CC BY
12УДК 543.2+577.150.87
Определение ионов металлов с использованием нативных и иммобилизованных ферментов
Т. Н. Шеховцова, С. В. Мугинова, И. А. Веселова
ТАТЬЯНА НИКОЛАЕВНА ШЕХОВЦОВА — доктор химических наук, профессор кафедры аналитической химии Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Область научных интересов: аналитическая химия, ферментативные методы анализа.
СВЕТЛАНА ВАЛЕНТИНОВНА МУГИНОВА — кандидат химических наук, доцент кафедры аналитической химии Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Область научных интересов: аналитическая химия, ферментативные методы анализа.
ИРИНА АНАТОЛЬЕВНА ВЕСЕЛОВА — кандидат химических наук, старший преподаватель кафедры аналитической химии Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Область научных интересов: аналитическая химия, ферментативные методы анализа.
119992 Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, тел. (095) 939-33-46, факс (095) 939-46-75, E-mail [email protected]
Металлы могут играть двоякую роль в физиологии человека, животных и растений. Некоторые из них необходимы для нормальной жизнедеятельности, в то время как другие при сравнительно низких концентрациях токсичны, причиняют вред организму. Недостаток или избыток макро- и микроэлементов приводит к серьезным нарушениям функционирования организма. Нередки случаи отравления людей и животных ионами металлов, входящими в состав продуктов питания или отходов промышленных технологий [1]. В связи с этим чрезвычайно важен контроль содержания ионов металлов в объектах окружающей среды, продуктах питания, биологических системах, лекарственных средствах.
В настоящее время аналитическая химия располагает значительным арсеналом инструментальных методов определения ионов металлов, включающим, прежде всего, методы спектроскопии: атомно-абсор-бционной (ААС), атомно-эмиссионной (АЭС), атом-но-эмиссионной спектроскопии с индуктивно связанной плазмой (ИСП АЭС), атомно-флуоресцентной (АФС); а также электрохимические, в частности, метод инверсионной вольтамперометрии (ИВА). Несколько обособленно от этих методов стоят ферментативные методы, развивающиеся на стыке аналитической химии и биохимии и являющиеся перспективной областью современного химического анализа. Эти методы благодаря высокой каталитической активности и специфичности действия биокатализаторов отличаются высокой чувствительностью и селективностью. Помимо этого выгодные преимущества ферментативных методов — экспрессность, простота используемого оборудования и методики эксперимента, относительная экономичность.
Наибольшее распространение для определения ионов металлов получили ферменты классов оксидо-редуктаз и гидролаз, катализирующие окислительно-восстановительные и гидролитические реакции соответственно. Биокатализаторы данных классов в большинстве своем являются металлозависимыми ферментами, т.е. содержат в активном центре ионы металлов
(кофакторы), которые играют важную роль в проявлении ими каталитической активности. В настоящем обзоре описаны методики (в том числе и тест-методики) определения ионов металлов с использованием нативных и иммобилизованных оксидоредуктаз и гидролаз различного происхождения, обсуждены разработанные авторами подходы к направленному повышению чувствительности и селективности определения ионов металлов, а также обсуждены возможности применения ферментативных методик для определения ионов-металлов в различных объектах.
Ферментативные методы определения ионов металлов по их ингибируницему действию на нативные ферменты
Большинство известных в настоящее время ферментативных методов определения ионов металлов основано на их ингибирующем действии на ферменты. Преимущественно это методы определения ионов тяжелых металлов, таких как А£(1), Н8(II). РЬ(П), Сё(П), В1(Ш), /п(П). Эти ионы давно известны как эффективные ингибиторы каталитической активности уреазы в реакции гидролиза мочевины [2]. Ингиби-рующий эффект на уреазу положен в основу ферментативных методик определения А£(1) и Н8( 11) в интервале концентраций 2—10 и 40—200 нг/мл, соответственно, [3], Сё(П) [4] и РЬ(П), а также Со(П), N¡(11), Си(П), Мп(П) в интервале их концентраций 0,1 — 2 мкг/мл [3]. Ингибирующее действие на Р-фрук-тофуранозидазу (инвертазу), катализирующую гидролиз сахарозы, используется при определении Нё(П) в интервале концентраций 0,01 — 100 нг/мл [5], а также 0,1 мкг/мл А£(1) [6].
В основу ферментативных методик определения А£(1) и Нй(П) положено их ингибирующее действие на каталитическую активность глюкозооксидазы [7] и ксантиноксидазы [8]: СН(А£) = 5 нг/мл и 0,5 мкг/мл; Сн(Н8) = 0,1 и 1 мкг/мл, соответственно (Сн — нижняя граница определяемых содержаний). Серебро(1) и ртуть(П) ингибируют каталитическую активность ал-когольдегидрогеназы (АДГ) из пекарских дрожжей в
интервалах концентраций 1—1000 нг/мл и 2— 20 мкг/мл, соответственно [9]. Более низкого предела обнаружения Нё(П) (0,08 мкг/мл) удалось добиться авторам методики [10], использовавшим экстракт АДГ, выделенный из печени лошади. На ингибирую-щем действии на щелочные фосфатазы, выделенные из кишечной палочки Е.соН и кишечника цыпленка, разработаны методики определения 3—10 нг/мл бериллия и 3—100 мкг/мл висмута [11], а также 0,075— 0,75 мкг/мл цинка [12], соответственно.
Использование нашивных пероксидаз для определения ионов металлов
На кафедре аналитической химии МГУ им. М.В.Ломоносова было установлено, что Н§(11), Сс1 (II). ВЦП!) в различных интервалах концентраций ингибируют каталитическую активность пероксидазы из корней хрена в реакциях окисления пероксидом водорода ароматических диаминов [13—17]. Ингиби-рующее действие кадмия на фермент в реакции окисления о-дианизидина (о-Д) положено в основу методики его определения в интервале концентраций 0,05—1 мкг/мл; а использование в качестве субстратов пероксидазы о-фенилендиамина (о-ФДА) и 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ) позволило снизить нижнюю границу определяемых содержаний (Сн) кадмия до 10 нг/мл [14].
Методика определения ЕН(Ш) с пределом обнаружения (Ст;п) 0,2 нг/мл была разработана с использованием органического серосодержащего ингибитора фермента — 1,3-дитиотреитола, дополнительное введение которого в индикаторную реакцию окисления о-Д усиливало ингибирующее действие висмута [16]. Кроме того, было показано, что другое серосодержащее органическое соединение — диэтилдитиокарба-минат натрия (ДЭДТК) является вторым субстратом пероксидазы в той же индикаторной реакции, и в его присутствии на кинетических кривых реакции появляется индукционный период. Величина индукционного периода сокращается при введении ВЦIII) в тем большей степени, чем выше его концентрация. Это объясняется взаимодействием иона металла с ДЭДТК, в результате чего изменяется способность последнего к окислению. Наличие обратно пропорциональной зависимости продолжительности индукционного периода от концентрации ВЦП!) позволило разработать
методику его определения с Сн = 0,05 мкг/мл [17].
Следует отметить, что во всех описываемых исследованиях и разработанных нами методиках каталитическую активность ферментов характеризовали скоростью индикаторных реакций, которую контролировали спек-трофотометрическим методом, фиксируя изменение во времени оптической плотности продуктов реакции.
