CC BY
191
КИНЕТИКА
УДК 547.22:541.13:541.8.8541.127
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ И АНТИРАДИКАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНЫХ ФРАКЦИЙ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ
В.С.Бережной, О.В.Смирнова, И.В.Ефимова, С.Л.Хилько
DETERMINATION OF ANTIOXIDANT AND ANTIRADICAL ACTIVITY OF LOW-TEMPERATURE
FRACTIONS OF HUMIC SUBSTANCES
V.S.Berezhnoy, О.V.Smirnova, I.V.Efimova, S.L.Khil'ko
Институт физико-органической химии и углехимии им. ЛМ.Литвиненко НАН Украины, Донецк, [email protected]
Изучены антиоксидантные и антирадикальные свойства низкотемпературных фракций гуминовых (ГК) и гиматомелановых (ГмК) кислот из бурого угля. Методом газоволюмометрии изучали инициированное азодиизобутиронитрилом жидкофазное окисление кумола в среде диметилсульфоксида в присутствии ГК и ГмК, взятых в широком диапазоне концентраций. Показано, что ГК обладают более выраженными антиоксидантными свойствами, чем ГмК. Антирадикальные свойства ГК и ГмК изучали по реакции взаимодействия с 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилом и характеризовали «эффективным соотношением компонентов» ЭСК. Данный параметр был получен для ГК и ГмК и сопоставлен с аналогичным для аскорбиновой кислоты и кверцетина. Кинетические эксперименты продемонстрировали применимость использованных методов для оценки антиоксидантных и антирадикальных свойств гуминовых веществ.
Ключевые слова: антиоксидантная активность, антирадикальная активность, гиматомелановые кислоты, гуминовые кислоты, жидкофазное окисление
Some antioxidant and antiradical properties of low-temperature fractions of humic (HA) and hymatomelanic (HY) acids of brown coal are researched. Azobisisobutyronitrile initiated liquid-phase cumene oxidation in dimethylsulfoxide with HA and HY of different concentrations is investigated by the method of gasvolumetrie. It is shown that HA have more intense antioxidant properties than HY. Antiradical properties of HA and HY were studied on the reaction of interaction between them and 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl. The properties were characterized by the «effective component ratio» (ECR). We found this parameter for HA and HY and compared it with the analogous one for ascorbic acid and quercetin. Kinetic experiments showed the relevance of the methods used for determination of antioxidant and antiradical properties of humic substances.
Keywords: antioxidant activity, antiradical activity, hymatomelanic acids, humic acids, liquid-phase oxidation
В последние десятилетия внимание ученых различных направлений — химии, биологии, фармакологии — привлечено к антиокислительным свойствам веществ природного происхождения. Интерес этот обусловлен, с одной стороны, перспективой использования этих веществ в качестве стабилизаторов продуктов питания, фармпрепаратов и др., а с другой — тем обстоятельством, что природные антиоксидан-ты отличаются доступностью и экологичностью [1,2]. Известно, что гуминовые вещества (ГВ) обладают высокой биологической активностью: гепатопротек-торные, антитоксические, антигипоксические свойства. Высокая биологическая активность ГВ связана с их выраженным сродством к биологическим мембранам, участием в ионном транспорте, влиянием на активность ферментов и др. [3,4]. В настоящее время ГВ признаны одним из перспективных направлений «зеленой» химии как доступный и дешевый источник сырья для получения химически важных продуктов [5]. Изучение состава и свойств природных биологи-
чески активных наноструктурированных объектов в современной химии является перспективной задачей.
