Онкоиммунология Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Медицинская Иммунология 2002, Т. 4, №2 © 2002, СПб РО РААКИ

ОНКОИММУНОЛОГИЯ

ИММУНО-ГОРМОНАЛЬНЫЕ ПАРАЛЛЕЛИ ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Арзуманов А.С.. Шутко А.Н., Шатинина Н.Н., Екимова Л.П.

Центральный научно-исследовательский рентгено-радиологический институт, Санкт-Петербург, Россия

Наличие (или отсутствие) рецепторов к эстрогенам (Эр) к прогестерону (Пр) - вероятностный фактор, влияющий на выбор тактики лечения рака молочной железы. Роль иммунологического статуса пациентов с РМЖ до начала лечения менее определенна [Моиссенко В.М., Семиглазов В.Ф., и Тю-ляндин С.А., 1997]. При других солидных новообразованиях (рак почки, яичников) учет лимфопоэтического статуса пациентов весьма эффективен как для надежного прогноза, так и для улучшения результатов лечения [Гранов А.М., Шутко А.Н., 2002].

Целью настоящей работы явилось выявление возможных взаимосвязей между состоянием лимфопоэза, степенью распространенности и гормональной чувствительностью первичного рака молочной железы (РМЖ).

Методика. Обследовано 30 первичных больных с РМЖ Т,4,N|12,M стадиями. Лимфопоэтический статус (ЛС) определяли по субпопуляционному составу мононуклеаров периферической крови (CD2\ CD8", 11 b+: CD2P; TdT*; моноциты) и классифицировали его как квазинормальный (Н), форсированный (Ф), и истощенный (И) относительно среднестатистических значений донорского диапазона [Shoutko et al.,2000], Гормоно(не)зависимость: Эр+ и/или Пр+ (Эр и Пр ) - выявляли с помощью DAKO LSAB2 Kit цитоиммуио-химичсским методом на гистологических срезах с предварительно манифиетированными зонами злокачественных клеток. Статистическая обработка - “хи”-квадрат, ;-крите-рий.

Результаты. В обследованной группе по сравнению с донорами увеличено представительство лиц с И-типом ЛС (50%, р=0,05). И-тип ЛС при РМЖ сопряжен с наиболее продвинутыми стадиями (элементы T(,N,TNM классификации). Представительство их в субгрунпе с И-типом ЛС 67%, р=0,028.

В субгруппе РМЖ с Н-типом ЛС преобладали пациенты с гормонозависимыми вариантами РМЖ Эр* или Пр+(55%), тогда как в среди пациентов с аномальными типами ЛС(И+Ф) было обнаружено всего 17% гормонозависимых случаев (р=0,038).

В то же время гормонозависимость РМЖ (Эр+ и/или Пр+) встречалась в 70% случаев при распространении N , в 36% случаев с распространением N^=0,024) и всего в 19% - при распространении N,(p=0,0011).

Заключение. Сопоставление полученных данных показывает, что совместный учет ЛС (И - Н,Ф) и распространенности (N(1- N^N,) позволяет осуществлять косвенное экспрссс-определение показаний к гормональной терапии РМЖ.

РОЛЬ ИММУНОАДОПТИВНОЙ ТЕРАПИИ В ЛЕЧЕНИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Афанасьев Б.В.. Михайлова Н.Б., Зубаровскан Л.С., Зарицкий А.Ю.

Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет им. акад. И.П.Павчова, Центр гематологии, отделение ТКМ, Санкт-Петербург, Россия