Наиболее эффективный ингибитор пероксидазы — ртуть. Она ингибирует каталитическую активность этого фермента в реакциях окисления пероксидом водорода соединений: о-Д, о-ФДА, ТМБ. Введение в указанные индикаторные реакции тиомочевины, значительно усиливающей ингибирующее действие рту-ти(П), позволило разработать один из самых чувствительных и селективных методов определения ртути (табл. 1) [13]. Причины усиления ингибирующего действия ртути(П) на пероксидазу из корней хрена в присутствии тиомочевины обсуждены нами ранее в работах [15, 17, 19, 20]. Отметим лишь, что в основе этого эффекта лежит образование 811-групп (отсутствующих в структуре нативного фермента) в результате восстановления тиомочевиной Б—Б-связей в молекуле биокатализатора. Дальнейшее взаимодействие иона металла с БН-группами понижает каталитическую активность фермента.
В результате многочисленных исследований авторы данного обзора показали, что перспективным приемом направленного изменения метрологических характеристик ферментативных методов определения ингибиторов, ионов металлов в частности, является использование препаратов одних и тех же ферментов, выделенных из различных источников. Полученные экспериментальные данные по изучению эффекторов растительных пероксидаз и других ферментов, свидетельствуют о том, что степень, а иногда и характер воздействия одних и тех же эффекторов на ферменты различного происхождения отличаются. Это связано, очевидно, с различиями в структурах активных центров ферментов и их окружения, различной последовательностью аминокислотных остатков и их взаимного расположения и т. п.
При сравнении характера и степени действия рту-ти(П) на активность двух пероксидаз, выделенных из корней хрена и клеток арахиса, в одном и том же индикаторном процессе окисления пероксидом водорода о-дианизидина показано, что ртуть(П) начинает про-
Таблица 1
Метрологические характеристики и селективность методик определения ионов ртути с использованием нативных пероксидаз
Индикаторная Определяемое содержание * Sr ^ mm ■ Селективность* * Ссылка
реакция ртути, пг/мл (для С„) пг/мл
Пероксидаза из корней хрена (в присутствии тиомочевины)
о-Д-Н202 10-1000 0,03 8 103-кратные избытки Сс1(П), РЬ(П), ВЦШ) и 105-кратные избытки Ре(Ш) [18]
о-ФДА—Н202 2-5000 0,05 0,8 100-кратные избытки Сс1(П) и ВЦШ) [16]
ТМБ—Н202 0,6-5000 0.05 0,3 103-кратные избытки Сс1(П) и 105-кратные избытки ВЦП!) и РЬ(П) [16]
Пероксидаза из клеток арахиса( в отсутствие тиомочевины)
о-Д—Н202 200-2000 0,10 100 50- и 100-кратные избытки Pb(II) и Cd(II) [18]
Относительное стандартное отклонение.
* Характеризуется избыточными количествами М(П), которые мешают определению ртути(П) на уровне Сн
являть индивидуальное ингибирующее действие (в отсутствие тиомочевины) на пероксидазу арахиса при концентрациях в 250 раз меньших (25 нг/мл), чем на пероксидазу хрена. Кроме того, в реакции, катализируемой пероксидазой хрена, тиомочевина повышает чувствительность определения ртути(П) более чем на четыре порядка, а в индикаторной системе в присутствии пероксидазы арахиса тиомочевина практически не влияет на степень ингибирующего эффекта ртути. Очевидно, взаимодействие ртути(П) с пероксидазами арахиса и хрена осуществляется по разным механизмам, что, по-видимому, связано с некоторым различием в их строении. Методика, разработанная с использованием пероксидазы арахиса, позволяет определять ртуть на уровне ПДК (табл. 1), однако уступает по чувствительности и селективности методике определения ртути(П) с использованием пероксидазы хрена в присутствии тиомочевины. В то же время отсутствие необходимости введения в индикаторную реакцию, катализируемую пероксидазой арахиса, дополнительного ингибитора — тиомочевины и исключение в этом случае стадии инкубирования ртути(П) с ферментом позволяет упростить методику эксперимента и значительно (с 30 до 5 мин) сократить время проведения анализа.
Определение ионов металлов
с использованием нашивных алкогольдегидрогеназ
При изучении влияния ряда ионов металлов на каталитическую активность алкогольдегидрогеназ из пекарских дрожжей (АДГ I) и печени лошади (АДГ II) в реакции окисления этанола никотинамидаденинди-нуклеотидом (НАД+) установлено, что Н§(11), А£(1), Сс1 (II). Си(П) и 2п(11) в различных концентрациях оказывают ингибирующее действие на каталитическую активность обеих АДГ (табл. 2). Разработаны методики определения тех ионов металлов, для которых в указанных в табл. 2 интервалах концентраций наблюдается достаточно ярко выраженная обратно пропорциональная зависимость скорости индикаторного процесса от концентрации ингибитора [21].
Полученные данные свидетельствуют о том, что Нё(11) является наиболее эффективным ингибитором алкогольдегидрогеназ. Различная доступность реакци-онноспособных сульфгидрильных групп в молекулах АДГ из пекарских дрожжей и печени лошади, а также различная структура их активных форм (тетрамер и димер, соответственно) позволяют определять ртуть(П) с использованием АДГ из пекарских дрож-
жей на уровне значительно меньших концентрации, чем с применением АДГ из печени лошади. Справедливости ради следует отметить, что столь существенное различие в чувствительности двух препаратов АДГ к воздействию металлов-ингибиторов объясняется различием не только в их строении, но и в удельной активности коммерческих препаратов, использованных для исследования (25 и 0,5 ед/мг, соответственно).
Определение ионов металлов с использованием щелочных фосфатаз
Щелочные фосфатазы относятся к классу гидролаз и катализируют гидролиз различных эфиров фосфорной кислоты. Щелочные фосфатазы — металлозави-симые ферменты, содержащие в активном центре ионы цинка(П), необходимые для проявления ими каталитической активности.
Нами было изучено влияние ряда ионов металлов, и прежде всего, иона-кофактора — цинка(П) на каталитическую активность нативных щелочных фосфатаз, выделенных из трех различных источников: кишечной палочки E.coli (I), кишечника цыпленка (II) и тонкой кишки гренландского тюленя (III). В качестве индикаторной для контроля каталитической активности щелочных фосфатаз была использована реакция гидролиза я-нитрофенилфосфата (я-НФФ). Установлено, что цинк(П) в различной степени ингибирует каталитическую активность всех фосфатаз, выделенных из различных источников. Так, одинаковая степень его ингибирующего действия (25%) на препараты щелочной фосфатазы I, II и III наблюдается при концентрациях цинка(П) 5,0, 0,5 и 0,25 мкг/мл, соответственно. Наиболее значительное и заметно изменяющееся ингибирующее действие цинка(П) на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишки тюленя было положено в основу селективной ферментативной методики его определения в интервале концентраций 1-10 мкг/мл [22].
