CC BY
104
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Т. А. Краснова, Н. Н. Клепиков, Н. А. Харьковская, Л. Я. Шевякова, С. А. Хрусталев
ОНКОЛОГИЧЕСКАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЫШЕЙ -ГИБРИДОВ ПЕРВОГО ПОКОЛЕНИЯ (СВА х С57ВЬ/6) Е1
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Представлена онкологическая и генетическая характеристика мышей — гибридов первого поколения F1 (CBA/CaLacSto х C57BL/6JSto). Двести мышей обоего пола были под наблюдением до естественной смерти. Павших и забитых в агональном состоянии животных подвергали патологоанатомическому исследованию. Общая частота обнаружения спонтанных новообразований составила 86,5%. Преобладали множественные злокачественные опухоли. Морфологически чаще всего вывлялись гепатомы (62,4%), гемобластозы (60,1%), опухоли легких (14,5%) и рак молочной железы (11,0%). При исследовании различных морфологических, иммуногенетических, онкологических и биохимических маркеров установлена гомозиготность и стандартность родительских линий CBA/CaLacSto и C57BL/6Jsto по всем 20 локусам 11 исследованных хромосом, а также идентичность и стандартность гибридов первого поколения по всем исследованным локусам, характеризующимся кодоминантным наследованием.
Ключевые слова: линейные мыши, спонтанные опухоли, генетическая характеристика.
В настоящее время мыши — гибриды F1 (CBA х C57BL/6) широко используются в исследованиях по лучевому и химическому канцерогенезу, экспериментальном изучении эффективности противоопухолевых препаратов, а также в решении целого ряда проблем онкологии. Поскольку гибриды первого поколения F1 являются производными от скрещивания животных двух инбредных линий, они генетически однородны, но гетерозиготны по генам исходных родительских пар. Наследуя генетические свойства обоих родителей, гибриды F1 проявляют при этом более высокую резистентность к неблагоприятным условиям внешней среды, что особенно имеет значение при постановке хронических экспериментов, требующих длительного наблюдения за животными.
Сведения об онкологической характеристике мышей — гибридов F1 (CBA х C57BL/6) в литературе практически отсутствуют и лишь в отдельных работах встречаются в виде описания опухолей у животных контрольных групп [1; 3; 4]. В связи с этим представляется интересным не только получить собственные данные по этому вопросу, но и сопоставить их с ранее полученными сведениями об онкологической характеристике мышей родительских пар.
© Краснова Т. А., Клепиков Н. Н., Харьковская Н. А., Шевякова Л. Я., Хрусталев С. А., 2005 УДК 616-006-092.9: 575.22
Вработе использовано 100 самок и 100 самцов мышей — гибридов F1 (CBA/CaLacSto х C57BL/6JSto), полученных из питомника «Столбовая» и содержавшихся на стандартной диете (брикет № ПК-121) до естественной гибели. Мыши находились под наблюдением в течение всей своей жизни и подвергались систематическому клиническому и гематологическому обследованию. Павших и забитых в агональном состоянии животных подвергали патологоанатомическому исследованию. Проводилось гистологическое исследование тимуса, селезенки, легких, печени, почек, увеличенных периферических лимфатических узлов, а также измененных органов и тканей. Биоптаты предварительно фиксировали в 10% растворе формалина, заливали в парафин и готовили препараты, которые затем окрашивали гематоксилином и эозином. Параллельно исследовали мазки периферической крови, отпечатки с различных внутренних органов и цитограммы лимфатических узлов, селезенки и костного мозга, которые фиксировали в метаноле и окрашивали по Романовскому—Гимзе и Лейшману.