До последнего времени аллогенная трансплантация костного мозга, как метод лечения гематологических и онкологических заболеваний, предполагала использование высокодозной мислоаблативной терапии, которая сопровождается серьезными ранними и поздними токсическими осложнениями. У части больных проведение такой терапии затруднительно из-за пожилого возраста, наличия сопутствующих соматических заболеваний, статуса Карновского <60%, прогрессии или резистентности основного заболевания или осложнений, вызванных предшествующей полихимиотсрапией (ПХТ). Предполагается, что при ал-логенной трансплантации гемопоэтичсских клеток гибель злокачественного клеточного клона происходит не столько в результате тумороцидиого действия цитостагиков и/или гамма-облу-чения, сколько за счет индуцирования иммуно-опосредованного противоопухолевого эффекта, связанного с распознованием минорных тканевых антигенов, а также специфических опухолевых пептидов, т.е. с реакцией “трансплаитат-иротив-лейкоза/лим-фомы/опухоли”(Horowitz ММ ctal, 1990, Slavin Set al, 1990).Ус-пешная реиндукция ремиссий посредством переливания донорских лимфоцитов у больных с рецидивами ХМЛ и острого мие-лобластного лейкоза (ОМЛ) после аллоТКМ подтверждает этот биологический механизм действия аллотрансплантатов(Ко1Ь HJ et al, 1993, Collins RH et al, 1997). Эта предпосылка позволила использовать у ряда больных трансплантацию гемопоэтических клеток в сочетании с немиелоаблативными режимами кондиционирования. Термин “немиелоаблативный” подразумевает использование цитостатичсских агентов в дозах, не вызывающих необратимой миелодепрессии. При этом отдается предпочтение препаратам с наиболее выраженным иммуносупрессивным действием, чтобы обеспечить лучшее приживление трансплантата, таким как флюдарабин, кладрибин, циклофосфан, тиотепа, небольшие дозы тотального облучения (200 рад) или облучение тимуса, антилимфоцитарный глобулин. Первые работы показали, что такой метод лечения имеет ряд преимуществ: минимальная токсичность, более короткий период цитопении, лучшая устойчивость к инфекциям, более быстрое восстановление иммунитета, минимальная РТПХ в раннем посттрансплантационном периоде, возможность амбулаторного лечения, меньшая стоимость, рецидив может быть прекращен введением донорских лимфоцитов. С другой стороны, частота рецидивов велика, особенно в случаях резистентности. Наилучшие результаты могут быть получены у больных с ожидаемой длительностью жизни в несколько месяцев, так как именно в эти сроки начинают работать иммунологические механизмы. В настоящее время имму-ноадоптивная терапия используется при лечении гемобластозов у ослабленных и пожилых больных, при лечении резистентных лимфом, особенно лимфогранулематоза, при распространенных

формах некоторых солидных опухолей (рак почки, молочной железы, меланомы). На отделении ТКМ немиелоаблативные режимы кондиционирования были использованы у 7 больных, из них 3 пациентам дополнительно проводили переливания донорских лимфоцитов. Еще 1 больной получил трансфузию донорских лимфоцитов в связи с рецидивом лейкоза после неродственной трансплантации с миелоаблативным режимом кондиционирования. У трех больных был ОМЛ, у 1 больного - МДС, у 1 больного - гиперэозинофильный синдром, у 2 - солидные опухоли. У всех больных, за исключением 1 пациентки с ОМЛ, наблюдалась профессия заболевания на момент ТКМ. У 2 больных были использованы СКПК неродственных доноров. У 6 больных наблюдалось быстрое приживление с 100% химериз-мом на 21 день после ТКМ. У одного больного с выраженным миелофиброзом восстановление гемопоэза носило замедленный характер. У трех больных был рецидив заболевания. Острая РТПХ 1-11 ст. наблюдалась у двух больных, хроническая РТПХ-у 1 больного. Степень иммуносупрессии в посггрансплантаци-онном периоде была выраженная, о чем свидстельсвовало наличие сепсиса у двух больных и ЦМВ - инфекция, также, у двух больных. В настоящее время не выработаны четкие показания по использованию иммуноадоптивной терапии. Необходим больший опыт для определения места этого вида терапии в структуре лечения злокачественных заболеваний.

ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ИММУННОГО ОТВЕТА ПРИ МЕЛАНОМЕ

Балдуева И.А.

