CC BY
60
УДК 622.276.63
М.Д. КИЯШЕВ, Г.М. ПИЧХАДЗЕ, Д.К. КИЯШЕВ
Казахский национальный медицинский университет имени С.Д. Асфендиярова
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ 1% РАСТВОРА КИСЛОТЫ САЛИЦИЛОВОЙ, БРИЛЛИАНТОВОГО ЗЕЛЕНОГО В РАЗЛИЧНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ СПИРТА (40-90%) И КОМПОЗИЦИОННОГО РАСТВОРА «БРИСАЛ» В 70% СПИРТЕ
Более удобным способом синтезированы бриллиантовый зеленый и кислота салициловая. Изучены влияние различных концентраций спирта (40-90%) на антимикробную активность 1% раствором бриллиантового зеленого и кислоты салициловой, также изучены антимикробная активность нового композиционного препарата «Брисал».
Воспаление является универсальной реакцией организма на воздействие разнообразных экзогенных и эндогенных повреждающих факторов, к которым относится возбудители бактериальных, вирусных и паразитарные инфекции, а так же аллергических, физические и химические агенты. Они вызывают как местные, так и общие реакции. При лечении ограниченных поражении кожи и слизистых оболочек лучших результатов можно достичь с помощью менее вредных для организма антисептиков. Такой подход более правильный рациональный еще и потому, что он дает возможность снизить вероятность повышения толерантных к антибиотикам штаммов микроорганизмов, продлевает и повышает противомикробную активность химиотерапевтических препаратов, ведет более эффективному использованию их и в конечном итоге снижает затраты на поиск антибиотиков. Антисептики обычно наносят наружно на покровные ткани. Отдельные антисептики используют
для воздействия на микроорганизмы , локализирующиеся в желудочно- кишечном тракте и мочевыводящих путях. В зависимости от концентрации они оказывает бактериостатического или бактерицидной действие. Но в общем антисептика прочно и навсегда вошла в хирургию. Например , из хирургических клиник исчезли такие страшные осложнения, как рожа и госпитальная гангрена. Поэтому вопросы разработки способов синтеза и технологии приготовление различных антисептиков и противовоспалительных средств имеют первостепенное значение. В этой связи с одним из автором разработан новый способ синтеза бриллиантового зеленого из бензальгедида с помощью капельной подачи кислоты хлороводородной. При этом реакция протекает с эквивалентными количествами бензальдегида и N1, Ы1- диэтиланилина, в связи с чем отпадает необходимость отгонки его с водяным паром /1,2/.
Реакция протекает по уравнению:
н
он
\=/ / \=/ РЬОз.НС! Ч=/ ' 4=7
-РЬ(ОН2)
он
О
он
он
с2н5
N I
с2н5
-ОЮ-
_ С2Н5
=\ I2 5 N I
С2Н5
он
1
2
1
3
3
4
о
о
о
о
4
5
Рисунок 1 - Химическое строение бриллиантового зеленого подтверждено данными ПМР- и ИК-спектрами.
Таблица 1 - ПМР- и ИК- спектры производных триарилметана (3,4,5)
№ соед. И К-с пе ктр ы, см-1 ПМР-спектры, б м.д.
Ar Alk C-N OH CH3 CH3 CH C6H4 CsH5 OH
3 700 1610 2860 2470 1330 1520 - 1(т) 3,01(кв) 5,25(с) 6,25 6,87(д) 7,12(с) -
4 700 1610 2860 2470 1350 1510 1400-360 1,07(т) 3,27(кв) - 6,50 7,02(д) 7,22(с) -
5 700 1650 2850 1350 1520 1900-340 1,25(с) 3,52(м) - 6,32 6,81(д) 7,40(м) 7,91(с)
При синтезе кислоты салициловой по методу Кольбе-Шмидта реакция проходит при присутствии очень гигроскопического реактива фенолята натрия. Следовательно, присутствие воды в реакционной среде приводит к различным осложнениям, что уменьшает выход кислоты салициловой. Поэтому для исключения
OH
А
NaOC(O)Et, 2000C
-EtOH
OH
■ COONa+
из реакционной среды фенолята натрия нами использован в качестве карбоксилирующего агента натриевая и калиевая соль этилугольной кислоты. Тем самым выход продукта увеличился до 50% по следующей формуле /3/
OH
COONi
HCI -»
-NaCI
На кафедре фармацевтической химии Казахского национального медицинского университета им. С.Д.Асфендиярова проведен полный фармакопейный анализ салициловой кислоты, полученной по новому способу. Испытания данного препарата на соответствие требованиям действующей нормативно-технической документации на кислоту салициловую включали следующие показатели качества: описание, растворимость, подлинность, температура плавления, прозрачность и цветность раствора, хлориды, сульфаты, органические примеси, красящие вещества и фенол, оксидифенил, сульфатная зола и тяжелые металлы, потеря в массе при высушивании и количественные определения. Все испытания проводились по методикам ГФ XI издания. В результате проведенных испытаний установлено полное соответствие качественных показателей салициловой кислоты, полученной по новому способу, требованиям действующей ВФС на данный препарат.
