CC BY
44
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН _____________________________________2013, том 56, №1_________________________________
БИОХИМИЯ
УДК 581.1:577.1
М.А.Бабаджанова, Ш.А.Эсаналиева, М.С.Нарзилоев
ОНТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ЗАВИСИМОСТЬ АКТИВИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ КИНЕТИНА IN VITRO НА ФОСФОРИБУЛОКИНАЗНУЮ АКТИВНОСТЬ МУЛЬТИФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА ЦИКЛА КАЛЬВИНА В ЭКСТРАКТАХ ИЗ ЛИСТЬЕВ ХЛОПЧАТНИКА
Таджикский национальный университет
(Представлено академиком АН Республики Таджикистан М.М.Якубовой 10.10.2012 г.)
Приведены результаты экспериментальных исследований в разные фазы развития растений хлопчатника влияния различных концентраций кинетина в реакционной среде на фосфорибулокиназ-ную активность мультиферментного комплекса. Установлена онтогенетическая зависи-мость активирующего действия in vitro концентрации кинетина на активность фосфорибулокиназы комплекса ферментов рибозофосфатизомеразы-фосфорибулокиназы (РФИ-ФРК).
Ключевые слова: Gossypium hirsutum - фосфорибулокиназная активность - мультиферментный комплекс - цикл Кальвина - кинетин.
К настоящему времени большим экспериментальным материалом доказано, что ферменты цикла Кальвина, как и ферменты других метаболических путей [1-3], образуют мультиферментные комплексы [4-7].
Из листьев хлопчатника выделен мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД, в состав которого входят пять ферментов - рибулозобисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа (РБФК/О, КФ 4.1.1.39), фосфорибулокиназа (ФРК, КФ 2.7.1.19), рибозофосфатизомераза (РФИ, КФ 5.3.1.6), гексокиназа (ГК, КФ 2.7.2.3), глицеральдегидфосфатдегидрогеназа (ГАФД, КФ 1.2.1.13) [5].
Ранее [8] нами были получены данные об активации кинетином in vitro активности одного из ключевых ферментов фотосинтеза - фосфорибулокиназы в экстрактах из листьев хлопчатника сорта 108-Ф, выделенных в фазу развития растений четыре-пять настоящих листьев. Возникает вопрос, сохраняется ли способность фосфорибулокиназы активироваться кинетином на других этапах онтогенеза и зависит ли активация фермента от концентрации кинетина?
В связи с вышеизложенным целью данной работы являлось исследование влияния различных концентраций кинетина при его добавлении в реакционную среду на активность фосфорибулокиназы в экстрактах из листьев хлопчатника сорта 108-Ф, выделенных в фазы развития растений - пять-шесть настоящих листьев, бутонизации и цветения.
Адрес для корреспонденции: Нарзилоев Махмадтоир Саидович. 734042, Республика Таджикистан, Душанбе, пр. Рудаки, 17, Таджикский национальный университет. E-mail: [email protected]
М е т о д ы и с с л е д о в а н и я
Получение экстракта из листьев хлопчатника. Листья были промыты дистиллированной водой, высушены фильтровальной бумагой, затем вырезались средние жилки. Листья охлаждали до 0°С и растирали в фарфоровой ступке с 0.1 М трис-HCI буфером, pH-8.5, содержащим 0.01 М MgC2, 0.0005 М ЭДТА, 0.01 М дитиотрейтола. Листья и буфер брали в соотношении 1:1.5. Полученный гомогенат отжимали через капроновую ткань, измеряли объём и pH, затем центрифугировали при 18000 об./мин на центрифуге К-24 на холоде в течение 40 мин. В 1 мл супернатанта определяли содержание белка и активность фосфорибулокиназы [S].
Определение содержания белка. Количественное содержание белка определяли с реактивом Бенедикта [9]. Измерения велись при длине волны 330 нм на высокочувствительном спектрофотометре ULTROSPEC II (LKB, Швеция) с полной шкалой от 0 до 0.001 экстинции.
Фосфорибулокиназную активность определяли по методу Гурвитца и др. [10].
Влияние различных концентраций кинетина в реакционной среде на фосфорибулокиназную активность определяли в присутствии рибозо-5-фосфата в качестве субстрата первого фермента, действующего в комплексе РФИ-ФРК.