Поскольку гибриды первого поколения (CBA/CaLacSto х C57BL/6JSto) являются потомками от скрещивания двух инбредных линий CBA/CaLacSto и C57Bl/6JSto, их генетический профиль и стандартность определяется генетическим профилем, стандартностью и гомозиготностью родительских линий. Поэтому для определения стандартности гибридов F1 изучался генетический профиль мышей линий CBA/CaLacSto и C57Bl/6JSto. Генетический профиль и гомозиготность мы-
шей определяли, анализируя морфологические, иммуногене-тические, онкологические и биохимические маркеры. Изучали аллели 20 локусов, локализованных в 11 хромосомах. Исследовали следующие гены: a — неагути, черная окраска шерсти, Ь — коричневая окраска шерсти, d — разбавленная окраска шерсти, p — розовые глаза, светлая окраска шерсти, s — пегая окраска шерсти. Гены выявляли с помощью гибридологического анализа с использованием линий мышей-анализаторов [2]. Аллели локуса Fv-2, контролирующего чувствительность мышей к вирусам лейкоза Френд и Раушера, определяли по известной методике [8]. Антигены MHC класса I, контролируемые локусами H-2K и H-2D, а также 1Ьу-1 (антиген клеток тимуса 1) определяли с помощью цитотокси-ческого теста [5]. Аллели локусов Es-1 (эстераза-1), Gpi-1 (глюкозо-6-фосфатизомераза 1), №Ь (Р-цепь гемоглобина), Ldr-1 (регулятор лактатдегидрогеназы 1), Mup-1 (основной белок мочи 1), Pgm-1 (фосфоглюкомутаза 1), Pre-1 (компонент 1 преальбумина), Pre-2 (компонент 2 преальбумина), Trf (трансферрин) определяли с помощью электрофореза в крахмальном и полиакриламидном гелях [9; 11].
Полученные данные свидетельствуют о том, что мыши родительских линий CBA/CaLacSto и C57BL/6Jsto являются генетически однородными и гомозиготными по всем 20 изученным локусам 11 хромосом, что позволяет считать гибридов F1 генетически стандартными. С целью генетической идентификации гибридов F1, используемых в настоящей работе, определяли аллели, контролирующие полиморфные формы белков и изоферменты и характеризующиеся кодоминант-ным наследованием, а также антигены MHC класса I, по которым различались родительские линии (табл. 1). Гибриды F1 были гетерозиготны по всем изученным аллелям, что свидетельствует об их генетической идентичности и стандартности.
Как показало клиническое наблюдение, продолжительность жизни мышей составила от 9,5 до 36 мес. При этом у животных в возрасте до 12 мес основными причинами гибели являлись пневмония и нефриты, а в более старшем возрасте — опухоли. Срок появления первой опухоли — 9,5 мес — пережили все подопытные животные. До возраста 12 мес пало 4 мыши (у 2 из них имелись опухоли), в возрасте 12—18 мес — 12 (у 4 были опухоли), в возрасте 18—24 мес — 36 (у 32 были опухоли), в возрасте 24—30 мес — 124 (у 115 были опухоли), в возрасте 30—36 мес — 24 (у 16 были опухоли). Новообразования были диагностированы в общей сложности у 173 мышей, т. е. у 86,5% обследованных животных. При этом у большинства из них (73,4%) наблюдались множественные злокачественные новообразования разных локализации и гистогенеза. Чаще всего обнаруживались опухоли печени. Они были диагностированы у 108 мышей, что составило 62,4% животных с новообразованиями (табл. 2). Большинство из них было представлено высокодифференцированными гепато-карциномами, у 7 животных обнаружены гепатобластомы.
Спонтанные гемобластозы были выявлены у 104 из 200 обследованных животных, т. е. у 60,1% мышей с новообразованиями. Клинически заболевание проявлялось, как правило, увеличением различных групп периферических лимфатических узлов или селезенки. Показатели периферической крови при этом не имели прогностического значения. При локализованной форме лимфосаркомы (51 животное) чаще всего наблюдалось поражение селезенки и мезентериальных лимфатических узлов, реже тимуса. Генерализованная форма сопровождалась тотальным замещением периферических лимфатических узлов и лимфатических узлов брюшной полости опухолью, поражением печени, селезенки, почек, легких
и кишечника. Вовлечение в процесс костного мозга имело место лишь у четверти животных с генерализированной лимфо-саркомой. Морфологически среди спонтанных лимфосарком преобладали лимфобластные и пролимфоцитарные опухоли.
Значительно реже, у 25 мышей — гибридов F1, были диагностированы опухоли легкого (14,5% животных с новообразованиями). Чаще всего они имели тубулярное строение. При этом аденомы (20 животных) существенно преобладали над карциномами (5 животных).