Кислоту салициловую применяют в медицинской практике как антисептическое, отвлекающее, раздражающее и кератолитическое средство в присыпках (2-5%) и (1-10%) мазях, пастах, спиртовых растворах (1-2%), при этом как растворитель во всех случаях берется 70% этиловый спирт и этот препарат называется салициловым спиртом. В связи с этим,
авторами /4/ для определения влияния различных концентрации спирта на антимикробную активность действующего вещества приготовлен 1% раствор бриллиантового зеленого и кислоты салициловой в 6 образцах в этиловом спирте различных концентрации (40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%) /5,6/. Лабораторные испытания на противомикробную активность препаратов бриллиантового зеленого и кислоты салициловой проводились нами в соответствии с существующими методами по изучению обеззараживающей активности дезинфектантов (Методы испытания дезинфекционных средств для оценки их безопасности и эффективности. Москва, 1998 г.; Методы бактериологического контроля антимикробной активности дезинфицирующих и антисептических средств. Астана, 2006 г.) в качестве тест-штаммов использовались микроорганизмы, рекомендуемые для таких исследований: штаммы грамположительных бактерий Bacillus Subtilis, Staphylococcus aureus, штаммы грамотрицательных Escherichia coli и дрожжевые грибы Candida albicans методом диффузии в агар (лунок) /7/. Результаты исследований антимикробной активности образцов раствора бриллиантового зеленого (1-6) в таблице №1 и графике №1 и раствора кислоты салициловой (1-6) в таблице №2 и графике №2.
Таблица 2 - Сравнительный анализ антимикробной активности 1% раствора бриллиантового зеленого в различных концентрациях этилового спирта (1-6)
№ Штаммы 1% раствор бриллиантового зеленого
п/п 1-обр. 2-обр. 3-обр. 4-обр. 5-обр. 6-обр.
40%- спирт. 50%- спирт. 60%- спирт. 70%- спирт. 80%- спирт. 90%- спирт.
1 S. aureus 14±0,1 14±0,1 15±0,1 16±0,1 15±0,1 15±0,1
2 Bacillus Subtilis 14±0,1 14±0,1 14±0,1 15±0,1 16±0,1 14±0,1
3 Escherichia coli 13±0,2 12±0,2 12±0,2 12±0,2 12±0,2 12±0,2
4 Candida 14±0,2 14±0,2 14±0,2 14±0,2 11±0,2 11±0,2
albicans
График 1 - Действие 1% спиртового раствора бриллиантового зеленого в различных концентрациях этилового спирта (1-6).
Таблица 3 - Сравнительный анализ антимикробной активности 1% раствора кислоты салициловой в различных концентрациях этилового спирта (1-6)
№ Штаммы 1% раствор кислоты салициловой
п/п 1-обр. 2-обр. 3-обр. 4-обр. 5-обр. 6-обр.
40%- спирт. 50%- спирт. 60%- спирт. 70%- спирт. 80%- спирт. 90%- спирт.
1 S. aureus 13±0,2 13±0,2 13±0,2 13±0,2 13±0,3 13±0,2
2 Bacillus Subtilis 13±0,3 13±0,3 13±0,3 13±0,3 13±0,3 13±0,3
3 Escherichia coli 12±0,2 12±0,2 12±0,2 12±0,2 12±0,2 12±0,2
4 Candida albicans 11±0,2 11±0,2 11±0,2 11±0,2 11±0,2 11±0,2
График 2 - Графическое изображение действие 1% спиртового раствора кислоты салициловой в различных концентрациях этилового спирта (1-6).
Таким образом, на основании биологических исследований спиртовых растворов бриллиантового зеленого и сравнивая данные таблицы №1 и графика №1 мы установили, что 1% раствор бриллиантового зеленого в малых и больших концентрациях этилового спирта показывает более низкую противомикробную активность, а в 60% и 70% спиртах - максимальную эффективность. Слабую активность бриллиантового зеленого мы объясняем их низкой растворимостью в разбавленных спиртах, а в крепких спиртах слабая активность бриллиантового зеленого объясняется тем
что в больших концентрациях этиловый спирт образует на поверхности ткани плотные гелифицированные пленки, мешающие достижению глубоких слоев эпидермиса, что уменьшает терапевтическую активность. Следовательно, оптимальную лечебную активность показывает бриллиантовый зеленый в 60% и 70% спиртовых растворах, так как при обработке кожи антисептический эффект наиболее выражен в этих концентрациях. В данном случае бриллиантовый зеленый и 60% и 70% спирт оказывают прямое синергетическое действие.