Научно-исследовательский институт онкологии им. проф. Н.Н. Петрова М3 РФ,

Санкт-Петербург, Россия

В последние годы благодаря успехам, достигнутым в области иммунологии и молекулярной биологии, и широкому использованию современных методов исследования эволюционировали представления о взаимоотношении опухоли и организма при меланоме. С помощью моноклональных антител и техники клонирования цитотоксических Т-лимфоцитов удалось идентифицировать большое число онухолсассоциированных антигенов, экспрессируемых на клетках меланомы. Анализ экспрессии антигенов главного комплекса гистосовмсстимости

- НЬА-антигенов с использованием полимеразной цепной реакции (ЯТ-РСЯ) и моноклональных антител позволил выявить их антигенную альтерацию и различную степень утраты. Им-муногенетические исследования экспрессии опухолеассоциированных антигенов специализированными клетками иммунной системы опухоленосителя привели к интенсивному развитию современной активной специфической иммунотерапии.

Специфический ответ цитотоксических Т-лимфоцитов па опухолеассоциированные антигены обеспечивает накопление в организме клона клеток-эффекторов с наиболее выраженным потенциалом противоопухолевой цитотоксической активности и способностью мигрировать к опухоли. Вместе с тем далеко не все опухолеассоциированные антигены проявляют им-муногенность, достаточную для формирования специфического клона цитотоксических Т-лимфоцитов. Ограничением возможностей клеточного иммунного ответа служит также необходимость комплсксирования антигенных пептидов с молекулами НЬА I класса для распознавания их Т-клсточными рецепторами цитотоксических Т-лимфоцитов. Наиболее очевидным механизмом, посредством которого опухолевые клетки с тановятся резистентными к воздействию цитотоксических Т-лим-фоцитов, является потеря ими экспрессии НЬА-молекул.

Утрата экспрессии HLA молекул часто наблюдается в злокачественных опухолях (Garrido F. et al., 1995; Momburg F. et al., 1989). Полная потеря многократно была обнаружена на секционном материале при помощи моноклональных антител, распознающих неполиморфные детерминанты HLA I класса. Сложнее установить потерю гаплотипов или аллелей, но, для примера, исследование с анти-НЬА-А2 выявило, что частичная потеря HLA-молекул является достаточно частым явлением (Cabrera Т. et al., 1996; Kageshita Т. et al., 1993). Утрату экспрессии HLA-молекул на опухолевых клетках обычно связывают с иммуносе-лскцией и идентификация клонов цитотоксических Т-лимфоцитов, для которых они становятся мишенью, подтверждает эту концепцию. Высокое соотношение опухолей с частичной или полной утратой HLA-молекул обусловлено тем, что иммунная система наиболее активно противостоит возникновению клеток, атипичных для данного организма. Однако к этим предположениям надо относиться с осторожностью, так как, несмотря на высокую частоту феномена потери HLA-молскул на опухолевых клетках, многие авторы, тем не менее, получают длительные ремиссии с помощью стимуляции опухоль - специфических цитотоксических Т-лимфоцитов in vivo. Важно, что полная утрата HLA-молекул обычно ассоциируется с дефектом Р,-микро-глобулина или с транспортом антигенных пептидов (ТАР) на поверхность клетки (В. Seliger el al, 2000).

Вместе с тем дефекты (3,-микроглобулина не всегда связаны с полной утратой HLA - молекул 1 класса. P. Jimenez и сотр. (2000) показали, что среди 12,7% случаев полной утраты экспресии HLA-ABC на поверхности клеток меланомы, только в 2,5% случаев были выявлены мутаций в гене Р,-микроглобулина.

Как показано для клеточной линии нейробластомы и других HLA класс-1 - дефицитных линий опухолевых клеток полная утрата HLA-молекул 1 класса может возникнуть после изменения связывания ядерных регуляторных факторов с промотором в гене Р,-микроглобулина (Drew P.D. et al., 1993). Однако эти мутации в очень небольшом проценте случаев связаны с утратой экспрессии молекул HLA 1 класса на клетках меланомы (Perez В. et al., 1999).