Среди спонтанных опухолей других локализаций необходимо отметить рак молочной железы (22 мыши, 12,7% животных с новообразованиями). Эти опухоли имели, как правило, смешанное строение с заметным преобладанием солидного. Почти у трети мышей, больных раком молочной железы, отмечены метастазы в легких.
Опухоли жировой ткани были только доброкачественными: в 8 случаях выявлены липомы и еще в 1 — фибролипома.
Таблица 1
Генетический профиль мышей родительских линий CBA/CaLacSto, C57BL/6JSto и гибридов F1 (CBA х C57BL/6)
№ хромосо- мы Локус Мыши линии CBA/ CaLacSto Мыши линии C57Bl/ 6^Ш Гибриды Р1
2 a + a —
3 Car-2 a a —
4 Mup-1 a Ь ab
4 Ь + + —
5 Pgm-1 Ь a ba
6 Ldr- Ь a ba
7 Gpi-1 ь Ь —
7 P + + —
7 c + + —
7 Hbb d s ds
8 Es-1 Ь a ba
9 ^-1 Ь Ь —
9 d + + —
9 Ш a Ь ab
9 Fv-2 s г —
12 Pre-1 o o —
12 Pre-2 Ь Ь —
14 s + + —
17 H-2K k Ь kb
17 H-2D k Ь kb
Таблица 2
Локализация и морфологическая характеристика спонтанных опухолей у мышей гибридов F1 (CBA х C57BL/6)
Локализация Морфологическая Число мышей с опухолями
характеристика самцы самки
Гепатокарцинома 75 16
Печень Гепатоаденома 7 3
Гепатобластома 7 —
Локализованная 23 28
лимфосаркома
Кроветворная система
Генерализованная 11 42
лимфосаркома
Аденома 15 5
Легкое
Рак 3 2
Молочная железа Рак — 22
Липома — 8
Жировая ткань
Фибролипома — 1
Гемангиоэндотелиома 5 1
Сосуды
Кавернозная ангиома 1 1
Кишечник Фиброма 1 2
Рак — 1
Матка
Лейомиома — 1
Поджелудочная железа Рак — 1
Почка Аденома 1 —
Спонтанные новообразования других гистологических типов и локализации были представлены в единичных случаях.
Анализ полученных результатов позволил выявить особенности спонтанного канцерогенеза у самцов и самок мышей — гибридов F1 (CBA х C57BL/6). Прежде всего это касается заболеваемости опухолями печени, частота которых у самцов (89 животных) более чем в 4 раза превышала таковую у самок (19 животных). Кроме того, у самцов по сравнению с самками гораздо чаще диагностировали спонтанные опухоли легкого (20 по сравнению с 5 животными). В то же время у самок в 2 раза чаще встречались гемобластозы (70 по сравнению с 34 животными).
Результаты проведенного исследования позволяют говорить о довольно высокой частоте спонтанных опухолей у мышей — гибридов F1 (CBA х C57BL/6): 86,5%. При этом спонтанные опухоли, представленные главным образом новообразованиями печени и лимфосаркомами, диагностировали преимущественно у животных старше 2 лет (75%). Полученные нами данные существенно отличаются от результатов единичных ранее опубликованных сообщений. По их данным, спонтанные опухоли отмечаются преимущественно у животных контрольных групп в возрасте до 2 лет.
Причиной этого могут служить сублинейные различия родительских пар обследованных животных. Возможны также изменения в онкологической характеристике этих пар, которые могут происходить в процессе длительного инбридинга [1; 10]. По нашим данным, мыши линии CBA за время своего существования превратились в высокогепатом-ную линию, а у мышей линии C57BL/6, считавшейся ранее резистентной к спонтанным опухолям, уровень спонтанного канцерогенеза в настоящее время достигает 33% [6; 7].
Необходимо отметить, что частота и морфологическая характеристика спонтанных новообразований у обследованных мышей — гибридов первого поколения имеют как существенное сходство с таковой у мышей родительских пар, так и целый ряд особенностей, отсутствующих у родителей. Так, с мышами линии CBA их сближает высокая частота спонтанных новообразований (74,5% у CBA и 86,5% у F1) и преобладание среди них опухолей печени. В то же время у гибридов отмечается высокая частота лимфосарком, которая характерна для мышей другой родительской линии C57BL/6. Такие новообразования, как рак молочной железы и опухоли легкого, у мышей — гибридов первого поколения встречались в 10—15 раз чаще, чем у родительских линий. Возможно, что
Эксmрuмeнтальныe uсслeдованш
сходство в онкологической характеристике мышей-гибридов и их родителей обусловлено доминантными генами, контролирующими развитие опухолей, в то время как выявленные различия могут быть результатом взаимодействия аллелей мышей родительских линий.