Полученные результаты обработаны статистически [11]. Представленные данные достоверны при доверительной вероятности 97-99%.
Результаты и их обсуждение
В таблице приведены результаты определения при добавлении в реакционную среду различных концентраций кинетина фосфорибулокиназной активности мультиферментного комплекса в экстрактах из листьев хлопчатника, выделенных из растений в различных фазах их развития - в фазах пять-шесть настоящих листьев, бутонизации и цветения.
Как видно из представленных в таблице данных, в фазе развития пять-шесть настоящих листьев кинетин в концентрации 0.5 мкмоль/мл реакционной среды оказывал активирующее действие (20%) на активность фосфорибулокиназы в комплексе РФИ-ФРК. С увеличением концентрации ки-нетина в реакционной среде его активирующее действие на фосфорибулокиназную активность мультиферментного комплекса возрастало и достигло наибольшей величины - 73% при концентрации кинетина 3 мкмоль/мл реакционной среды.
Приведённые в таблице результаты свидетельствуют о том, что в фазе бутонизации кинетин в концентрациях 0.5-4 мкмоль/мл реакционной среды оказывал активирующее действие на активность фосфорибулокиназы мультиферментного комплекса. Наибольшее активирующее действие на фосфо-рибулокиназную активность мультиферментного комплекса достигалось при концентрации кинетина 3 мкмоль/мл реакционной среды. В сравнении с фазой развития растений пять-шесть настоящих листьев величины фосфорибулокиназной активности комплекса были выше при всех концентрациях кинетина.
Таблица
Влияние различных концентраций кинетина в реакционной среде на фосфорибулокиназную (ФРК) активность мультиферментного комплекса в экстрактах из листьев хлопчатника в различных фазах
развития растений (субстрат: рибозо-5-фосфат + АТФ)
Кинетин, мкмоль/мл реакционной среды Фазы развития растений
Пять-шесть настоящих листьев
Активность ФРК
в мкмоль РБФ/мин на 1 мг белка в %
- 18.3 ± 0.25 100
0.5 22.1 ± 0.32 120
1 24.4 ± 0.36 133
2 29.1 ± 0.37 137
3 31.8 ± 0.45 173
4 28.7 ± 0.44 157
5 20.6 ± 0.31 112
10 17.1 ± 0.26 -
15 14.1 ± 0.21 -
Кинетин, мкмоль/мл реакционной среды Бутонизация
Активность ФРК
в мкмоль РБФ/мин на 1 мг белка в %
- 20.4 ± 0.30 100
0.5 23.8 ± 0.35 117
1 25.7 ± 0.38 126
2 27.9 ± 0.41 136
3 38.9 ± 0.58 191
4 34.2 ± 0.50 167
5 21.4 ± 0.32 105
10 18.4 ± 0.27 -
15 14.3 ± 0.21 -
Кинетин, мкмоль/мл реакционной среды Цветение
Активность ФРК
в мкмоль РБФ/мин на 1 мг белка в %
- 21.2 ± 0.32 100
0.5 30.5 ± 0.46 143
1 30.8 ± 0.46 145
2 31.4 ± 0.47 148
3 40.1 ± 0.60 189
4 38.6 ± 0.58 182
5 38.2 ± 0.57 180
10 19.3 ± 0.29 -
15 15.5 ± 0.23 -
Из представленных в таблице данных видно, что в фазу цветения при концентрациях
0.5-5 мкмоль/мл реакционной среды возрастала фосфорибулокиназная активность мультиферментного комплекса.
В сравнении с фазой развития растений пять-шесть настоящих листьев и бутонизации растений в фазу цветения фосфорибулокиназная активность мультиферментного комплекса уже при концентрации 0.5 мкмоль/мл реакционной среды возрастала на 43%, а при концентрации кинетина 5 мкмоль/мл реакционной среды - на 80%.
Таким образом, в онтогенезе растений хлопчатника исследовано влияние различных концентраций кинетина в реакционной среде на фосфорибулокиназную активность мультиферментного
комплекса РФИ-ФРК. Установлено, что в сравнении с фазами пять-шесть настоящих листьев и массовой бутонизации в фазу цветения повышение фосфорибулокиназной активности мультифермент-ных комплексов происходит при более высоких концентрациях кинетина.