Таким образом, выявленные нарушения в регуляции экспрессии молекул HLA I класса на клетках меланомы очень часто ассоциируются с низкой иммуногенностью опухолевых клеток. Недавние клинические наблюдения показали, что в ранней стадии опухолевой прогрессии опухолевые клетки эк-сгюрссируют HLA - молекулы I класса, в то время как клетки более поздних стадий развития содержали эти молекулы в меньшем количестве или же вообще их не имели (Coulie P.G. et al., 1999). Недостаток экспрессии на опухолевых клетках молекул HLA 1 класса коррелирует с прогрессией их злокачественности. Отсюда следует вывод: опухолевые клетки, содержащие большое количество HLA-молскул 1 класса, должны элиминироваться опухоль-специфическими Т - лимфоцитами, а клетки, не содержащие таких антигенов, способны “ускользать” от цитотоксического действия Т - лимфоцитов.

ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА В ОНКОЛОГИИ

Барышников А.Ю.

НИИ экспериментальной диагностики и терапии РОНЦ им. Н.Н.Блохина, РАМН, Москва, Россия

На протяжении двух десятилетий моноклональные антитела (МКА) применялись в онкологии с диагностической целью. Однако, в последние годы, они стали использоваться для лечения онкологических больных как самостоятельно, так и в составе иммуноконъюгатов, иммунолипосом, противоопухолевых

2002, Т. 4, №2

Он ко иммун ология

вакцин и др. В РОНЦ РАМН применяются коммерческие терапевтические МКА Геросептин, Мабтера, а также отечественные МКА Имутеран и АТЕМА. Геросентин представляет собой рекомбинантные МКА, состоящие из вариабельной части мышиных МКА и констатиой части человеческого иммуноглобулина. Они направлены против антигена Her2/ncu, который является рецептором эпидермального фактора роста. Геросептин используется в комбинации с химиопрепаратами и существенным образом потенцирует их противоопухолевое действие. Так, например, частота положительных ответов на терапию адриамицином и циклофосфамидом повышается с 43% до 52%, а эффективность таксола повышается с 16% до 42%.

Mabthera (Rituxan, Rituximab) - это гуманизированные химерные антитела против антигена CD20 В-лимфоцитов человека. Они состоят из вариабельной области мышиных МКА и константной области человеческого IgG. Rituxan применяется при лечении В-клеточных нс-Ходжкинских лимфом низкой степени дифференцировки, а также фолликулярных лимфом и хронического лимфолейкоза. Имутеран создан на основе МКА ICO-25, направленных против дегликозилированного муцино -подобного антигена MUC-I. МКА ICO-25 убивают опухолевые клетки в культуре клеток и у голых мышей. Имутеран применяется для лечения рака яичников и рака молочной железы. В настоящее время препарат прошел первую фазу клинических испытаний и передан на 2-ю фазу. МКА Атема предназначены для купирования острой реакции отторжения трансплантатов. Атема создан на основе МКА 1СО-90, направленных против антигена CD3 Т-лимфоцитов человека. МКА ICO-90 индуцируют апоптоз в активированных Т-клетках. После связывания с комплексом СОЗ/Т-клеточным рецептором антигена происходит индукция Fas-лиганда, который затем связывается с Fas-рецептором и индуцирует сигнал клеточной гибели. В настоящее время препарат успешно проходит II фазу клинических испытаний и применяется при купировании реакции отторжения трансплантатов почки и при пересадке аллогенно-го костного мозга у больных острыми лейкозами.

Второе терапевтическое применение МКА - иммунотоксины. В настоящее время разрабатываются иммунотоксины для лечения меланомы и Т-клеточных лейкозов.

Третье направление использования МКА - генно-инженерные вакцины, в которых для адресной доставки применяются миниантитела. Разрабатываются вакцины, состоящие из миниантител ICO-25 и энтсротоксина А или рецептора интерлейкина-2.

Четвертое направление применения МКА - иммунолипо-сомы. МКА, связанные с липосомами, доставляют химиопрепарат в опухолевую клетку. Разработана технология получения иммунолипосом - невидимок против С05+-клеток.

ИММУНОТЕРАПИЯ: МОНИТОРИНГ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ

Буркова А.А.. Заботина Т.Н., Кадагидзе З.Г.

Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва, Россия

В последнее время, все больше внимания уделяется развитию биогерапии в онкологии, в частности вакцинотерапии. Так в РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН проводится первая фаза клинических исследований по изучению действия аутологичных вакцин на основе опухолевых клеток больных, трансфецированных геном tag 7. В исследуемую группу входило 5 человек с диагнозом диссеминированная меланома и 2 - рак почки с множественными метастазами. В лаборатории клинической иммунологии проводилось изучение динамики показателей клеточного имму-

нитета у этих больных до начала лечения, через две недели после каждого введения и спустя месяц после окончания программы. Исследовали субпопуляции лимфоцитов периферической крови с применением МКА производства НПЦ “МедБиоСпсктр” и “Simultest” (Becton Dickinson, США) с последующим одно и двухнараметровым анализом на проточном цитофлюориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США). Оценивалась экспрессия Т-клеточных CD3, CD4, CD8, В-клеточных CD20, NK-клеточ-ных CD 16, CD lib, активированных и линейно нерсстриктиро-ванных антигенов CD38, HLA-Dr, CD50 и CD95.

При анализе Т-клеточного звена у половины больных было выявлено снижение экспрессии CD3 антигена, нарастающее в динамике, у остальных показатели были в пределах нормы. Отмечены субпопуляционные нарушения соотношения CD4* и CD8+ клеток, отражающиеся в снижении иммунорегуля-торного индекса. Гиперэкспрессия CD8, наблюдавшаяся у 60% больных сопровождалась выраженным снижением CD16+ клеток, и, наоборот, при снижении CD8+ клеток отмечено увеличение экспрессии CD 16. При двойном окрашивании все CD16+ клетки были CDllb\ процент CD8+ CDllb+ клеток, исходно составлявший 30-40%, на фоне терапии вдвое увеличился (60-80%). Увеличение экспрессии CD lib (исходно высокой у 70% больных) сопровождалось увеличением CD38* клеток аналогичной степени выраженности. У 60% больных был выявлен низкий уровень экспрессии одновременно и CD50 и CD95, что является неблагоприятным фактором прогноза. Отмечена корреляция этих изменений с низким уровнем CD 16 и снижением экспрессии В-клеточного антигена CD20.Таким образом, увеличение CD 11 b*, CD38+, CD16+ CD1 lb+ и CD8+ CDllb+ клеток говорит об активации эффек-торного звена клеточного иммунитета, возникающий через 2 недели после первого введения вакцины, и увеличивающейся с каждым введением; спустя месяц после последнего введения, показатели возвращаются к исходным значениям.

У больных с диагнозом рак почки с множественными метастазами были выявлены исходно более глубокие нарушения иммунитета, в сравнении с больными с диссеминированной меланомой, однако динамика показателей клеточного иммунитета в процессе лечения была аналогичной.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ИММУНОРЕАКТИВНОСТЬ БОЛЬНЫХ МЕЛАНОМОЙ КОЖИ

Бычкова Е.Ю.. Любошенко Т.М.

Областной онкологический диспансер, Омск, Россия

Введение. Меланома кожи - одна из самых злокачественных опухолей, удельный вес которой составляет 1-4% от всех злокачественных новообразований. Примерно 75% больных к моменту начала адекватного лечения имеют рапространен-ный процесс. Результаты лечения меланомы кожи в целом также нельзя признать удовлетворительными, поскольку в среднем пятилетние сроки дожития составляют не более 50%.

Цель и задачи исследовании. Целью работы явилось изучение показателей иммунного статуса у лиц с гистологически верифицированным диагнозом меланомы кожи.

Материалы и методы. Было обследовано 47 человек (19 мужчин и 28 женщин) в возрасте от 22 до 75 лет. Больные были разделены на две группы: первую группу составили 32 пациента без признаков рецидива и генерализации, во вторую группу вошли 15 больных меланомой с клиническими признаками прогрессирования и генерализации процесса. Оценка показателей иммунного статуса проводилась дважды с интервалом в 6 месяцев. Лабораторное иммунологическое исследование венозной крови проводилось по тестам 1 и 2 уровней сложности.

