CC BY
90
УДК 616.36-074
Э.Э. Кузнецова, В.Г. Горохова, А.Г. Горохов, A.A. Рунович
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ МОНООКСИГЕНАЗНОЙ
СИСТЕМЫ ПЕЧЕНИ
НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН (Иркутск)
Статья посвящена разработке экспрессного метода оценки функциональной активности моноок-сигеназной системы, печени с использованием, тонкослойной хроматографии, для. определения содержания антипирина в слюне. Достоинством, предлагаемого метода является, простота пробо-подготовки анализируемого образца, экономичность, экспрессность и. надежность. Он может, быть использован, для. оценки, детоксицирующей функции печени в клинической и. поликлинической практике.
Ключевые слова: печень, феоменты
DETERMINATION OF ACTIVITY OF FERMENTS OF MONOXYGENASE
SYSTEM OF LIVER
E.E. Kuznetsova, V.G. Gorokhova, A.G. Gorokhov, A.A. Runovich
SC RRS ESSC SB RAMS, Irkutsk
The article is devoted to working out of express method, of evaluation, of functional acitivity of monoxygenase system, of liver with the use of thin-layer chromatography for determination of antipyrin content in saliva. The advantage of described method, is simplicity of test sample preparation, economy, quickness and reliability. The method, may be used, for evaluation, of detoxicating function of liver in clinics and out-patient deperments. Key words: liver, enzime
Монооксигеназная ферментная система (МОС), локализованная в эндоплазматическом ретикулуме гепатоцитов, выполняет ряд важных функций, направленных на поддержание гомео-стаза. С участием МОС осуществляется метаболизм ряда эндогенных соединений (холестерина, желчных кислот, стероидных гормонов, тироксина, билирубина, ненасыщенных жирных кислот и других). Помимо этого, окисляя чужеродные соединения (лекарственные препараты, пестициды, гербициды, пищевые консерванты и др.) и превращая их в менее липофильные и легковыводи-мые из организма, биотрасформационная система печени осуществляет важнейшую защитную функцию организма [1, 3].
Существует ряд прямых и косвенных методов определения активности монооксигеназной системы. Поскольку цитохром Р-450 прочно связан с мембранами цитоплазматической сети, прямые методы предусматривают определение непосредственно в образцах ткани печени содержания ге-мопротеида и его каталической активности in vitro по отношению к различным субстратом. Наиболее доступными и приемлемыми являются непрямые методы, основанные на исследовании фармококи-нетики ряда модельных препаратов (антипирин, амидопирин, теофиллин, фенобарбитал и др.) [4].
Из всех перечисленных способов оценки активности ферментов МОС печени общее признание среди клиницистов и фармакологов приобрел антипириновый тест.
Основанием для использования антипирина (АП) в качестве индикатора активности МОС яв-
ляются: высокая биодоступность (97—100 %), равномерное распределение этого соединения и его метаболитов в органах, тканях и жидких средах, полное превращение в печени, незначительная элиминация почками в неизменном виде, низкая токсичность [4].
Антипириновый тест не зависит от кровотока и может быть использован при исследовании функции МОС у больных с нарушенной печеночной циркуляцией крови [9]. АП почти не экскретиру-ется с желчью, что позволяет применять этот тест при холестатических заболеваниях печени. На показатели АП теста не оказывает влияния и поражение почек [4].
Незначительное связывание антипирина с белками плазмы и тканей обусловливает близкие значения объема распределения препарата и его фар-макокинетические параметры элиминации при измерениях, производимых в различных биологических жидкостях — слюне и крови [3]. Поэтому в последние годы стали использовать слюну, т.к. эта процедура проста, удобна, безболезненна, отсутствует риск внесения инфекции.
Антипириновый тест основан на определении содержания АП в биологической жидкости в разные промежутки времени после его перорального применения в дозе 20 мг/кг с последующим расчетом периода полувыведения и клиренса препарата.
Для определения концентрации антипирина в биологических средах предложен ряд методов: спектрофотометрический, фотоколориметрический [6], газожидкостной, высокоэффективной жидкостной [2, 5] и тонкослойной хроматографии.
Нами разработана упрощенная и экспрессная методика количественного определения антипирина в слюне с использованием тонкослойной хроматографии.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Аппаратура: анализ АП — на пластинках марки «Сорбфил» ПТСХ-АФ-В. Реактивы: в работе использовали субстанцию АП, отвечающую требованиям НТД, уксусную кислоту (х.ч.), фосфорную кислоту (х.ч.), реактив Эрлиха (х.ч.), дистиллированную воду. Условия хроматографирования: состав подвижной фазы — уксусная кислота : вода (3:1).
Исследуемый образец слюны центрифугирует при 3000 об./мин в течение 10 мин. Полученный супернатант наносят вместе со стандартными растворами антипирина на хроматографическую пластину. В течение 2 — 3 мин выдерживают при 1 50 оС. Обрабатывают реагентом, содержащим реактив Эрлиха — ароматический альдегид в смеси уксусной и фосфорной кислот. Повторно выдерживают пластину при 1 50 оС в течение 2 — 3 мин. Антипирин проявляется на пластинах в виде четких окрашенных розовых пятен.
Содержание антипирина рассчитывают по площадям пятен пробы и стандарта. Время анализа составляет не более 30 мин.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Перечисленные выше методы определения антипирина многостадийны и длительны по времени. Существенным недостатком спектрографического и фотоколориметрического определения антипирина является необходимость химической модификации препарата при подготовке образца к анализу, зависимость интенсивности окраски анализируемого раствора от времени и температуры. Кроме того, данные способы не достаточно чувствительны и требуют больших затрат времени на выполнение. При газожидкостном хроматог-рафировании дополнительным отягощающим фактором служит использование высокой температуры. Все это приводит к нарушению воспроизводимости результатов и снижению точности количественного определения антипирина. Длительность анализа 1 — 1,5 часа.
Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии антипирина в слюне [2] требует использования дорогостоящего оборудования и реактивов. В работе [7] предлагается способ определения антипирина методом тонкослойной хроматографии. К недостаткам данного способа следует отнести многостадийность, использование летучих реагентов раздражающего действия — йод, ледяная уксусная кислота и длительность анализа (в пределах часа). Кроме этого, увлажнение хроматографической пластины после проявления в порах йода приводит к размыванию и нечеткой выраженности пятен на пластине, что сказывается на точности и чувствительность анализа.
Предлагаемый нами способ определения антипирина в слюне методом тонкослойной хроматографии лишен вышеперечисленных недостатков и закреплен патентом России [8].
Использование пластины марки «Сорбфил» дает возможность эффективно разделять анализируемые вещества — антипирин и его метаболиты, ускорить процесс хроматографирования и снизить стоимость анализа. Применение для элюиро-вания дистиллированной воды, модифицированной концентрированной уксусной кислоты, упрощает способ, сокращает время проведения анализа и делает его более экономичным. Проявления антипирина реагентом, представляющим собой реактив Эрлиха, растворенный в смеси уксусной и фосфорной кислот, позволяет получить устойчивое окрашивание пятен исследуемых веществ, которое не изменяется при длительном хранении. Все это позволяет увеличить чувствительность анализа и воспроизводимость результатов.
Разработанная методика была использована для изучения формакокинетики антипирина в слюне после его однократного приема в дозе 20 мг/кг и забора слюны через 24 часа. Всего было исследовано 25 доноров, 40 больных коронарным атеросклерозом, 10 пациентов с железодефицит-ной анемией, 8 — с миелоидным лейкозом, 10 — с хроническим гепатитом. Исследования проводились при поступлении в клинику и в процессе лечения.
Динамика изменения антипиринового теста представлена в табл. 1. Фармакокинетические па-
Таблица 1
Динамика фармакокинетических параметров антипирина
Группы больных При поступлении В процессе лечения
СМг (мл/мин) Т Уг час СМг (мл/мин) Т У час
ИБС 40,5 ± 0,6* 12,61 ± 0,7* 40,4 ± 0,6** 9,0 ± 0,4
Железодефицитная анемия 42,48 ± 1,2* 10,32 ± 0,6* 50,14 ± 0,9** 9,0 ± 0,5
Миелоидный лейкоз 42,0 ± 1,1* 10,9 ± 0,5* 46,32 ± 1,1 9,2 ± 0,6
Хронический гепатит 39,74 ± 0,9* 11,09 ± 0,3* 50,8 ± 1,3** 8,9 ± 0,7
Практически здоровые 52,5 ± 0,8 8,48 ± 0,3
Примечание: * - различия достоверны по сравнению с контролем, ** - различия достоверны по сравнению с исходными данными.
раметры АП в исходном состоянии больных достоверно отличались от показателей практически здоровых людей. Наиболее выражены эти изменения у пациентов с хроническим гепатитом и ишемической болезнью сердца (ИБС), что указывает на нарушение функционирования микросо-мальной системы гидроксилирования в гепатоци-тах. В процессе проведения лечения антипириновый тест выявил позитивные сдвиги в состоянии МОС у всех групп больных, однако наиболее существенными они были у пациентов с коронарным атеросклерозом и хроническим гепатитом.
Таким образом, разработанная методика экономична, экспрессна, надежна и удобна. Не требует использования дорогостоящего оборудования и растворителей. В настоящее время она нашла широкое применение в практике Областной клинической больницы, Городской детской клинической больницы с целью диагностики заболеваний печени и оценки эффективности проводимого лечения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Арчаков А.И. Микросомальное окисление / А.И. Арчаков. - М.: Наука, 1975. - 327 с.
2. Высокоэффективная жидкостная хроматография антипирина — метод экспресс-диагности-
ки функциональной активности монооксигеназ-ной системы печени человека / Т.В. Андреева, Э.Э. Кузнецова, В.Г. Горохова, А.Г. Горохов // Хим-фарм. журн. - 2001. - №1. - С. 10-11.
3. ЗаводникЛ.Б. Оценка монооксигеназной функции печени по кинетике антипирина и его метаболитов в жидких средах организма / Л.Б. За-водник, П.И. Лукиенко, М.И. Бушма // Фарм. и токсикол. - 1989. - Т. 52, № 3. - С. 95-101.
4. Горштейн Э.С. Антипириновый тест и его использование в клинике // Э.С. Горштейн, А.В. Семенюк, А.Я. Майоре. Успехи гепатологии. Рига, 1988. - Вып. 14. - С. 128-147.
5. Количественное определение антипирина и его метаболитов в моче методом микроколоночной ВЭЖК / И.А. Рахманов, А.В. Семенюк, Н.М. Слынь-ко и др. // Хим-фарм. журн. - 1989. - № 3. -С. 351-354.
6. Коренман И.М. Фотометрический анализ: Методы определения органических соединений / И.М. Коренман. - М., 1970. - 180 с.
7. Новый метод оценки функционального состояния печени в клинике внутренних болезней и при диспансеризации некоторых контингентов населения: Метод. рекомендации. - М., 1990. -25 с.
8. Патент РФ 2228527 (2004); БИ 2004. - № 13.