Наиболее реакционноспособным компонентом ГВ являются гуминовые кислоты (ГК), которые в зависимости от природных источников могут отличаться элементным составом, а значит и свойствами [3-5]. Гиматомелановые кислоты (ГмК) представляют спирторастворимую фракцию гуминовых кислот. ГК и ГмК являются природными соединениями, которые представляют собой сложную органическую структуру с конденсированными ароматическими ядрами, имеющими боковые цепи различной степени разветвления, в состав которых входят различные гидрофильные функциональные группы: карбоксильные, гидроксильные, хиноидные, аминогруппы [6,7]. Наличие этих функциональных групп в структуре макромолекул обуславливает биологическую активность ГВ и предполагает их способность к антиоксидант-ному действию [8-10]. Однако детальных исследований этих свойств гуминовых веществ в литературе
достаточно мало. Целью работы было исследование антиоксидантной и антирадикальной активности ГК и ГмК.
Экспериментальная часть
Низкотемпературные фракции ГК и ГмК получали из бурого угля Александрийского месторождения (Украина). ГК — однократной экстракцией 0,1 н. раствором №ОН, а ГмК — однократной экстракцией этиловым спиртом из исходного сырья при температуре 20°С.
Для определения антиоксидантной активности ГК и ГмК изучали инициированное азодиизобу-тиронитрилом (АИБН) жидкофазное окисление ку-мола в среде диметилсульфоксида (ДМСО) в присутствии ГК и ГмК в широком диапазоне концентраций [11,12]. За кинетикой процесса окисления следили газоволюмометрически, измеряя количество поглощенного кислорода при постоянной температуре 75°С и постоянном парциальном давлении кислорода 760 мм. рт. ст. на установке, описанной в [13]. Процесс проводили в кинетической области, где скорость реакции не зависит от скорости перемешивания. В работе использовали очищенные АИБН, кумол, ДМСО согласно методике [14]. Концентрация кумола в исследуемой системе составляла 3,59 моль/л, АИБН — 2,00 10-2 моль/л, ГК и ГмК — 0-10,0 г/л.
Для определения антирадикальной активности ГК и ГмК использовали реакцию со стабильным свободным радикалом 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилом (ДФПГ) [15,16]. Исследования проведены на спектрофотометре Specord UV VIS в кюветах шириной 1 см. Раствор ДФПГ(1,0-10-4 моль/л) фирмы «Aldrich»
(га = 97%) готовили в ДМСО. Из исходных растворов ГК и ГмК в ДМСО (1,08 г/л) готовили серию последовательных разбавлений, к 2,0 мл каждого из полученных растворов серии приливали 3,0 мл раствора ДФПГ и сразу же после смешивания регистрировали значения оптической плотности при X = 518 нм. Из-за насыщенной окраски растворов ГК и ГмК в качестве раствора сравнения использовали растворы ГК и ГмК в ДМСО, той же концентрации, что и в исследуемой пробе. Растворы аскорбиновой кислоты и кверцетина фирмы «АИпсЬ> (га = 99,5%) в ДМСО готовили по определенной навеске. Рабочие растворы готовили методом последовательных разбавлений. В работе использовались только свежеприготовленные растворы.
Результаты и обсуждение
Для определения антиоксидантной активности (АОА) ГК и ГмК использовался газоволюмометриче-ский метод, как наиболее информативный и позволяющий оценить характер процесса ингибирования. Нами исследовано поведение ГК и ГмК в качестве ингибитора радикально-цепного процесса окисления углеводородов в органической среде. Как показано на рис.1а, добавление ГмК к окисляемой смеси Ку -ДМСО - АИБН приводит к понижению скорости поглощения кислорода системой на протяжении всего времени эксперимента. Аналогичные по характеру кинетические кривые были получены для систем с ГК.
С увеличением концентрации ГК и ГмК в системе скорость окисления исследуемой смеси уменьшается. Из полученных кинетических кривых по тангенсу угла наклона определяли скорость поглощения кисло-
рода исследуемой системой. Антиоксидантную активность (АОА) ГК и ГмК характеризовали отношением:
АОА = Wo/w, (1)
где w — скорость поглощения кислорода системой с ингибитором, моль/(л-с), wo — скорость поглощения кислорода системой без ингибитора, моль/(л-с). Значение величины АОА увеличивается с ростом концентрации ГмК и ГК в исследуемой системе (табл.1). Из полученных данных видно, что низкотемпературная фракция ГК обладает более выраженными анти-оксидантными свойствами, чем низкотемпературная фракция ГмК, получаемая экстракцией непосредственно из исходного сырья.