1% спиртовый раствор кислоты салициловой влияет на соответствующие штаммы бактерий с одинаковой активностью независимо от концентрации этилового спирта (40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%). Это показано в таблице №2 и графике №2. Такое действие кислоты связано с его растворимостью в разбавленных спиртах и полным распадом молекулы кислоты салициловой на ионы. Кроме того, спирт и кислота салициловая обладают раздражающим, противовоспалительным действиями. Таким образом, на основании проведения биологических исследований, доказана необходимость приготовления 1% раствора бриллиантового зеленого в 60%-70% спиртах, а для кислоты салициловой возможно использование этилового спирта любой концентрации. Приготовление 1% спиртового раствора кислоты
Таблица 4 - Образец композиционного препарата «Азисал»
салициловой в 40% этиловом спирте был бы более экономичным.
Продолжая исследования в указанной области в целях повышения лечебной эффективности лекарственной формы, нами разработан новый композиционный препарат, содержащий ,бриллиантового зеленого и кислоты салициловой в 70% этиловом спирте в целях определения противомикробной активности
комбинированного спиртового раствора под условным названием «Брисал» /8/.
Состав композиционного спиртового раствора «брисал» приведен в таблице №3, технологический процесс производства в таблице №4, а аппаратурная схема производства в схема №1.
№ серий Наименование компонентов № образцов
1 Ингредиенты
Бриллиантовый зеленый 1,0 г
Кислота салициловая 1,0 г
Спирт этиловый 70% до 100мл
Таблица 5 - Технологическая схема производства спиртового раствора композиционного препарата «Брисал»
вр.1.1
подготовка помещения, оборудования и персонала
вр.1
вспомогательная работа
вр.1.2
подготовка бриллиантового зеленого и кислоты салициловой
вр.1.3
Подготовка спирта 96% и воды очищенной
тп.1 получение 70% спирта
тп.2 приготовление спиртного раствора "Брисал"
стандартизация
умо.1 розлив во флаконы .-
готовая продукция
умо.1.1 фасовка
умо.1.2 упаковка
умо.1.3 маркировка
склад
ко нт ро ль
тп.1.1 разбавление 96% спирта с очищенной водой до 70% спирта.
тп.2.1 растворение смеси брил. зеленого и кис. салициловой в 70% спирте.
ко нт ро ль
ко нт ро ль
ВР - стадия вспомогательных работ
ТП - стадия технологического процесса
УМО - стадия упаковки, маркировки и отпуска на склад.
Схема 1 - Аппаратурная схема производства
Весы Реактор
Мотор электромешалки Емкость для спирта Емкость для очищенной воды Приемник
В соответствии с аппаратурной схемой производства (схема №1) для получения 70% этилового спирта в реактор (2) из емкости (4) наливаем рассчитанное количество 96% этилового спирта и рассчитанное количество воды очищенной из емкости (5). Расвор перемешивают несколько раз электромеханической мешалкой (3).
На весах (1) отвешивают предварительно мелко измельченный порошок 1кг бриллиантового зеленого и
Состав комбинированного препарата «Брисал»:
Бриллиантового зеленого 1,0 Кислоты салициловой 1,0 Спирта этилового 70 % до 100мл
1кг салициловой кислоты и загружают все в реактор (2). После этого включают электромеханическую мешалку (3) и перемешивают их до полного растворения. Затем раствор фильтруют. Получается раствор - зеленая прозрачная жидкость с запахом спирта. Затем их переливают во флаконы. Далее определяют биологическую активность нового композиционного спиртового препарата «Брисал».
Краткое описание антимикробного метода исследования препарата «Брисал»:
Изучение антимикробной актиности препарата «Брисал» проводилось по отношению к штаммам бактерий Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и дрожжевому грибу Candida albicans методом диффузии в агар (лунок). Исследуемые образцы растворяли в 96% этиловом спирте в концентрации
1мг/мл. культутру выращивали при температуре 370С в течение 18-24 часов. Культуру разводили в 0,9% растворе хлорида натрия, бактерии вносили по 1 мл в чашки с мясопептонным агаром, а кандиду - в среду Сабуро и засевали по методу получения «сплошного газона».
