CC BY
54
УДК 543.426:543.42.062:543.641
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГИДРОПЕРОКСИДОВ ЛИПИДОВ МЕТОДОМ АКТИВИРОВАННОЙ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ
П.О. Волкова, А.В. Алексеев, А.А. Джатдоева, Е.В. Проскурнина, Ю.А. Владимиров
(кафедра медицинской биофизики факультета фундаментальной медицины; e-mail: [email protected])
Разработана методика определения гидропероксидов липидов хемилюминесцент-ным методом в системе липидный субстрат - Fe(II) - кумарин С-525 (активатор хемилюминесценции). Гидропероксиды липидов определяли методом добавок с помощью стандартного соединения шреш-бутилгидропероксида. Предел обнаружения по шреш-бутилгидропероксиду смин = 164 нМ. Проверка правильности осуществлена методом иодометрического титрования. Проведено определение гидропероксидов липидов в пищевом продукте.
Ключевые слова: гидропероксиды липидов, перекисное окисление липидов, активированная хемилюминесценция, кумарин С-525.
Гидропероксиды липидов образуются в ли-пидных системах в процессе перекисного окисления - сложного многостадийного цепного процесса окисления кислородом липидных субстратов (главным образом полиненасыщенных жирных кислот), включающего стадии с участием и образованием свободных радикалов [1]. В настоящее время существует много методов определения гидропероксидов липидов, главным образом в пищевых продуктах (растительных маслах). Одним из самых точных методов является определение перекисного числа иодометрическим титрованием [2]. Преимущества титрования - высокая точность, хорошая чувствительность, отсутствие необходимости использования индикаторов, возможность использования неводных растворителей. Основные ошибки в иодометрии возникают по следующим причинам:
потеря иода вследствие его летучести; окисление I -ионов кислородом воздуха; мешающее влияние веществ, индуцирующих окисление иодида (Си2+, N0^, N0 и др.); щелочная среда; адсорбция молекул иода;
нарушение методики определения в отношении концентраций применяемых растворов, порядка приливания растворов и других условий протекания реакций.
Для получения точных и хорошо воспроизводимых результатов необходимо строго придерживаться рекомендуемых методик определения. Основным недостатком иодометрического титро-
вания при определении гидропероксидов липидов в биологических объектах является относительно невысокий предел обнаружения, а следовательно, и необходимость использовать большое количество образца.
Из инструментальных методов для определения гидроперекисей липидов в растительных маслах активно используют ИК-спектроскопию с Фурье-преобразованием [3, 4]. Калибровочные стандарты для количественного определения готовят добавлением трет-бутилгидропероксида, олеиновой кислоты и воды. Разработан спек-трофотометрический метод для определения ги-дропероксидов на основе сильно поглощающих ионов (1-3) при 360 нм в видимой области [5]. Описана методика определения гидропероксидов липидов, основанная на их взаимодействии с ионами Бе(11) с образованием Ре(Ш), которые реагируют с ксиленоловым оранжевым с образованием окрашенного соединения. Продукт реакции фотометрируют при 560 нм [6].
Для определения перекисных соединений используются также электрохимические методы. Биосенсоры для обнаружения перекиси водорода и перекисных соединений разработаны на основе иммобилизированной каталазы на электроде с клиноптилолитом и углеродной пастой с использованием бычьего сывороточного альбумина и глу-таральдегида. Подобный биосенсор был успешно применен для определения пероксидов в образцах молока [7]. Существует аналогичный вольтампе-рометрический способ с использованием вращающегося дискового электрода [8].
Поскольку процесс перекисного окисления липидов сопровождается хемилюминесценцией (ХЛ), весьма перспективными являются хеми-люминесцентные методики, которые характеризуются высокой чувствительностью, простотой и дешевизной. Тем не менее в литературе имеется мало сведений об аналитических хемилю-минесцентных методиках определения гидро-пероксидов липидов в биологических объектах. Предложен хемилюминесцентный метод определения содержания LOOH в сыворотке (плазме) крови при взаимодействии гидроперокси-дов с системой микропероксидаза-изолюминол [9, 10]. Этот метод предлагается использовать после разделения липидов сыворотки методом ВЭЖХ, что делает анализы дорогостоящими, длительными и трудоемкими.
Цель настоящей работы - разработка методики определения гидропероксидов липидов хемилю-минесцентным методом. В рамках поставленной цели были решены следующие задачи:
исследованы различные аналитические системы,
подобраны оптимальные условия для определения гидропероксидов,
оценены метрологические характеристики, методика апробирована на реальном объекте.