В заключение необходимо подчеркнуть тот факт, что для мышей — гибридов первого поколения свойственна довольно высокая устойчивость к неблагоприятным условиям внешней среды. Это наряду с их генетической однородностью и проявлениями спонтанного канцерогенеза у старых животных делает их удобной экспериментальной моделью.
ЛИТЕРА ТУРА
1. Бландова З. К., Душкин В. А., Малашенко А. М. и др. Линии лабораторных животных для медико-биологических исследований. — М., 1983. — 190 с.
2. Клепиков Н. Н., Шурыгина Т. Н., Семова Н. Ю. и др. Разработка системы генетического мониторинга для идентификации и генетической стандартизации мышей инбредных линий // Актуальные вопросы стандартизации лабораторных животных для медикобиологических исследований. — М., 1988. — С. 78—82.
3. Крутовских В. А. О чувствительности мышей различных линий к канцерогенному действию 1-2 диметилгидрозина // Вопр. он-кол. — 1980. — Т. 26, №4. — С. 93—98.
4. Никонова Т. В. Частота спонтанных опухолей у мышей самок гибридов F1 (CBA x C57BL/6) // Актуальные вопросы стандартизации лабораторных животных для медико-биологических исследований. — М., 1988. — С. 106—108.
5. Фатман К. Получение мышиных антисывороток к антигенам гистосовместимости // Методы исследований в иммунологии. — М., 1981. — С. 219—229.
6. Харьковская Н. А., Клепиков Н. Н., Краснова Т. А. и др. Генетическая и онкологическая характеристика мышей линии CBA/CaLacSto // Экспер. онкол.— 1989.— Т. 11, №4. — С. 29—33.
7. Харьковская Н.А., Хрусталев С. А. Онкологическая характеристика мышей линии C57BL/6 // Экспер. онкол. — 1985. — Т. 7, №4. — С. 45—49.
8. AxelradA. A., Stelves K. A. Assay for Friend leukemia virus: Rapid quantitative method based on enumeration of macroscopic spleen foci in mice // Virology. — 1964. — Vol. 24, N 3. — P. 513—518.
9. Green A. Identification and Genetic monitoring of mouse inbred strains using biochemical polimorphisms // Lab. animals. — 1977. — Vol. 11. — P. 209—214.
10. Staats J. Standartized nomenclature for inbred strains of mice: seventh listing // Cancer Res. — 1980. — Vol. 40. — P. 2083—2128.
11. Wilcox F. N. Genetic variation in Plasma Prealbumin of House Mouse // J. Hered. — 1975. — Vol. 66. — P. 19—22.
Поступила 19.05.2003
T. A. Krasnova, N. N. Klepikov, N. A. Kharkovskaya, L. Ya. Shevyakova, S. A. Khrustalev
ONCOLOGICAL AND GENETIC CHARACTERIZATION OF FIRST GENERATION HYBRID MICE (CBA x C57BL/6) F1
N. N. Blokhin RCRC RAMS, Moscow
The paper presents oncological and genetic characterization of first generation hybrid mice (CBA/CaLacSto x C57BL/6JSto) F1. Two hundred mice of both genders were under follow-up until natural death. Pathology study was performed in dead and sacrificed animals. Total rate of spontaneous neoplasms was 86.5%. Multiple carcinomas were predominating. Most frequent morphological types were hepatoma (62.4%), hematology malignancy (60.1%), lung tumor (14.5%) and breast cancer (11.0%). Study of a variety of morphological, immunogenetic, oncological and biochemical markers discovered parent lines CBA/CaLacSto and C57BL/6Jsto to be homozygous and standard by all 20 locuses of 11 chromosomes studied as well as the first generation hybrids to be identical and standard in all codominant heredity locuses studied.
Key words: linear mice, spontaneous tumors, genetic characterization.
б