Помимо действия цинка(П) было изучено влияние на каталитическую активность трех ферментов ионов кобальта(П), никеля(П), меди(П) и кадмия(П), которые, благодаря их близким к цинку(П) ионным радиусам, способны потенциально замещать ионы цинка(П) в активном центре ферментов. Изучение характера влияния свинца(П) на каталитическую активность щелочных фосфатаз I и III представляло самостоятельный интерес, поскольку ранее [23] ингибирующее действие свинца(П) на нативную щелочную фосфатазу II в упомянутой выше индикаторной реакции было
Таблица 2
Характеристики методик определения ионов металлов М(Н), основанных на ингибировании алкогольдегидрогеназ
М(Н)
Концентрации М(Н), при которых проявляется ингибирование, мкг/мл
Определяемые концентрации М(Н), мкг/мл
Время инкубирования
АДГ I
АДГ II
АДГ I
АДГ II
АДГ I
АДГ II
Hg(II)
Ag(D
Cd(II)
Zn(II)
Pb(II)
Cu(II)
1(Г6-1 • 1(Г2 1(Г6-1 • Ю-3 1(Г6-1 • Ю-2 1(Г4-0,1 _ 10-3-1 -Ю-2 0,01-1,0
0,01-1,0 0,05-10 1-100 0,1-1,0 10-100 1-100
5 • 10~5—5 • Ю-3 8 • 10-5-5 • Ю-3
5 • 10~3—5 • Ю-2
0,1-1,0
0,05-1,0 0,1-1,0
0,05-1,0
0 5 0 5 15 0
Отсутствует выраженная зависимость скорости индикаторного процесса от концентрации ингибитора.
т
положено в основу высокочувствительного (Ст;п = = 0,1 нг/мл) ферментативного метода его определения.
Установлено, что Co(II), Ni(II), Cu(II) и Cd(II) при концентрациях на уровне 1 мкг/мл в реакционной смеси не влияют на скорость индикаторной реакции, катализируемой щелочными фосфатазами из всех трех источников. Pb(II) при этих же концентрациях не изменяет каталитическую активность фосфатаз I и III. Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что цинк(П) ингибирует щелочную фосфатазу из кишки тюленя не только при достаточно низких концентрациях, но и селективно [22].
Определение ионов металлов по их активирующему действию на ферменты
В роли активаторов ферментов преимущественно выступают ионы магния, кальция, бария, алюминия, а также некоторых переходных металлов, таких как Mn(II), Со(П), Cu(II), Ni(II), Fe(III). Ферментативные методы определения переходных металлов, как правило, не представляют большого интереса для химиков-аналитиков, поскольку разработаны высокочувствительные и более дешевые кинетические методы их определения, основанные на их каталитическом действии в различных окислительно-восстановительных реакциях [24—26].
Ионы магния и кальция являются наиболее эффективными активаторами оксидоредуктаз и гидролаз, поскольку они входят в состав многих металлофер-ментов этих классов: пероксидаз, карбоангидраз, щелочных фосфатаз, а-амилаз, фитаз, АТФ-аз и др. Так, ионы кальция в составе пероксидаз растительного
а
стабильность, а введенные извне — продлевают время жизни ферментных препаратов за счет понижения чувствительности биокатализаторов к действию ингибиторов [27]. Несмотря на большой интерес исследователей к изучению влияния ионов магния и кальция на различные ферменты, ферментативные методики определения этих металлов в литературе весьма немногочисленны. Анализ литературных данных за последние 40 лет показал, что разработаны единичные ферментативные методики определения указанных металлов. Так, например, авторами [28] разработана методика высокочувствительного определения магния в интервале концентраций 2,4—2400 мкг/мл, основанная на активировании люциферазы светляков, иммобилизованной на BrCN-активированной сефарозе. Люцифераза светляков катализирует биолюминесцентную реакцию превращения люциферина в окси-люциферин в присутствии аденозинтрифосфорной кислоты и магния. Определению Mg(II) на уровне Сн не мешают Ca(II), Sr(II) и Ва(П) при их 200- и 400-кратных избыточных количествах, соответственно.
Реактивирующее действие ионов кальция на щелочную фосфатазу из кишечника теленка, предварительно ингибированную ЭДТА, в реакции гидролиза я-НФФ положено в основу ферментативной методики их определения в довольно узком интервале концентраций 0,1—0,6 мкг/мл [29]. Селективность такой методики невысока, поскольку определению 0,1 мкг/мл Са(П) мешают соизмеримые количества Ba(II), Sr(II), Mn(II), Be(II), Co(II), Hg(II), Cu(II) и Pb(II), а также 10-кратные избыточные количества Mg(II).
Особо следует остановиться на влиянии ионов магния на щелочные фосфатазы I—III, в аллостериче-ские центры которых входят эти ионы [30]. Нами установлено, что магний в диапазоне его концентраций 0,6 нг/мл—20 мкг/мл в значительной степени активирует щелочную фосфатазу II, а при более высоких концентрациях (0,02—0,2 мг/мл) слабо активирует бактериальный фермент и не влияет на каталитическую активность фосфатазы III. Активирование щелочной фосфатазы II ионами магния может быть обусловлено присутствием в молекуле фермента так называемой «лиофильной» части, присоединяясь к которой ионы магния способствуют лучшему связыванию субстрата (я-НФФ), а степень активирующего эффекта зависит от содержания этой лиофильной части в молекуле фосфатазы [31]. Наиболее значительный активирующий эффект магния на щелочную фосфатазу II положен в основу высокочувствительной и селективной ферментативной методики его определения в диапазоне концентраций 0,6—6,0 нг/мл. Определению 0,6 нг/мл магния мешают только Са(П), Ва(П), Zn(II) и Cd(II) в их 105-, 105-, 103- и 102-кратных избыточных количествах, соответственно. Мешающее влияние указанных ионов связано, вероятно, с тем, что они частично замещают магний в аллостериче-ском центре фосфатазы, снижая тем самым каталитическую активность фермента.
Определение ионов металлов по реактивации апоферментов
Один из подходов, который позволяет значительно повысить селективность определения ионов металлов, выполняющих роль кофакторов ферментов, — использование явления реактивации апоферментов. При удалении металла-кофактора из активного центра метал-лозависимого фермента последний полностью или частично теряет каталитическую активность вследствие образования апофермента — белковой части молекулы биокатализатора. Добавление ионов металла-кофактора извне к апоферменту приводит к его реактивации — восстановлению каталитической активности фермента — и обеспечивает высокую селективность и чувствительность определения этих ионов металла. Для получения апоферментов ионы металла-кофактора связывают в устойчивое комплексное соединение различными лигандами, образующими с ним прочные комплексные соединения [32—37], и кроме того, используют диализ [29, 38, 39].
Известны методики определения: Cu(II) по реактивации апо-полифенолоксидазы [32, 33], Zn(II) — по реактивации апоформ пируватоксидазы [34], амино-пептидазы [35], карбоангидразы [36] и щелочной фосфатазы [29, 37].
Одним из примеров высокочувствительной и селективной методики определения металла-кофактора может служить разработанная нами методика определения ионов железа(Ш), входящих в состав гема пе-роксидазы хрена [40]. Для получения каталитически неактивного апофермента была использована салициловая кислота, образующая с Fe(III) чрезвычайно прочный комплекс (логарифм константы устойчивости комплекса lgß3 = 36,3). Реактивирующее действие железа(Ш) на фермент, предварительно ингибирован-ный указанным лигандом, в индикаторной реакции окисления пероксидом водорода о-дианизидина про-
является в интервале концентраций Ре(Ш) 2— 80 пг/мл, предел обнаружения Ре(Ш) составляет 10 пг/мл. Разработанная методика весьма селективна, определению столь малых концентраций железа не мешают ионы переходных металлов: Ре(П), Со(П), Си(П), N¡(11), даже при 105-кратных избытках, а Сг( 111) и Мп(П) незначительно понижают реактивирующее действие железа при 103-кратных избытках.