Экспериментальная часть
Объекты исследования, реагенты и аппаратура. Работу выполняли на хемилюминометре «SmartLum-5773» («ДИСофт», Россия), позволяющем регистрировать развитие хемилюминесцен-ции во времени. Пробирки с растворами перемешивали на встряхивателе типа «Vortex».
Буферный раствор концентрацией 20 ммоль/л готовили растворением навески трис--HCl (окси-метиламинометан хлорид) («Reanal», Венгрия) в дистиллированной воде. Для установления необходимого значения pH 7,4 использовали конц. HCl, контролируя кислотность с помощью рН-метра «HANNA pH 211» (США). Буферный раствор перед экспериментом нагревали в термостате при 37°С. Раствор соевого лецитина (ICN Biochemicals, 102147) готовили растворением навески в 20 мМ буферном растворе. Раствор FeSO4 7H2O («ч.д.а.», «Реахим») готовили растворением навески в 0,1 М HCl. К полученному раствору добавляли 1-2 гранулы цинка («ч.д.а.», «Реахим»).
Исходный раствор (1 ммоль/л) кумарина C-525 (ООО НПФ «Альфа-Аконис») готовили растворением навески в метаноле. Рабочие растворы го-
товили разбавлением исходного раствора 20 мМ трис-буферным раствором. Новые потенциальные активаторы хемилюминесценции, в том числе и класса кумаринов, были приобретены в ОАО ПО «ТОС» (таблица), растворы указанных соединений готовили аналогичным образом.
В работе использованы следующие поверхностно-активные вещества: додецилсульфат натрия («Sigma-Aldrich»), тритон Х-100 («Sigma-Aldrich») и Твин-60 («Sigma»). Для иодометриче-ского титрования применяли хлороформ, ледяную уксусную кислоту, KI, Na2S2O3, крахмал (все реактивы «Sigma-Aldrich»).
Результаты и их обсуждение
Для моделирования перекисного окисления липидов ранее использовали либо липосомы яичного желтка [11, 12], либо митохондрии [13]. Методики приготовления липосом и выделения митохондрий трудоемки и требуют специального оборудования. В нашей работе в качестве модельной была выбрана система на основе соевого лецитина.
Соевый лецитин (азо-лектин) - препарат, содержащий 98% фосфолипидов, в том числе 2024% фосфатидилхолина и 18-22% фосфатидил-серина; в структуре фосфолипидов содержатся линолевая (28-30%) и линоленовая кислоты (всего более 60%), средняя молекулярная масса 760 Да. Это вещество стабильно при хранении, недорого, не требует специальной пробоподго-товки и хорошо растворяется в дистиллированной воде. Кроме соевого лецитина модельная ХЛ-система содержала Fe(II) и активатор хемилюминесценции. Общий объем системы составлял 1 мл.
Регистрацию кинетических кривых проводили по следующей схеме: в кювету помещали необходимый объем раствора Fe (II) и в течение 1 мин регистрировали фоновый сигнал. Затем при помощи шприца в режиме online добавляли рассчитанное количество 20 мМ трис-буферного раствора, раствора соевого лецитина, активатора, раствора ПАВ (в опытах по изучению влияния ПАВ) и трет-бутилгидропероксида (при построении градуировочной зависимости). Все эти компоненты предварительно смешивали в пробирке. Во время измерения раствор в кювете перемешивали механической мешалкой со скоростью 16 об/с.
Типичный вид кинетической кривой (рис. 1) соответствует классической кинетике перекис-ного окисления в липидных системах [14, 15] с
Структурные формулы и коэффициенты усиления исследованных соединений
Номер
Структурная формула
Коэффициент усиления
1,21
0,66
1,61
0,89
1,08
1
2
3
4
5
Продолжение таблицы
1,07
1,10
1,01
0,76
10
0,97
6
7
8
9
Продолжение таблицы
11
4,60
12
1,84
13
1,18
14
1,37
15
1,21
Продолжение таблицы
16
0,89
17
2,44
18
1,71
19
1,14
20
0,84
Продолжение таблицы
21 >ЧК2 1,06
22 0,95
23 0,99
24 1,13
25 0,81
Продолжение таблицы
26
1,05
27
1,17
28
0,84
29
1,10
30
0,67
Окончание таблицы
осуществлением следующих основных реакции
[1, 15]:
Ре2+ + 02 ^ ... ^ Ре3+ + гЬ', (1)
Ре2+ + ЬООН + ЬН ^ Ре3+ + ЬОН + ОН- + Ь', (2) Ь + 02 (+ ЬН) ^ ЬООН + Ь', (3)
Ре2+ + Ь' + Н + ^ Ре3+ + ЬН, (4)
ЬОО' + ЬОО' ^ Ь=О + ЬОН + фотон. (5)
Кинетическая кривая состоит из следующих фаз:
быстрая вспышка, которая определяется реакцией гидропероксида с ионами двухвалентного железа (реакция 2), ее амплитуда может служить аналитическим сигналом латентного периода, обусловленного антиоксидантным действием ионов железа (реакция 4);
медленная вспышка, протекание которой определяют в основном реакции 2, 3 и 5.