Таблица 1
Антиоксидантная активность гуминовых и гиматоме-лановых кислот в зависимости от их концентрации (С)
С, г/л АОА
ГК ГмК
0,1 1,09 1,02
1,0 1,60 1,45
2,0 2,97 2,00
5,0 8,90 6,73
7,0 11,50 —
10,0 34,50 10,62
Для определения антирадикальной активности (АРА) ГК и ГмК спектрофотометрическим методом [15,16] изучено взаимодействие свободного радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (ДФПГ) с изучаемыми антиоксидантами в среде ДМСО. На рис.1б представлены характерные кинетические кривые расходования ДФПГ в реакции с ГмК, для систем с ГК были получены аналогичные по характеру кинетические кривые. Показано (табл.2), что с увеличением концентрации ГмК и ГК наблюдается снижение остаточного содержания ДФПГ в исследуемой системе, а значит, увеличивается антирадикальная активность.
Таблица 2
Значение величины остаточного содержания ДФПГ (%ДФПГ) в зависимости от концентрации (С) ГК и ГмК и их количество (г/гдфпг), приходящиеся на 1 г ДФПГ
С, мг/л г/гДФПГ %ДФПГ
ГК ГмК
27,0 1,13 91,50 95,70
30,9 1,28 87,82 95,00
48,0 2,00 85,78 94,04
54,0 2,25 79,85 93,21
61,6 2,57 76,23 91,55
72,0 3,00 70,37 89,31
Для характеристики антирадикальной активности использовали «эффективное соотношение компонентов» ЭСК, которое определяется отношением:
ЭСК=[1п]/[ДФПГ], (2)
где [1п] — концентрация антиоксиданта, которая обеспечивает снижение концентрации ДФПГ в 2 раза на 5-й минуте взаимодействия, г/л; [ДФПГ] — концентрация ДФПГ, г/л. Значение параметра ЭСК обратно пропорционально антирадикальной активности ингибитора. Для нахождения параметра ЭСК получена зависимость остаточного содержания ДФПГ (рис.2) от массы ГК (а) и ГмК (б), приходящейся на 1 г ДФПГ.
ГВ (г/г (ДФПГ)
Рис.2. Зависимость остаточного содержания ДФПГ на 5 мин взаимодействия от массы ГмК и ГК (б), приходящейся на 1 гДФПГ
Для сравнения антирадикальных свойств ГК и ГмК с известными биологически активными ингибиторами фенольной природы изучено взаимодействие ДФПГ с аскорбиновой кислотой (АК) и кверце-тином (Кв). В табл.3 представлены значения параметра ЭСК для изученных в данной работе антиок-сидантов.
Таблица 3 Значения параметра ЭСК для некоторых антиоксидантов
Антиоксидант ЭСК
АК 0,78
Кв 2,74
ГК 5,36
ГмК 16,71
Показано, что АК имеет наименьше значение параметра ЭСК, а значит обладает наиболее выраженными антирадикальными свойствами из представленных в данной работе ингибиторов.
Следует подчеркнуть, что параметр ЭСК ха-рактеризирует соотношение компонентов по массе, но в данной работе также определены мольные соотношения концентраций Кв и АК. В табл.4 представлены значения концентраций аскорбиновой кислоты и кверцетина, которые обеспечивают такое же снижения концентрации ДФПГ на 5 минуте взаимодействия, что и рабочие концентрации ГК и ГмК.
