rukovodstvo po kontrolyu vrednykh veshchestv v vozdukhe rabochey zony: Sprav. izd]. Moscow: Khimiya; 1991.
11. Li J., Li L., Feng C., Chen y., Tan H. Novel polyoxins generated by heter-ologously expressing polyoxin biosynthetic gene cluster in the sanN inactivated mutant of Streptomyces ansochromogenes. Microb. Cell. Fact. 2012; 11: 135.
12. Popova A.Yu., Rakitskiy V.N., Yudina T.V., Fedorova N.E., Bereznyak I.V., Chistova Zh.A. Hygiene and analytical control of the pollution of the skin working with pesticides. Meditsina truda i promyshlennaya ekologi-ya. 2015; (10): 8-13.
Поступила 10.03.16 Принята к печати 04.10.16