Полученные результаты подтверждают данные других авторов [12] о том, что в процессе формирования репродуктивных органов и цветения фитогормоны выполняют двойную нагрузку, регулируя процессы развития не только вегетативных, но и репродуктивных органов, для чего необходимо большая их концентрация.
Таким образом, действие кинетина на фосфорибулокиназную активность зависет от концентрации гормона и фазы развития растений.
Поступило 10.10.2012 г.
ЛИТЕРАТУРА
1. Фридрих П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные комплексы. - М.: Мир, 1986, 374 с.
2. Курганов В.И., Любарев А.Е. - Биохимия, 1991, т.56, с.19-32.
3. Ермаков Г.Л. - Биохимия, 1993, т.38, с.659-674.
4. Романова А.К., Павловец В.В. - Физ. раст., 1997, т.44, с.264-274.
5. Бабаджанова М.А., Бакаева Н.П., Бабаджанова М.П. - Физ. раст., 2000, т.47, с.27-36.
6. Gontero B., Lebreton S., Graciet E. - Annu. Plant Reviewsro - New York: Sheffield Academic Press, 2002, pp.120-150.
7. Бабаджанова М.П., Бабаджанова М.А., Алиев К.А. - Физ. раст., 2006, т.53, с.38-44.
8. Бабаджанова М.А., Мирзорахимов А.К., Нарзилоев М.С., Эсаналиева Ш.А., Ниматова Н.Н., Сай-фудинов А.К. - ДАН РТ, 2007, т.50, №4, с.382-385.
9. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. - М.: Высш. шк., 1980, 272 с.
10. Романова А.К. Биохимические методы изучения автотрофии у микроорганизмов. - М.: Наука, 1980, 158 с.
11. Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высш. шк., 1990, 352 с.
12. Абзалов А.А., Наджимов Ч.К. - Генетические аспекты роста и развития растений хлопчатника. -Кишинев: Штиница, 1985, с.5-10.
М.А.Бобочонова, Ш.А.Эсаналиева, М.С.Нарзилоев ВОБАСТАГИИ ОНТОГЕНЕТИКИИ ТАЪСИРИ ФАЪОЛГАРДОНАНДАИ КИНЕТИН IN VITRO БА ФАЪОЛНОКИИ ФОСФОРИБУЛОКИНАЗИИ МАЧ,МУАИ МУЛТИФЕРМЕНТИИ СИКЛИ КАЛВИН ДАР ШИРАИ АЗ БАРГХ,ОИ ПАХТА ЧУДОКАРДАШУДА
Донишго^и миллии Тоцикистон
Натичах,ои тадкдкотх,ои илмй доир ба таъсири микдорх,ои гуногуни кинетин дар мухдти реаксионй ба фаъолнокии фосфорибулокиназии мачмуаи мултиферментии сикли Калвин дар даврах,ои гуногуни инкишофёбии растаних,о оварда шудаанд. Вобастагии онтогенетикии таъси-
ри фаъолгардонандаи микдорх,ои гуногуни кинетин in vitro ба фаъолнокии фосфорибулокиназии мачмуаи ферментх,ои РФИ-ФРК муайян карда шудааст.
Калима^ои калиди: Gossypium hirsutum - фаъолнокии фосфорибулокинази - мацмуаи
мултиферменти - сикли Калвин - кинетин.
M.A.Babadzhanova, Sh.A.Esanalieva, M.S.Narziloev ONTOGENETIC DEPENDENCE THE ACTIVATING EFFECT OF KINETIN IN VITRO ACTIVITY OF FOSFORIBULOKINASE CALVIN CYCLE MULTIENZYME COMPLEXES IN EXTRACTS FROM LEAVES OF COTTON
Tajik National University The results of long-term experimental studies on the various phases of plant growth effects of different concentrations of kinetin in the reaction medium to fosforibulokinase active multienzyme complex. Established developmental dependence activating effect in vitro on the activity concentration of kinetin fosforibulokinase enzyme complex RFI-PRK.
Key words: Gossypium hirsutum - fosforibulokinase activity - multienzyme complex - Calvin cycle - kinetin.