Таблица 4
Концентрации аскорбиновой кислоты ([АК]экв) и кверцетина ([Кв]экв), эквивалентные концентрации (С) ГК и ГмК
С, [АК]экв, мкмоль/л [Кв]экв, мкмоль/л
мг/л ГК ГмК ГК ГмК
27,0 9,94 5,64 23,36 6,90
30,9 12,74 6,27 34,08 9,31
48,0 14,58 7,14 41,11 12,62
54,0 19,92 7,88 61,55 15,48
61,6 23,18 9,38 74,04 21,21
72,0 28,46 11,40 94,26 28,93
Также рассчитано (табл.5) количество аскорбиновой кислоты и кверцетина, которое эквивалентно
1 г ГК и ГмК для снижения концентрации ДФПГ в
2 раза на протяжении 5 минут.
Таблица 5 Количество антиоксиданта (и), соответствующее по антирадикальной активности 1 г гуминового вещества
Анти- и, ммоль
оксидант АК Кв
ГК 0,35 1,59
ГмК 0,12 0,56
Из полученных данных видно, что низкотемпературная фракция гуминовых кислот обладает более сильным антирадикальным действием, чем низкотемпературная фракция гиматомелановых кислот. На это указывает величина параметра ЭСК. Это также видно из сравнения значений количества аскорбиновой кислоты и кверцетина, которое соответствует по антирадикальной активности 1 г гуминового вещества.
Выводы
Таким образом, в данной работе было изучено ингибирующее действие ГК и ГмК из бурого угля в процессе инициированного радикально цепного окисления модельного субстрата и в реакции со стабильным свободным радикалом 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилом. Рассчитана АОА ГВ в процессе окисления. Показано, что ГК обладают большей АОА, чем ГмК. Найден параметр ЭСК, характеризующий АРА ГК и ГмК в реакции с ДФПГ, а также АРА аскорбиновой кислоты и кверцетина, использованных в качестве сравнения. Показано, что ГК по антирадикальному действию приближается к антиоксидантам средней силы, ГмК же является слабым ингибитором.
Данная работа продемонстрировала применимость использованных методов для оценки антиокси-дантных и антирадикальных свойств гуминовых веществ.
«Зеленая» химия в России // Сб. науч. статей / Под ред. В.В.Лунина, П.Тундо, Е.С.Локтевой М: МГУ, 2004. 230 с. Волков В.А., Дорофеева Н.А., Пахомов П.М. Кинетический метод анализа антирадикальной активности экстрактов растений // Хим. фарм. журн. 2009. Т.43. №6. С.27. Лиштван И.И., Круглицкий Н.Н., Третинник В.Ю. Физико-химическая механика гуминовых веществ. Минск: Наука и техника, 1976. 264 с.
4. Орлов Д.С. Спектрофотометрический анализ гумусовых веществ // Почвоведение. 1965. № II. С.84.
5. Орлов Д.С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации. М.: Изд-во МГУ, 1990. 325 с.
6. Schulten H.R. The three-dimensional structure of humic substances and soil organic matter studied by computational analytical chemistry // Fresenius J. Anal. Chem. I995. V.351. P.62-73.
7. Scott D.T., McKnight D.M., Blunt-Harris E.L. et al. Quinone Moieties Act as Electron Acceptors in the Reduction of Humic Substances by Humics-Reducing Microorganisms // Environ. Sci. Technolog. 1998. V.32. P.2984.
8. Steelink C., Tolllin G. Stable free radicals in soil humic acid // Biochim. Biophis. Acta. 1962. V.59. P.25.
9. Molyneux P. The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity // Songklanakarin J. Sci. Technol. 2004. V.26(2). P.211.
10. Alvarez-Puebla R.A., Valenzuela-Calahorro C., Garrido J.J. Theoretical study on fulvic acid structure, conformation and aggregation: A molecular modelling approach // Science of the Total Environment. 2006. V.358. P.243-254.
11. Atmospheric Oxidation and Antioxidants / Ed. Scott G. Amsterdam: Elsevier, 1993. V.1-3.
12. Денисов Е.Т., Азатян В.В. Ингибирование цепных реакций. Черноголовка: ИХФ РАН, 1997. 370 с.