Изучение влияния ПАВ и активаторов
Раствор лецитина в воде при высокой концентрации представляет собой гетерогенную систему, что ухудшает воспроизводимость и чувствительность ХЛ-определения. Было сде-
лано предположение, что присутствие поверхностно-активных веществ (ПАВ) в системе будет гомогенизировать систему и увеличивать амплитуду быстрой вспышки, однако оно не подтвердилось. Изученные ПАВ либо не влияли на амплитуду быстрой вспышки хемилюминес-ценции (додецилсульфат натрия, Тритон Х-100), либо содержали компоненты, реагирующие с ионами железа, что сопровождалось хемилюми-несценцией в отсутствие липидного субстрата (Твин-60).
Для повышения чувствительности ХЛ, сопровождающей перекисное окисление липидов, ранее был предложен физический активатор -кумарин С-525. Добавление этого соединения увеличивает квантовый выход ХЛ-реакции [16] и позволяет измерять хемилюминесценцию в малых количествах биологического материала. Вторым достоинством является селективность усиления [16]. Важно и то, что физические сенсибилизаторы не участвуют в реакциях, а следовательно, их применение не сказывается на ходе процессов ни в химических, ни в биологических системах [16].
'хл>В
2 -
-
Добавление смеси
буферного раствора,
раствора соевого
лецитина и кумарина
С-525
Добавление
Fe(II)
<_________ 1: 1 ' 1 1 1 1 1 ! 1 1
0 1 2 3 4 5
Время, мин
Рис. 1. Хемилюминесцентная кривая перекисного окисления липидов; состав системы: 10 мкг/мл соевого лецитина, 0,1 мМ Fe (II), 50 мкМ С-525. Быстрая и медленная вспышки и латентный период отмечены на рисунке
В настоящей работе мы исследовали ряд новых красителей, в том числе кумариновых соединений, с целью определить наиболее эффективный активатор ХЛ. Все вещества добавляли в конечной концентрации 50 мкМ и регистрировали ХЛ-кривые, по которым определяли амплитуду быстрой вспышки. Рассчитывали коэффициенты усиления ХЛ-активаторами как отношение амплитуды быстрой вспышки системы с активатором к амплитуде быстрой вспышки без активатора. Три соединения из изученных, которые были производными кумарина, оказались эффективными активаторами ХЛ. Кумарин С-525 и соединения № 11 и № 17 усиливали вспышку хемилюминесценции соответственно в 4,65, 4,60 и 2,44 раза (таблица).
Подбор концентрации реагентов
Для подбора соотношения значений рабочей концентрации компонентов системы получены кинетические кривые при разной концентрации соевого лецитина, кумарина С-525 и Ре(11). Оптимальными оказались значения рабочей концентрации 0,10 мМ Ре(11) и 50 мкМ С-525. Зависимость максимума хемилюминесценции от концентрации лецитина в диапазоне от 0 до 100 мкг/мл имеет линейный характер, коэффициент корреляции г = 0,997:
1макс = (98,96 ± 2,05)-с + (0,65 ± 0,05)
(Р = 0,95; п = 6), (6)
где с - концентрация соевого лецитина в мкг/мл, I,.™.- интенсивность быстрой вспышки, В.
макс
Трет-бутилгидропероксид как стандартное соединение
Трет-бутилгидропероксид широко применяется в качестве стандарта при определении гидроперекисей липидов в биологических объектах, пищевых продуктах и медицинских препаратах [9, 17]. При проведении ХЛ-опыта в системе трет-бутилгидропероксид - Ре(11) - кумарин С-525 уровень хемилюминесценции не отличался от фонового, так как для развития перекисно-го окисления необходима липидная матрица, по этой причине в систему добавляли постоянное количество соевого лецитина. Были проведены эксперименты при разных концентрациях трет-бутилгидропероксида с постоянными конечными концентрациями (10 мкг/мл соевого лецитина; 50 мкМ кумарина С-525; 0,1 мМ Ре(11)).