Помимо ионов железа в молекулу пероксидаз, в их агшостерический центр, входят ионы кальция, роль которых заключается в поддержании стабильности ферментов. Для удаления ионов кальция из пероксидазы арахиса нами был использован диализ в течение 24 ч в присутствии ЭДТА. Реактивирующее действие кальция на полученный апофермент в индикаторной реакции окисления пероксидом водорода о-диани-зидина проявляется при концентрации кальция 1 мкг/мл [41].
К наиболее часто встречающимся в оксидоре-дуктазах и гидролазах металлам-кофакторам относится цинк(П). Содержание цинка в молекулах этих ферментов определяется пространственным строением биокатализаторов и колеблется, например в случае щелочных фосфатаз, от 2 до 4 атомов на субъединицу фермента для димера или достигает 16 атомов для тетрамера [42]. При этом следует отметить, что в оксидоредуктазах (в частности АДГ) цинк, как правило, очень прочно связан с белковой частью молекулы фермента, что затрудняет его удаление из активного центра.
Нами была исследована возможность реактивации апо-алкогольдегидрогеназы из пекарских дрожжей, полученной с применением различных органических лигандов, в частности 1,10-фенантролина (но без диализа, т.е. без удаления избытка добавленного лиганда). Реактивацию проводили ионами цинка и другими ионами: Со(П), Сё(П), N¡(11), Си(П), образующими устойчивые комплексы с этими лигандами и имеющими близкие ионные радиусы с цинком(П) (табл. 3). Максимальное реактивирующее действие на апо-АДГ, полученную без диализа добавлением 1,10-фенантролина, оказывает N¡(11). Это объясняется, очевидно, тем, что Со(П) и N¡(11) в отличие от других приведенных в таблице ионов не ингибируют нативный фермент.
В случае апоферментов, полученных добавлением ЭДТА и 1,10-фенантролина, но без диализа, наблюдается частичная корреляция между степенью их реактивации ионами Си(П), 2п(П), Сё(П), константами устойчивости их комплексов с лигандами и степенями их ингибирующего действия на нативную АДГ. Инкубирование апоферментов с /п(П), Со(П) и Си(П) повышает их реактивирующую способность; при этом /п(П) в большей степени реактивирует апо-АДГ, чем Со(П) и Си(П).
Полученные данные свидетельствуют о том, что селективно реактивировать ионами цинка апо-АДГ из пекарских дрожжей, полученную добавлением органических лигандов (например, 1,10-фенантролина или ЭДТА) без удаления их избытка диализом невозможно. Вследствие этого для разработки селективной и чувствительной методики определения иона металла-кофактора АДГ, а именно цинка, было необходимо получить чистый апофермент, удалив избыток органического лиганда. Полное подавление каталитической
Таблица 3
Характеристики реактивации апо-алкогольдегидрогеназы (апо-АДГ) ионами металлов М(Н)
Апо-АДГ получена с применением 1,10-фенантролина; lgP3 — логарифм константы устойчивости комплексных соединений М(П) с 1,10-фенантролином; Дпах — степень максимального реактивирующего действия, %; Смщ) — концентрация М(П), при которой достигается указанная степень активирования; тинк — время инкубирования апо-АДГ с М(П)
М(Н) Ионный радиус [43], A № Civi(ii), мкг/мл 0 мин при тиик 15 мин
Zn(II) 0,83 17,00 0,1 82 218
Cd(II) 1,03 14,26 0,1 81 81
Ni(II) 0,78 17,57 1 119 83
Co(II) 0,82 20,00 1 100 150
Cu(II) 0,80 20,41 0,01 86 110
активности АДГ 1,10-фенантролином и ЭДТА (степень ингибирования / = 100%) при проведении диализа в статических условиях в течение 48 ч достигается при их 5 • 103- и 105-кратных избыточных количествах по отношению к ферменту, соответственно. Проведение диализа в динамических условиях позволило получить апо-АДГ при 100-кратных количествах 1,10-фенантролина и ЭДТА, причем время диализа сократилось до 24 ч. Изучение влияния на полученные апоферменты /п(П), Со(П), N¡(11), Си(П) и Сс1(П) показало, что только /п(П) селективно реактивирует оба препарата апофермента АДГ. При использовании 1,10-фенантролина максимальная степень реактивации полученного апофермента выше, а необходимая для ее достижения концентрация ионов цинка ниже, чем при применении ЭДТА. Поэтому для разработки методики определения /п(П) использовали апо-АДГ, полученную в присутствии 1,10-фе-нантролина. Разработанная методика применима для определения цинка в диапазоне концентраций 0,05— 0,5 нг/мл, Ст;п = 20 пг/мл. Установлено, что Со(П) и N¡(11) не мешают определению цинка при их 105-, Си(П) — при 103-, а Сё(П) — при 600-кратных количествах. При совместном присутствии N¡(11), Сс1(П) и Си(П) мешают определению /п(П) при их 400-кратных избыточных количествах.
Щелочные фосфатазы также содержат ионы цинка в качестве кофакторов. Нами выяснено, что для получения апоформ щелочных фосфатаз, выделенных из Е.соИ, кишечника цыпленка и тонкой кишки гренландского тюленя, из ряда исследованных органических лигандов наиболее перспективен ЭДТА При этом ЭДТА ингиби-рует фосфатазу из тонкой кишки гренландского тюленя в наибольшей степени (/ = 95%) при наименьшем избыточном количестве (Е : Ь = 1:100) и при минимальном (15 мин) времени инкубирования с ферментом [44]. Так как величина остаточной невысокой (5%) активности фосфатаз практически не зависит от времени выдерживания фермента с ЭДТА, проведение длительного диализа для получения апо-фосфатазы представлялось нецелесообразным.
Изучение влияния на полученную апо-фосфатазу ионов цинка и других ионов, имеющих близкие к цинку(П) ионные радиусы и константы устойчивости
комплексных соединений с ЭДТА, показало, что реактивацию апо-фосфатазы из кишки тюленя (хотя и небольшую — 25%) вызывает только цинк(П) [44]. Для повышения степени реактивирующего действия цинка на апофермент в индикаторную реакцию гидролиза я-нитрофен ил фосфата вводили дополнительно магний(П), необходимый для стабилизации фермента. Оказалось, что присутствие 2 мкг/мл магния(П) усиливает реактивирующий эффект цинка, степень реактивации апофермента повышается до 84% [44]. Разработанная ферментативная методика позволяет определять цинк в интервале его концентраций 0,01 — 0,1 мкг/мл, Ст;п = 8 нг/мл.
В результате изучения влияния ионов магния, кальция и бария на каталитическую активность различных щелочных фосфатаз в реакции гидролиза я-НФФ в присутствии ряда комплексонов предложен новый подход к ферментативному определению указанных металлов, основанный на использовании их либеративного действия на щелочную фосфатазу из кишки тюленя, предварительно ингибированную нит-рилтриметиленфосфоновой кислотой. Либеративное действие ионов металлов заключается в том, что при добавлении в индикаторную систему они уменьшают ингибирующее действие хелатирующего агента за счет связывания его в комплекс и восстанавливают тем самым каталитическую активность фермента. Разработаны чувствительные ферментативные методики определения ионов магния, кальция и бария (Сн — 14, 24 нг/мл и 0,8 мкг/мл, соответственно). Указанная ферментативная методика определения магния(П) превосходит по чувствительности методики его определения методами ААС и АЭС, а также флуориметрическую методику, основанную на образовании комплекса магния(П) с 8-гидроксихинолин-5-сульфо-кислотой (Ст|п = 12 нг/мл) [45].