Результаты. В ходе исследования было выявлено, что имеются отличия параметров иммунореактивности между 1 и 2 группами. В венозной крови больных отмечены тенденции к росту содержания лейкоцитов, лимфоцитов и больших гранулярных лимфоцитов в 1 группе и снижению во 2 группе. При анализе показателей клеточного иммунитета прослеживалась тенденция к повышению изначально сниженного уровня Т-лимфоцитов CD3+ в 1 и 2 группах (4,46±4,89 -55,33±7,47%) и (53,67±8,28 - 62,67±4,27%) соответственно. У больных 1 группы выявлена тенденция к снижению уровня CD4* клеток с 33,67±4,74% до 29,67±11,55%, CD8+ клеток с 31,33±15,05% до 16,0±6,4%, росту уровня CD16* клеток с 7,67±2,97% до 18,0± 13,4% и соотношения CD47CD8" с 1,23±0,46 до 1,86±0,12. Во 2 группе наблюдалась тенденция к снижению уровня CD4* клеток с 41,33±5,65% до 32,33±14,85%, CDI6* клеток с 19,33±8,73% до 11,0±4,03%, соотношения CD47CD8* с 2,05±1,57 до 0,98±0,04. Изучение фагоцитарной активности выявило, что фагоцитарный индекс нейтрофилов достоверно снижался в динамике в 1 группе 21,55±5,46- 13,17± 1,12%, р<0.05 и 36,6±0,28 - 14±6,06%, р=

0,05 - во 2 группе. Отмечалась тенденция к снижению индекса завершенности фагоцитоза, количества активных фагоцитов в обеих группах. Исследование метаболической активности нейтрофилов в НСТ - тесте показало статистически достоверное снижение НСТ - спонтанного в 1 и 2 группах 17,8±5,95 - 11,33±4,11 %, р<0,05 и 19,07±6,75 -11,17±7,78%, р<0,05 соответственно. Наблюдалась тенденция к снижению НСТ - индуцированного в обеих группах. При анализе показателей гуморального иммунитета выявлен достоверный рост содержания IgM в 1 группе 1,19±0,2 - 1,35±0,24г/л, р<0,01, а во 2 группе - тенденция к снижению. Такая же тенденция наблюдалась в обеих группах по содержанию нормальных антител, IgG, бактерицидной активности сыворотки крови.

Заключение. Таким образом, у больных меланомой как радикально пролеченных, так и с признаками прогрессирования процесса наблюдается стойкое и выраженное вторичное комбинированное иммунодефицитное состояние. В связи этим необходимо разрабатывать и применять в клинической практике различные схемы иммуноориентированной терапии, нормализующие показатели иммунореактивности, а значит, и улучшающие качество жизни пациентов.

ИНФУЗИИ ДОНОРСКИХ ЛИМФОЦИТОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РЕЦИДИВА ПОСЛЕ АЛЛОГЕННОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

Вавилов В.Н.. Смирнова А.Г., Афанасьев Б.В.

Санкт-Петербургский государственный медицинский университета им. акад. И. П.Павлова, Центр гематологии,

отделение трансплантации костного мозга,

Сан кт- Петер бург, Ро с сия

В настоящее время методика инфузий донорских лимфоцитов при рецидиве заболевания после аллогенной трансплантации гсмопоэтичсских клеток является наиболее популярной методикой адоптивной иммунотерапии и эффективно используется не только у пациентов с гемобластозами, но и у больных с солидными опухолями.

Концентрат лимфоцитов выделяется методом лейкоцита-фереза с помощью сепаратора клеток крови и вводится реципиенту однократно в больших дозах или многократно с последовательной эскалацией дозы вводимых клеток. Возможно сочетание инфузий лимфоцитов с терапией цитокинами. В западных исследованиях доля пациентов с рецидивами гемато-

логических заболеваний после алло-ТГСК, получавших ДЛИ составляет до 65-70%, при 3-х летней безрецидивной выживаемости свыше 90%.

В данной работе изложен наш опыт адоптивной иммунотерапии с применением инфузий донорских лимфоцитов.