13. Эмануэль Н.М., Заиков Г.Е., Майзус З.К. Роль среды в радикально-цепных реакциях окисления органических соединений. М.: Наука, 1973. 173 с.
14. Armarego W.L.F., Chai C.L.L. Purification Of Laboratory Chemicals. Elsevier Science, 2003. 608 p.
15. Lebeau J., Furman C., Bernier J.-L et al. Antioxidant properties of di-terf-butylhydroxylated flavonoids // Free Radical Biology & Medicine. 2000. V.29. № 9. Р.900-912.
16. Bondet V., Brand-Williams W., Berset C. Kinetics and Mechanisms of Antioxidant Activity usingthe DPP№ Free Radical Method // Lebensm.-Wiss. U.-Technol. 1997. V.30. P.609.
Bibliography (Transliterated)
1. «Zelenaia» khimiia v Rossii // Sb. nauch. statei / Pod red. V.V.Lunina, P.Tundo, E.S.Loktevoi M: MGU, 2004. 230 s.
2. Volkov V.A., Dorofeeva N.A., Pakhomov P.M. Kinetiche-skii metod analiza antiradikal'noi aktivnosti eks-traktov rastenii // Khim. farm. zhurn. 2009. T.43. №6. S.27.
3. Lishtvan I.I., Kruglitskii N.N., Tretinnik V.Iu. Fiziko-khimicheskaia mekhanika guminovykh veshchestv. Minsk: Nauka i tekhnika, 1976. 264 s.
4. Orlov D.S. Spektrofotometricheskii analiz gumusovykh veshchestv // Pochvovedenie. 1965. № II. S.84.
5. Orlov D.S. Gumusovye kisloty pochv i obshchaia teoriia gumifikatsii. M.: Izd-vo MGU, 1990. 325 s.
6. Schulten H.R. The three-dimensional structure of humic substances and soil organic matter studied by computational analytical chemistry // Fresenius J. Anal. Chem. I995. V.351. P.62-73.
7. Scott D.T., McKnight D.M., Blunt-Harris E.L. et al. Quinone Moieties Act as Electron Acceptors in the Reduction of Humic Substances by Humics-Reducing Microorganisms // Environ. Sci. Technolog. 1998. V.32. P.2984.
8. Steelink C., Tolllin G. Stable free radicals in soil humic acid // Biochim. Biophis. Acta. 1962. V.59. P.25.
9. Molyneux P. The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity // Songklanakarin J. Sci. Technol. 2004. V.26(2). P.211.
10. Alvarez-Puebla R.A., Valenzuela-Calahorro C., Garrido J.J. Theoretical study on fulvic acid structure, conformation and aggregation: A molecular modelling approach // Science of the Total Environment. 2006. V.358. P.243-254.
11. Atmospheric Oxidation and Antioxidants / Ed. Scott G. Amsterdam: Elsevier, 1993. V.1-3.
12. Denisov E.T., Azatian V.V. Ingibirovanie tsepnykh reak-tsii. Chernogolovka: IKhF RAN, 1997. 370 s.
13. Emanuel' N.M., Zaikov G.E., Maizus Z.K. Rol' sredy v radikal'no-tsepnykh reaktsiiakh okisleniia organicheskikh soedinenii. M.: Nauka, 1973. 173 s.
14. Armarego W.L.F., Chai C.L.L. Purification Of Laboratory Chemicals. Elsevier Science, 2003. 608 p.
15. Lebeau J., Furman C., Bernier J.-L et al. Antioxidant properties of di-tert-butylhydroxylated flavonoids // Free Radical Biology & Medicine. 2000. V.29. № 9. R.900-912.
16. Bondet V., Brand-Williams W., Berset C. Kinetics and Mechanisms of Antioxidant Activity usingthe DPP№ Free Radical Method // Lebensm.-Wiss. U.-Technol. 1997. V.30. P.609.
2.