Уравнение градуировочной прямой:
где - интенсивность быстрой вспышки (В),
макс
С-ВНР - концентрация трет-бутилгидропероксида (мкМ).
Коэффициент корреляции г = 0,999; предел обнаружения по трет-бутилгидропероксиду смин = 164 нМ; коэффициент чувствительности 5 = 53,21 ± 1,28 В-л/моль; относительное стандартное отклонение яг = 1,37-10 2. Таким образом, разработанная методика обладает удовлетворительными метрологическими характеристиками.
Экстраполяция прямой до пересечения с осью концентраций стандартного раствора трет-бутилгидропероксида (метод добавок) позволяет определить содержание гидропероксидов в исследуемом образце, в нашем случае - коммерческий препарат соевого лецитина в единицах трет-бутилгидропероксида. Концентрация гидроперок-сидов в лецитине составила:
с
ЯООН
(2,67 ± 0,72)/(53,21 ± 1,28) =
= 0,05 мкМ.
(8)
Проверка правильности
Содержание гидропероксидов липидов в образцах соевого лецитина разной концентрации, оцененное по интенсивности хемилюминесцен-ции, было проверено стандартным иодометриче-ским методом по ГОСТ Р 51487-99. В коническую колбу (300 мл) вносили навеску образца массой 1 г и 10 мл хлороформа; после растворения пробы приливали 10 мл ледяной уксусной кислоты и 1 мл 10%-го раствора К1. Колбу закрывали пробкой, перемешивали в течение 1 мин и оставляли в темном месте на 15 мин. Затем приливали 75 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивали и вносили 5 капель 1%-го раствора крахмала. Оттитровывали выделяющийся иод 0,01 М раствором На^О^ Перекисное число рассчитывали по формуле:
ПЧ = ((У0 - Ух)/ш)с 1000, (9)
где У0 - объем раствора тиосульфата натрия, использованного при контрольном измерении, мл; У1 - объем раствора тиосульфата натрия, использованного при измерении, мл; с - концентрация использованного тиосульфата натрия, моль/л; ш -масса испытуемой пробы, г.
Методы продемонстрировали достаточно высокий уровень корреляции (г = 0,989, р < 0,001) (рис. 2). Уравнение корреляции:
4ах = (53,21 ± 1,28)С-ВНР + (2,67 ± 0,72) (Р = 0,95; п = 6),
ПЧ = 0,84^ + 31,38,
(10)
(7) где с
г-ВНР
концентрация гидропероксидов ли-
100
0 -1-1-1-1-1-1—
О 100 200 300 400 500 600 ХЛ , мМ/кг /-ВНР
Рис. 2. Корреляция между значениями содержания липидных гидропероксидов, определенными методом хемилюминесценции и иодометрическим титрованием
пидов в единицах трет-бутилгидропероксида, мМ/кг; ПЧ - перекисное число, мМ/кг 1/2О2.
Однако при определении гидропероксидов по данной методике обнаружено некоторое «ложное» количество этих соединений в образце, где гидропероксиды вообще не были добавлены. Кроме того, ХЛ-метод дает завышенное (на 19%) значение концентрации гидропероксидов по сравнению с иодометическим методом. Это связано с тем, что кинетические кривые при раз-
т^ 2+
ложении липогидропероксидов ионами ^е не вполне идентичны кривым ХЛ при разложении трет-бутилгидропероксида, а кроме того, квантовый выход свечения может быть не одним и тем же. Поэтому получаемые данные могут либо быть выражены в эквивалентной концентрации трет-
Работа выполнена при финансовой п
бутилгидропероксида, либо рассчитываться по уравнению:
СЬООИ = 1,19сК00Ы. (11)
Определение липидных гидропероксидов в сухих сливках
Методику применяли для определения гидро-пероксидов липидов в сухих сливках «Аристократ» методом добавок с использованием трет-бутилгидропероксида. Аналитическая ХЛ-система состояла из Ре(П) (конечная концентрация 0,1 мМ) и кумарина С-525 (50 мкМ), 10 мг/мл раствора сухих сливок в воде и разного количества трет-бутилгидропероксида (конечные концентрации 0; 50; 80; 110; 140; 170 мкМ). Аналитическим сигналом служил максимум быстрой вспышки.