Использование иммобилизованных ферментов для определения ионов металлов
Ферментативные методы занимают все более прочные позиции в химическом анализе, однако их более широкое распространение ограничено в некоторой степени малой доступностью либо высокой стоимостью очищенных препаратов ферментов, их низкой устойчивостью при хранении и при различных, особенно тепловых, воздействиях, невозможностью многократного использования биокатализатора из-за сложности его отделения от реагентов и продуктов реакций. Эти недостатки можно преодолеть, используя иммобилизованные ферменты, т. е. ферменты, искусственно связанные с не растворимым в воде носителем или модифицированные растворимыми в воде полимерами и сохранившие (полностью или частично) каталитическую активность. Иммобилизация повышает стабильность фермента при длительном хранении, его устойчивость к внешним воздействиям, что облегчает хранение и транспортировку ферментов в экспедиционных условиях, позволяет обеспечить многократность использования биокатализаторов.
В аналитических целях на основе иммобилизованных ферментов создают ферментные электроды, сенсоры, проточные автоматические анализаторы с различными методами регистрации аналитического сигнала (электрохимическими, спектрофотометрическим, люминесцентным) [46]. Так, например, амперометри-
ческие ферментные электроды для определения ионов РЬ(П) (0,1-200 мкг/мл) [47], Т1(1) (10-200 мкг/мл), ВКШ) (22-525 мкг/мл), Сё(П) (0,1-100 мкг/мл), Си(П) (3 пг/мл—64 мкг/мл) [48] разработаны на основе холинэстеразы, иммобилизованной включением в пленки из нитрата целлюлозы. На использовании иммобилизованной уреазы основан потен циометриче-ский электрод для определения 0,08—1,0 мкМ рту-ти(П) [49]. В [50] описан потенциометрический биосенсор для суммарного определения ртути в соединениях: Нё(Ы03)2, НёСЬ. Нё2(Ы03)2 (0,05-1,0 мкМ), РкНаСЛ (0,1—5,0 мкМ), по их ингибирующему действию на уреазу, иммобилизованную на поверхности рН-чувствительного электрода на основе оксида иридия. Для определения 5 мкМ—10 мМ ионов ртути и серебра предложен [51] потенциометрический бифер-ментный электрод на основе иммобилизованных глю-козооксидазы и каталазы. Для определения Си(П), Со(П), Сё(П), N¡(11), Ъп{\\), РЬ(П), 8г(П), 8п(П) в интервале их концентраций 0,05—10 мМ разработан проточно-инжекционный потенциометрический муль-тиферментный биосенсор, основанный на применении четырех различных ферментов — уреазы, глюко-зооксидазы, ацетил- и бутирилхолинэстеразы [52]. Пары фермент—субстрат (уреаза—мочевина, глюкозо-оксидаза—глюкоза, ацетилхолинэстераза—ацетилхоли-ниодид, бутирилхолинэстераза—бутирилхолиниодид) были иммобилизованы в отдельных ячейках силиконового планшета. Определение ионов металлов с использованием всех перечисленных электродов основано на их ингибирующем действии на иммобилизованные ферменты. Известны ферментные электроды, созданные для определения ионов металлов по их реактивирующему действию на иммобилизованные апо-ферменты. Так, для определения 1 мкМ цинка в [53] предложен амперометрический электрод на основе иммобилизованной апофосфатазы. А потенциометрический электрод на основе иммобилизованной поли-фенолоксидазы создан для определения 0,1—2 мкМ ее кофактора — ионов меди [54].
Использование ферментных реакторов позволило значительно расширить число способов регистрации аналитического сигнала: помимо электрохимических в этих целях применяют спектрофотометрические, люминесцентные, термометрические детекторы. Например, термометрический детектор использован в работе [55] для определения < 0,1 М ингибиторов иммобилизованной уреазы — ионов серебра, меди и ртути. Разработан [56] спектрофотометрический метод определения ряда ионов тяжелых металлов: А£(1) (20 нг/мл), Нё(П) (70 нг/мл) и Си(П) (250 нг/мл), по их ингибирующему действию на уреазу, иммобилизованную на аммоний-селективной силиконовой мембране, закрепленной на стенке кюветы. Автоматический флуоресцентный уреазный биосенсор для определения ионов Си(П) и 2п(11) в интервале их концентраций 10— 230 мкМ описан в работе [57]. Апофермент иммобилизованной пируватоксидазы использован для хеми-люминесцентного определения 10 пг кофактора — ионов цинка [34].
Весьма перспективна для успешного внедрения в аналитическую практику разработка на основе иммобилизованных ферментов простых и экспрессных тест-методик и тест-устройств, не требующих специального оборудования для фиксирования аналитиче-
ского сигнала и пригодных для использования во вне-лабораторных условиях. Для разработки тест-методик с визуальным контролем протекания ферментативных процессов подбирают такие носители, которые должны отвечать не только обычным при иммобилизации требованиям, но также быть бесцветными, обладать удобной для создания тест-устройств формой (в виде полосок, пластинок, таблеток), чтобы возможно было фиксировать изменение окраски от исходных компонентов до промежуточных либо конечных продуктов проводимой на них индикаторной реакции.
Создание высокочувствительных и селективных ферментативных тест-методик в последние годы является одним из направлений активных исследований, проводимых на кафедре аналитической химии МГУ им. М.В. Ломоносова. В основу таких тест-методик с применением биокатализаторов, иммобилизованных на различных носителях, положены выявленные нами эффекты (ингибирующий, активирующий, реактивирующий) ионов металлов на различные нативные ферменты. Для получения иммобилизованных препаратов пероксидазы хрена, алкогольдегидрогеназы из пекарских дрожжей, щелочных фосфатаз из кишечника цыпленка и кишки тюленя и разработки на их основе тест-методик определения ионов ртути, кадмия, свинца, цинка использованы носители разных типов: полистирольный планшет (ПСП), силикагели, хрома-тографическая бумага (хром, бумага), микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ) и пенополиуретаны (ППУ). Для иммобилизации ферментов был выбран метод включения их в пространственную сетку гелей природных полисахаридов (хитозана и Ы-фталил-хитозана) с последующей сорбцией на указанных выше носителях. Данный метод иммобилизации
ферментов обычно в меньшей степени нарушает их структуру, а свойства иммобилизованных таким образом препаратов мало отличаются от свойств натив-ных ферментов в растворе. Активность иммобилизованных препаратов ферментов контролировали визуально, фиксируя время появления на носителях определенной окраски продуктов окисления или гидролиза тех же субстратов — о-Д, о-ФДА, ТМБ, НАД, я-НФФ, которые использовали в случае нативных ферментов.
На основе ингибирующего действия ртути(П), усиленного тиомочевиной, на каталитическую активность пероксидазы, иммобилизованной на силикагеле, МКЦ и ППУ, в реакциях пероксидазного окисления различных субстратов были разработаны высокочувствительные тест-методики определения Hg(II) с аналитическими характеристиками, представленными в табл. 4.