Таблица 6 - Антимикробная активность препарата «Брисал»
Формировали лунки диаметром 6 мм куда вносили препараты и 96% этиловый спирт в качестве контроля. Результаты исследований антимикробной активности препарата «Брисал» приведены в таблице 5.
№ шифр Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Candida albicans
«Брисал» №8 11,0±0,2 12,0±0,3 12,0±0,2 14,0±0,2
Комбинированного препарата «Брисал», сравнивая данные таблицы 5 и 6 установили, что комбинированный препарат «Брисал» проявляет максимальную эффективность, а по отношению к дрожжевым грибам
дополнительно проявляет кандидомикозное действие, что обусловлено синергизмом двух препаратов: Бриллиантового зеленого и кислоты салициловой.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Кияшев Д.К. Синтез на основе бриллиантового зеленого и приготовление его 1% спиртового раствора.//Вестник КазНМУ им. С. Д. Асфендиярова. - Алматы: 2006. - № 3. - C. 37-41.
2 Кияшев Д.К., Дильбарханов Р.Д. Способ получения бриллиантового зеленого.//Предварительный патент №1073. Национальное патентное ведомство РК, 5 сентября 1994 г.
3 Кияшев Д.К. Синтез и определение биологической активности производных тетрагидротиопирана, кислоты салициловой, триарилметана и приготовление на их основе лекарственных форм.//АО «КазГИС центр». - Алматы: 2011.192 c.
4 Кияшев М.Д. Определение биологической активности образцов 1% спиртового раствора бриллиантового зеленого и 1% спиртового раствора кислоты салициловой в спиртах различной концентрации.//Материалы международной научно-практической конференции «Фармация Казахстана». Интеграция науки, образования и производства. - Шымкент: 2009. - том №2. - C.331-333.
5 Кияшев М.Д., Батыралиева А.К., Ахметова С.Б., Кияшев Д.К. Приготовление раствора бриллиантового зеленого и раствора кислоты салициловой в спиртах различной концентрации и определение их биологической активности.//Вестник Киргизской гос.мед.академии им. А.К. Ахунбаева. - Бишкек: 2009. - № 1. - C. 182-186.
6 Кияшев М.Д. Разработка состава и технологии композиционного препарата «Брисал» на 70% этиловом спирте.//Вестник АЛИУВ. Материалы 1 Центрально-азиатского научного форума «Клиническая фармакология». Опыт, современное состояние, перспектива». - Алматы: 17 октября 2008. - №4. - Спец. Выпуск. - 99 c.
7 Кияшева А.К., Шакиев С.Ш., Юсупов Р.Р., Кияшев Д.К.// Фармацевтический бюллетень. - Алматы: 2010. - №9-10. - C.17-18.
8 Ахметова С.Б., Батыралиева А.К., Кияшев М.Д., Смагулов М.А., Кияшев Д.К. Определение биологической активности образцов (1-10) в 6 сериях спиртового раствора «Брисал».//Материалы научно-практической конференции «Фармация Казахстана». Интеграция наукиб образования и производства. - Шымкент: 2009. - Т.№2. - C. 274-276.
Туйш: Бриллиант жасылы жэне салицил ;ышк;ылы ын^айлы эдкпен синтезделдк 1% бриллиант жасылынын жэне салицил ;ышк;ылы ерiтiндiсiнiн микроб;а ;арсы белсендттне спирттщ эртYPлi концентрациясынын (40-90%) эсерi зерттелдк
M.D. KIYASHEV, G.M. PICHKHADZE, D.K. KIYASHEV
DETERMINATION OF ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF THE 1% SOLUTION OF SALICYLIC ACID, BRILLIANT GREEN IN DIFFERENT CONCENTRATIONS OF ALCOHOL (40-90%) AND COMPOSITE SOLUTION "BRISAL" AT 70% ALCOHOL
Resume: Diamond green and salicylic acid was synthesized by more convenient way. The effect of different concentrations of alcohol (40-90%) on the antimicrobial activity of 1% solution of brilliant green and salicylic acid was studied.
Inflammation is the body's reaction to a universal effect of various exogenous and endogenous factors damaging to which the agents of bacterial, viral and parasitic infections, as well as allergic, physical and chemical agents. They cause both local and systemic reactions. In the treatment of limited lesions of skin and mucous membranes better results can be achieved with less harmful to the body of antiseptics. This approach is more regular and more efficient because it makes possible to reduce the probability of increasing tolerance to antibiotic resistant strains of microorganisms, prolongs and enhances the antimicrobial activity of chemotherapeutic agents, leads to more efficient use of them and ultimately reduce the cost to search for antibiotics.