Больной И. 1984 г.р. Диагноз: хронический миелолейкоз (с июня 1994 года) фаза акселерации, РЬ’(+), Ьсг/аЫ(+). На фоне терапии гидроксимочевиной достигнута хроническая фаза заболевания. В июле 1997 года, в связи с развитием второй фазы акселерации, больному была выполнена аллоген-ная неродственная трансплантация гемопоэтических клеток. Протокол кондиционирования миелоаблативный. В феврале 1998 года у больного развился молекулярный и гематологический рецидив. После проведенной адоптивной иммунотерапии интерлейкином-2 и донорскими лимфоцитами в дозе 10‘Укг и 107/кг СОЗ+ клеток достигнута полная клинико-гематологическая и цитогенетическая ремиссия, значительно уменьшилось число Ьсг/аЫ-трапскриптов. В конце 2001 года выполнена третья инфузия донорских лимфоцитов (доза СЭЗ* клеток - Ю^/кг). В настоящий момент больной находится в полной клинико-гематологической и цитогенетической ремиссии заболевания.

Больной Б. 1946 г.р. Диагноз: острый нелимфобластный лейкоз, М5-вариант (с января 2000 года). После курса индукционной терапии достигнута клинико-гематологическая ремиссия. В сентябре 2000 года развивается первый рецидив заболевания. В связи с неэффективностью стандартной терапии и наличием у больного НЬА-совместимого донора-род-ственника, в марте 2001 года выполнена аллогенная трансплантация с немиелоаблативным кондиционированием. На 21-й день после ТГСК наступило приживление донорского костного мозга, однако, через месяц после трансплантации развился второй рецидив. Была предпринята попытка проведения адоптивной иммунотерапии: после курса терапии интерлейкином-2 производились инфузии лимфоцитов донора (доза лимфоцитов 5х106/кг и 1х107/кг, доза СБЗ" клеток 2х10'Укг и 6х10й/кг соответственно). Несмотря на проводимое лечение больной погиб от опухолевой интоксикации и полиорганной недостаточности.

Больная Е. 1952 г.р. Диагноз: светлоклеточный рак левой почки ТЗЮМ0 (с августа 1999 года). В августе 1999 года у больной диагностирована опухоли левой почки с прорастанием в лоханку и капсулу почки, поражением парааорталь-ных и воротных лимфатических узлов. Проведеннная лучевая и иммунотерапия дендритными клетками и 1Ь-2 без эффекта, выявлена прогрессия заболевания с поражением надключичных лимфатических узлов слева. Проведена повторно лучевая терапия и терапия интерфероном, без положительной динамики. В связи с резистентностью к проводимой терапии и наличием НЬА-совместимой сестры, в марте 2001 года больной выполнена аллогенная родственная трансплантация гемопоэтических клеток с немиелоаблативным кондиционированием. Признаков реакции “трансплантат против хозяина” в посттрансплантационном периоде не отмечлось, восстановление гемопоэза произошло на 9-й день после трансплантации. В мае и июне 2000 года больной произведены инфузии донорских лимфоцитов (доза лимфоцитов 2,8x107/кг и 8,2x107/кг соответственно). Больная погибла от профессии опухолевого заболевания, резистентного к проводимому лечению.

Несмотря на имеющиеся неудачи и проблемы, стоящие перед гематологами и трансплантологами, метод адоптивной иммунотерапии является в настоящее время одним из наиболее перспективных терапевтических направлений в онкологии.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФЕНТИРИНА И АМИРОНА ДЛЯ ИММУНОСУПРЕССИИ ЖИВОТНЫХ С КСЕНОГРАФТАМИ ОПУХОЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА

Голубева И.С.. Яворская Н.П., Смирнова Л.И., Чикинева Н.А., Глибин Е.Н.1

Российский Онкологический

Научный Центр им. Н. И. Блохина РАМН,

' Санкт-Петербургский Технологический Институт, Россия

Невозможность прямого переноса в клинику результатов экспериментов на опухолях животных ставит задачу поиска новых адекватных моделей для направленного создания препаратов по лечению определенных форм опухолей. Возможность использования опухолей человека для прогнозирования спектра действия новых препаратов остается чрезвычайно важной. Исследователей постоянно привлекает работа по изысканию иммунопривилегированной области тела животных, угнетению иммунной системы хозяина с целыо увеличения се толерантности к гетеротрансплантатам человеческих опухолей.