Все разработанные тест-методики определения ртути достаточно селективны. Так, при изучении мешающего влияния ряда ионов металлов и анионов: Cd(II), Bi(III), Pb(II), Cu(II), Zn(II), Fe(II, III), Ni(II), Co(II), Ca(II), Mg(II), СГ, Br-, Г, F^, S2", PO43-, SO42-, CO;2 . на определение ртути(П) с использованием иммобилизованной на ППУ пероксидазы показано, что только Cd(II), Bi(III) и Fe(III) мешают определению 1 пг/мл Hg(II) в их 105-, 105- и 106-кратных количествах, соответственно. При этом кадмий(П) и висмут(Ш) так же, как и ртуть(П) ингибируют иммобилизованный фермент, а железо(Ш) при концентрациях > 1 мкг/мл активирует его. Для маскирования железа(Ш) при определении ртути(П) в тех объектах, в которых оно присутствует в количествах > 1 мкг/мл, следует использовать винную кислоту.
Нами выяснено, что кадмий(П) и свинец(П) инги-
Таблица 4
Аналитические характеристики тест-методик определения ионов металлов по их действию на ферменты,
иммобилизованные на различных носителях
Действие: ингибирующее (Инг.), активирующее (Акт.) и реактивирующее (Реакт.). Расшифровку других обозначений см. в тексте
Носитель Me(II) Действие Индикаторная Фиксируемый переход Ссылки
фермента на фермент реакция окраски нг/мл
П е роксидаза из корней хрена
ПСП Hg(II) Инг. о-Д-Н202 Зеленый ^ красный 0,01 [58, 59]
ПСП ТМБ-Н2О2 Голубой ^ вишневый 0,001 [58, 59]
Хром, бумага о-ФДА-Н20 Коричневый ^ зеленый 0,04 [59-61]
Хром, бумага тмб-Н2О2 Голубой ^ коричневый 0,01 [59-61]
Силикагель тмб-н2о2 Голубой ^ желтый 0,01 [62]
МКЦ тмб-н2о2 Голубой ^ желтый 0,005 [62]
ППУ о-Д—Н202 Зеленый ^ красный 0,001 [63]
ППУ Cd(II) Инг. о-Д—Н202 Зеленый ^ красный 0,1 [64]
ППУ Pb(II) Инг. о-Д—Н202 Зеленый ^ красный 0,5 [65]
Ал к о гольдег идро геназ а из пекарских дрожжей
Силикагель Zn(II) Реакт. Этанол—НАД+ Бесцветный ^ бурый 0,1 [66]
и-ФДА-Н202
Щелочная фосфатаза из кишечника цыпленка
ППУ Pb(II) Инг. Гидролиз и-НФФ Бесцветный ^ зеленый 0,05 [65]
Хром, бумага Mg(II) Акт. Гидролиз и-НФФ Бледно-желтый ^ синий 1000 *
Щелочная фосфатаза из кишки тюленя
ППУ Zn(II) Инг. Гидролиз и-НФФ Бесцветный ^ зеленый 0,1 [22]
* Данные не опубликованы
бируют пероксидазу, иммобилизованную на ППУ, (после 15 мин их совместного инкубирования) в большей степени, чем нативный ферментный препарат. Аналитические характеристики тест-методик определения этих ионов приведены в табл. 4.
Свинец(П) является также эффективным ингибитором щелочной фосфатазы из кишечника цыпленка, иммобилизованной на силикагеле, МКЦ и ППУ, в интервалах его концентраций 1—100, 0,5—100 и 0,05— 100 нг/мл, соответственно. Следует отметить, что продукт индикаторной реакции щелочного гидролиза я-НФФ, катализируемой щелочной фосфатазой, — я-нитрофенолят натрия имеет довольно бледную желтую окраску. Для усиления интенсивности его окраски на поверхность носителя вводили смесь молибдата аммония с красителем малахитовым зеленым. Молиб-дат аммония необходим для связывания фосфат-иона, образующегося в результате гидролиза я-НФФ, в гете-рополикислоту Н3РО4 • 12М0О3. Последняя, взаимодействуя с малахитовым зеленым, образует ионный ассоциат зеленого цвета, поглощающий при 630 нм. Вследствие этого на изученных бесцветных носителях наблюдали появление яркой зеленой окраски, что было удобно для визуального контроля скорости ферментативного процесса (табл. 4).
Щелочные фосфатазы различного происхождения, иммобилизованные на ППУ, были использованы нами и для определения цинка [22]. Выяснено, что цинк(П) практически не влияет на каталитическую активность иммобилизованной щелочной фосфатазы из кишечника цыпленка и ингибирует фосфатазы из Е.соН и кишки тюленя в интервалах его концентраций 2,5—50 мкг/мл и 0,1 нг/мл—50 мкг/мл, соответственно. Полученные данные свидетельствуют о том, что цинк(П) ингибирует иммобилизованную щелочную фосфатазу из кишки тюленя при концентрациях в 500 раз меньших и в более широком их интервале, чем в случае нативного препарата этой фосфатазы. По-видимому, столь значительное различие в степени ингибирующего действия цинка(П) на нативную и иммобилизованную фосфатазу из кишки тюленя связано с тем, что благодаря высокой сорбционной емкости носителя, достигается эффект микроконцентрирования цинка(П) на ППУ. Таким образом, так же, как и в случае нативных ферментов, для разработки тест-методики определения цинка в интервале концентраций 0,1 нг/мл—10 мкг/мл можно использовать только фосфатазу из кишки тюленя (табл. 4). Определению цинка(П) по данной методике мешает лишь маг-ний(П) при 5 • 105-кратных количествах.
Для тест-определения цинка нами использовано и явление реактивации им апо-алкогольдегидрогеназы из пекарских дрожжей, полученной диализом в присутствии 1,10-фенантролина и иммобилизованной на силикагеле. Для визуальной регистрации окрашенных продуктов индикаторной реакции применили следующую сопряженную систему реакций:
кн2
ш2
С2Н5ОН + НАД
АДГ
СН3СНО + НАДН
+ Н2О2
ын2
+ Н2О
ын2
я-ДФА
ыы
■2 ын2
Основание Бандровского
Аналитические характеристики разработанной тест-методики определения цинка приведены в табл. 4.
Начаты исследования по разработке тест-методик определения магния на основе его активирующего действия на каталитическую активность щелочной фосфатазы из кишечника цыпленка. Для визуальной регистрации аналитического сигнала (времени появления интенсивной синей окраски в пятне на поверхности носителя) использована сопряженная система из двух последовательно протекающих реакций: ферментативного гидролиза я-НФФ и некаталитической реакции образования продуктом первой реакции — фосфат-ионом желтого фосформолибденового комплекса с последующим его восстановлением аскорбиновой кислотой. В качестве оптимального носителя выбрана хрома-тографическая бумага. Разработанная методика позволяет определять магний на уровне 1 мкг/мл.