Уравнение градуировочной прямой:
/макс = (0,191 ± 0,008)-с + (4,926 ± 0,825)
^ = 0,95; п = 6), (12)
где / „„ - интенсивность быстрой вспышки
макс
(В), с — концентрация липидных гидропероксидов в единицах концентрации трет-бутилгидропероксида (мкМ). Коэффициент корреляции: г = 0,997.
Рассчитанное содержание гидропероксидов ли-пидов в единицах трет-бутилгидропероксида в исходном порошке сухих сливок:
с^-внр = (2,58 ± 0,27) мМ в 1 г порошка.
Таким образом, разработана методика определения гидропероксидов липидов методом активированной хемилюминесценции с использвоанием трет-бутилгидропероксида как стандартного соединения. Данная методика применима для определения содержания гидропероксидов липидов в пищевых продуктах.
держке РФФИ (проект № 14-04-01361 а).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.,1972.
2. Масла растительные и жиры животные. Метод определения перекисного числа, ГОСТ Р 51487991999.
3. Van de VoortF.R. //J. Am. Oil. Chem. Soc. 1994. Vol. 71. Р. 921.
4. Van de Voort F.R. // Food. Anal. Methods. 2008. Vol. 1. Р. 153.
5. BloomfieldM.S. //Analyst. 1999. Vol. 124. Р. 1865.
6. Grau A. // J. Agric. Food. Chem. 2000. Vol. 48. Р. 4136.
7. Silva R.A.B. // Food. Chem. 2012. Vol. 133. Р. 200.
8. Lagrange J., Lagrange P. // Fresenius J. Anal. Chem. 1991. Vol. 339. Р. 452.
9. Yamamoto Y., Kambayashi Y., Ueda T. // Methods Mol. Biol. 1998. Vol. 108. Р. 63.
10. Adachi J. et al. //Lipids. 1998. Vol. 33. Р. 1235.
11. Шерстнев М.П., Азимбаев Т.К., Владимиров Ю.А. // Биофизика. 1995. Т. 40. С. 531.
12. Васильева О.В. // Биол. мембраны. 1998. Vol. 15. С. 177.
13. Суслова Т.Б., Оленев В.И., Владимиров Ю.А. // Биофизика. 1969. Т. 14. С. 510.
14. Погосян Г.А. // Биофизика. 1996. Vol. 41. С. 342.
15. Измайлов Д.Ю., Владимиров Ю.А. // Биологические мембраны. 2002. Т. 19. С. 507.
16. Sharov V.S., DreminaE.S., VladimirovIu. A. //. Biofizika. 17. Van de Voort F.R. // J. Am. Oil. Chem. Soc. 1998. 1995. Vol. 40. Р. 428. Vol. 71. Р. 921.
Поступила в редакцию 23.04.15
QUANTITATION OF LIPID HYDROPEROXIDES BY ENHANCED CHEMILUMINESCENCE
P.O. Volkova, A.V. Alekseev, A.A. Dzhatdoeva, E.V. Proskurnina, Yu.A. Vladimirov
(M.V.Lomonosov Moscow State University, Faculty of Basic Medicine; e-mail: [email protected])
For the determination of lipid hydroperoxides, an analytical procedure was proposed based on enhanced chemiluminescence. The analytical system consists of a lipid, Fe(II), and coumarin C-525 as an enhancer of chemiluminescence. The lipid hydroperoxides were determined with spiked solutions using tert-butyl hydroperoxide as an internal standard. The analytical procedure provides a detection limit as low as 164 nM. The accuracy verification was performed with iodometric titration. The assay was used for the determination of total lipid hydroperoxides in food.
Key words: lipid hydroperoxides, lipid peroxidation, enhanced chemiluminescence, coumarin С-525.
Сведения об авторах: Волкова Полина Олеговна - студентка химического факультета; Алексеев Андрей Владимирович - науч. сотр. Всероссийского научно-исследовательского института авиационных материалов ([email protected]); Джатдоева Айшат Абдрахмановна - аспирант кафедры медицинской биофизики факультета фундаментальной медицины (ayshatdj@gmail. com); Проскурнина Елена Васильевна - доцент кафедры медицинской биофизики факультета фундаментальной медицины, канд. хим. наук ([email protected]); Владимиров Юрий Андреевич - зав. кафедрой медицинской биофизики факультета фундаментальной медицины, профессор, акад. РАН ([email protected]).