О значительных достоинствах разработанных ферментативных тест-методик свидетельствует тот факт, что методика определения ртути(П) на основе ее ингибирующего действия на иммобилизованную пероксидазу в реакции окисления ТМБ превосходит по чувствительности все известные ферментативные и неферментативные методики определения данного токсиканта: методами ААС с холодным паром (ААС-ХП), АФС, АЭС, ИСП АЭС, ИВА, флуориметрии и др. [65, 66]. Тест-методика определения цинка(П) сопоставима по чувствительности с электрохимическими, флуориметрическими и атомно-абсорбционными методиками [67]. Кроме того, ферментативные методики характеризуются высокой селективностью, чрезвычайной простотой и быстротой (продолжительность анализа не превышает 15 мин) и могут быть использованы для анализа различных объектов во внелаборатор-ных условиях.
Ферментативные методы определения ионов металлов в анализе объектов
Методики, разработанные нами с использованием нативных и иммобилизованных ферментов, были применены для анализа конкретных объектов: вод и вытяжек из почв различного происхождения, биологических жидкостей (мочи и сыворотки крови), пищевых продуктов. Примеры определения различных ионов металлов в конкретных объектах приведены в табл. 5, 6.
Данные, полученные с помощью ферментативных методик (см. табл. 5), хорошо согласуются с результатами определения ионов металлов в тех же образцах методами масс-спектрометрии (МС), ААС, ААС с холодным паром (ААС-ХП), сорбционной ААС (СААС), АФС, спектрофотометрии (СФ) и ИВА. Этот факт
Таблица 5
Результаты определения ионов металлов ферментативным методом (I) и альтернативными методами (II) в различных объектах
Расшифровку сокращений названий методов II см. в тексте
Объект анализа Определяемый ион, используемый Содержание иона металла Ссылка
фермент I II
Вода п г/ м л
Азовское море Н8(П), ± 480 (ААС-ХП) [13]
Каспийское море нативная пероксидаза ± 850 (ААС-ХП) [13]
Средиземное море ± 680 (ААС-ХП) [13]
р. Москва ± ± [17]
р. Москва Н8(П), ± 190 (MC) [17]
р. Обь иммобилизованная пероксидаза ± 390 (ААС-ХП) [18]
р. Исеть, г. Екатеринбург ± ± [68]
Подземная вода, ± ± [69]
Московской обл.
Водопроводная вода, ± ± [69]
г. Москва (Метод добавок)
Почва м г/ к г
Подзолистая Н8(П), ± 3,5 (ААС-ХП) [18]
Глинистая иммобилизованная пероксидаза ± 2,0 (ААС-ХП) [18]
Чернозем Сс1(П), ± 3,5 (СААС) [18]
иммобилизованная пероксидаза
Чернозем РЬ(П), ± ± [18]
Краснозем иммобилизованная щелочная ± ± [18]
Дерново-подзолистая фосфатаза ± ± [18]
Пойма р. Волга ± ± [18]
Биологические жидкости н г/ мл
Моча Hg(H), ± ± [69]
нативная пероксидаза (Метод добавок)
Mg(II), ± 33,76 (СФ) [69]
нативная щелочная фосфатаза
Сыворотка крови Hg(H), ± ± [69]
иммобилизованная пероксидаза (Метод добавок)
Zn(II), ± ± *
нативная АДГ
Zn(II), ± ± [22]
нативная щелочная фосфатаза
' Данные не были опубликованы
Таблица 6
Результаты определения ионов металлов в пищевых продуктах с использованием иммобилизованных
на пенополиуретане ферментов.
Ферменты: пероксидазы из корней хрена (А), щелочные фосфатазы из кишечника цыпленка (Б) и тонкой кишки тюленя (В)
Объект
Содержание М (II), мг/кг
Hg(II) (А)
Cd(II) (А)
Fb(II) (Б)
Zn(II) (В)
Горох Виноград Говядина Свинина
2,2 ± 0,2
2,4± 0,4 ±
±
± ±
±
< 0,001
± ±
±
±
± ± ± ±
свидетельствует о том, что ферментативными методами можно определять общее содержание ионов металлов в анализируемых образцах независимо от того, в каких ионных состояниях и в виде каких соединений с неорганическими и органическими лигандами находятся в них металлы.
Использование различных эффектов — ингиби-рующего, активирующего, реактивирующего действия ионов металлов на каталитическую активность нативных и иммобилизованных ферментов и апоферментов, позволяет разрабатывать высокочувствительные селективные, достаточно простые и экспрессные методы
определения. Эффективность определения ионов металлов ферментативными методами подтверждена анализом многочисленных природных, биологических, пищевых объектов на содержание ртути(П), кадмия (II), свинца(П), цинка(П), магния(П).
В исследованиях, проведенных на кафедре аналитической химии МГУ, активное участие принимали А.М. Жаворонкова, Е.В. Жмаева, П.В. Бычков.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты № 01-03-32187, № 04-03-33116).
ЛИТЕРАТУРА
1. Зигель X, Зигель А. Некоторые вопросы токсичности металлов. М.: Мир, 1990, 366 с.
2. Krajewska В., Leszko A., Zaborska W. J. Chem. Technol. Bio-technol, 1990, v. 48, p. 337-350.
3. Weisz //., Rothmaier К Anal. chim. acta, 1975, v. 80, № 2, p. 357-359.
4. Toren E.C., Burger Т.J. Mikrochim. acta, 1968, № 5, p. 1949.
5. Maslovskaya J., Leszczynn'ska T. Talanta, 1985, v. 32, № 9, p. 883-886.
6. MealorD., Towns/tend A. Ibid., 1968, v. 15, № 12, p. 1371.
7. Toren E.C., Burger P.J. Mikrochim. acta, 1968, № 3, p. 538.
8. Guilbault G.G., Kramer D.N., Carron P.L. Anal. Chem., 1964, v. 36, № 3, p. 606-610.
9. Townshend A., Vaughan A. Talanta, 1970, v. 17, № 4, p. 299. 10. Vanni A., Des Tradis C. Ann. Chim., 1985, v. 75, № 1-2, p. 65. W.Thiel Т., Liszkowski L., Bissen S.T. J. Biochem. Bio-
phys.Methods, 1998, v. 37, p. 117-121.
12. Thownshend A., Vaughan A. Talanta, 1969, v. 16, № 7, p. 929.
13.Долманова И.Ф., Ершова E.B., Шеховцова Т.Н., Надь В.Ю. Ж. аналит. химии, 1979, т. 34, № 8, с. 1644—1647.
14.Долманова И.Ф., Шеховцова Т.Н., Спгародумова H.H. Там же, 1987, т. 42, № 10, с. 1824-1828.
15. Шеховцова Т.Н., Мугинова С.В., Веселова И.А., Долманова И.Ф. Там же, 2002, т. 57, № 12, с. 1308-1316.
16.Долманова И.Ф., Попова И.М., Угарова H.H., Шеховцова Т.Н. Там же, 1981, т. 36, № 7, с. 1347-1350.
П. Shekhovtsova T.N., Muginova S.V., Mizgunova U.M., Dolmano-va I.F. Quirn. Analit., 1996, v. 15, № 4, p. 312-320.
18. Shekhovtsova T.N., Bagirova N.A., Veselova I.A., Muginova S.V. Advanced Research Workshop on Monitoring of Natural and Man-Made Radionuclides and Heavy Metal Waste in Environmental. Dubna, 3—6 Oct., 2000, p. 62.
19. Угарова H.H., Попова И.М., Долманова И.Ф., Шеховцова Т.Н. Биохимия, 1981, т. 46, № 6, с. 1026-1034.
20. Шеховцова Т.Н., Чернецкая С.В., Долманова И.Ф. Ж. аналит. химии, 1995, т. 50, № 3, с. 309-311.
21. Bychkov P. V., Zhavoronkova A.M., Zhmaeva E. V., Muginova S.V., Shekhovtsova T.N. Proc. of Biocatalysis-2002: Fundamentals and Applications. Moscow, 2002, p. 77.
22. Жаворонкова A.M., Мугинова С.В., Веселова И.А., Шеховцова Т.Н. Ж. аналит. химии, 2003, т. 58, № 1, с. 88-96.
23. Dolmanova I.E., Shekhovtsova T.N., Kutcheryaeva VV Talanta, 1987, v. 34, № 1, p. 201-205.
24. Перес-Бендитпго Д., Сильва М. Кинетические методы в аналитической химии. М: Мир, 1991, с. 147—156.
25. Мюллер Г., Отто М., Вернер Г. Каталитические методы в анализе следов элементов, 1983, 170 с.
26. Муштакова С.П., Гуменюк А.П., Хмелев С.С. Ж. аналит. химии, 1991, т. 46, № 3, с. 561-564.
27. Яцимирский К.Б. Введение в неорганическую биохимию. Киев: Наукова думка, 1976, с. 96.
28. Иванова Л.В., Бровко Л.Ю., Шеховцова Т.Н. и др. Прикл. биохимия и микробиология, 1982, т. 18, № 5, с. 721—724.
29. Townshend A., Vaughan A. Talanta, 1970, v. 17, № 4, p. 289.
30. Gettings P., Coleman J.E. J. Biol. Chem., 1984, v. 259, № 8, p. 4991-4994.
31. Cloetens R. Biochem. Z., 1941, Bd. 308, S. 37-41.
32. Stone J. V, Townshend A. J.C S. Chem. Comm., 1972, № 9, p. 502.
33. Stone J.V, Townshend A. I.C.S. Dalton Trans., 1973, № 5, p. 495.
34. Ригин В.И Ж. аналит. химии, 1979, т. 34, № 4, с. 680-687.
35. Lenky P., Stein Е.А. Anal. chim. acta, 1974, v. 70, № 1, p. 85-93.
36. Kashiwabara K, Hobo Т., Kobayashi E., Suzuki S. Ibid., 1985, v. 178, № 2, p. 209-215.
37. lasaitis /./., Rasumas V.I., Kulis I.I. Ibid., 1983, v. 152, № 1, p. 271.
38. Sanjai D., Rajiv D. Mater. Sci., 1995, v.3, № 2, p. 79-83.
39. Sanjai D., Rajiv D. Anal. Chem., 1996, v. 68, p. 216-220.
40. Шеховцова Т.Н., Чернецкая С.В., Долманова И.Ф. Ж. аналит. химии, 1993, т. 48, № 1, с. 129-136.
41. Veselova I.A., Grigoryeva D.L., Orekhova А.Е., Shekhovtsova T.N. Abstracts of the 8th Analytical Russian-German-Ukrainian Symp. (ARGUS). Germany, Hamburg, 2003, p. 27.
42. Cnupo Т.Г. Неорганическая биохимия. Под ред. Г. Эйхгорна. М.: Мир, 1978, т. 1, гл. 17, с. 624.
43. Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии. М.: Химия, 1989, 448 с.
44. Жаворонкова A.M., Мугинова С.В., Шеховцова Т.Н. Ж. аналит. химии, 2003, т. 58, № 6, с. 658—665.
45. Armas G., Cladera A., Becerra Е. е. a. Talanta, 2000, v. 52, p. 77.
46. Шеховцова Т.Н., Чернецкая С.В., Белкова Н.В., Долманова И.Ф. Ж. аналит. химии, 1994, т. 49, № 8, с. 789-795.
47. Будников Г.К., Медянцева Э.П., Бабкина С. С., Волков А.В. Там же, 1989, т. 44, № 12, с. 2253-2257.
48. Медянцева Э.П., Будников Г.К., Бабкина С. С. Там же, 1990, т. 45, № 7, с. 1386-1389.
49. Tran-Minh С. Ion-selective Electrode Rev., 1985, v. 7, № 1, p. 41.
50. Krawczynski vel Krawczyk Т., Moszczynska M., Trojanowicz M. Biosensors & Bioelectronics, 2000, v. 15, p. 681—691.
51. Liu C.C.,Fryburg P.M.,Chen A.K. Bioelectrochem. Bioenerg., 1981, v. 8, № 6, p. 703-708.
52. Kukla A.L., Kanjuk N.I., Starodub N.F., Shirshov Yu.M. Sensors and Actuators, 1999, В 57, p. 213-218.
53.Jasaitis J.J., Rasumas V.J., Kulis J.J. Anal. Chim. Acta, 1983, v. 152, № 1, p. 271-274.
54. Stone J. V, Townshend A. J.C.S. Dalton Trans., 1973, № 5, p. 495.
55. Mattiasson В., Danielsson D., Hermanson Ch., Mosbzch K. FEBS Lett., 1978, v. 85, № 2, p. 203-206.
56. Preininger C., Wolfbeis O. Biosensors & Bioelectronics, 1996, v. 11, № 10, p. 981-990.
57. Tsai H-C., Doong R-A., Chiang H-C., Chen K-T. Analytica Chimica Acta, 2003, v. 481, p. 75-84.
58. Шеховцова Т.Н., Чернецкая С.В., Долманова И.Ф., Никольская Е.Б. Ж. аналит. химии, 1994, т. 49, № 8, с. 862-867.
59. Shekhovtsova T.N., Chernetskaya S.V Anal. Lett., 1994, v. 27, № 15, p. 2883-2838.
60. Шеховцова Т.Н., Чернецкая С.В., Белкова Н.В., Долманова И.Ф. Ж. аналит. химии, 1995, т. 50, № 5, с. 538—542.
61. Мугинова С.В., Аковбян Н.А., Шеховцова Т.Н., Долманова И.Ф. Там же, 1999, т. 54, № 6, с. 645-650.
62. Веселова И.А., Мугинова С.В., Шеховцова Т.Н., Долманова И. Ф. Тез. докл. Всерос. симп. «Тест-методы химического анализа». Москва, 2001, с. 62.
63. Veselova I.A., Shekhovtsova T.N. Anal. chim. acta, 1999, v. 392, p. 151-158.
64. Veselova LA., Shekhovtsova T.N. Ibid., 2000, v. 413, p. 95.
65. Ныганенко А.Я., Жуков В.И., Мясоедов В.В., Завгородс-кий И.В. Клиническая биохимия. М.: Триада-Х, 2002, 497 с.
66. Майстренко В.Н., Хамитов Р.З., Будников Г. К. Эколого-аналитический мониторинг супертоксикантов. М.: Химия, 1996, 320 с.
67. Низин Г. И., Седых Э.М., Банных Л.Н. и др. Ж. аналит. химии, 1995, т. 50, № 1, с. 76-79.
68. Алешина Л.В., Стожко Н.Ю., Брайнина Х.З., Липунова Г.Л. Тез. докл. Поволжской конф. по аналитической химии. Казань, 2001, с. 49.
69. Шеховцова Т.Н., Веселова И.А., Мугинова С.В., Долманова И.Ф. Тез. докл. конф. «Химический анализ веществ и материалов». Москва, 2000, с. 105.