Задачей исследования явилась попытка использовать известный препарат из группы хлорэтпламинов - фентирин в качестве иммунодепрессанта при гетеротрансплантации фрагментов человеческих опухолей под капсулу почки иммуноком-петентным мышам. Этот шестидневный гост, предложенный в 1978 году Bogden А. (США), позволяет, по данным автора, использовать для определения индивидуальной чувствительности опухолей и спектра действия противоопухолевых препаратов около 85% опухолей человека различного гистогенеза.

Предположено, что с использованием иммунодепрессии у мышей удастся продлить сроки проведения теста для ряда препаратов с длительным режимом введения.

Исследуемые первичные опухоли отбирали с помощью микроскопа и метода отпечатков из участков, содержащих наибольшее количество опухолевых клеток. Опухоли (рак желудка, яичников, меланому и опухоль Вилмса) разделяли на фрагменты по

1 мг. Все операции по отбору, нарезанию и взвешиванию микрофрагментов проводили с использованием стерильных инструментов и растворов. Реципиентами для ксенографтов служили мыши-гибриды первого поколения ВОр! и Р . Для сохранения гормонального статуса пол реципиента и донора соответствовали. Для анестезии животных применяли гексенал внутрибрю-шинно в дозе 100 мг/кг массы тела за 5-10 минут до начала экс-

Табл. ЗАВИСИМОСТЬ РОСТА ГЕТЕРОТРАНСПЛАНТАТОВ ПОД КАПСУЛОЙ ПОЧКИ МЫШЕЙ ОТ ИММУНОСУПРЕССИИ

опухоль мг/кг х введ/ инт. (час) иммуно- депрессант дни* Дни забоя животных

6 9 12 15 6 9 12 15

с иммунодепрессией контроль

изменение массы опухолевых фрагментов (%)

р.желудка 1 200x5/24 амирон 26 57 40 - -28 20 13 . -42

р.желудка 2 200x5/24 амирон 35 13 23 - -8 10 0 - -38

р. яичника1 200x5/24 фентирин 17 22 25 -18 -10 48 6 -30 -17

р. яичника2 200x5/24 фентирин 34 10 52 - 41 -1 -2 - -8

меланома 200x5/24 фентирин 22 42 87 - 56 10 22 - 13

оп. Вилмса 100x5/24 фентирин 23 70 67 10 -5 35 25 18 -15

* - дни от начала введения иммунодепрессанта до имплантации опухоли

перимента. С целью продления сроков теста использовали фентирин и промежуточный продукт его синтеза - основание фен-тирина (амирон)рего.ч пятикратно ежедневно в дозе 200 мг/кг (с отсроченным действием их от 15 до 35 дней до момента имплантации опухолей). Забой животных проводили на 6-й, 9-й, 12-й и 15-й дни от подсадки под капсулу почки фрагмента опухоли. Рост ксенографтов оценивали, сравнивая конечный вес каждого фрагмента с его исходным весом в момент имплантации. Исследованию сопутствовал гистологический контроль.

Результаты проведенной работы демонстрируют более активный рост опухолевых фрагментов у мышей, получавших иммунодепрессанты, не только на 6-й, но и на 9-й день эксперимента (23-87%).

На основании проведенных экспериментов можно заключить, что на фоне иммуносупрессии допустимо увеличение сроков проведения теста с шести до девяти дней, что соответствует удлинению времени экспозиции фрагментов опухоли действию изучаемых противоопухолевых соединений на 50%. Возможные сроки иммуносупрессии составляют при этом от 15 до 35 дней, наилучшие результаты получены после 20-25 дней воздействия иммуиодепрессантов. Использованные дозы иммунодепрессантов 100 и 200 мг/кг являются адекватными. Фентирин и амирон могут использоваться в качестве иммунодепрессантов для увеличения толерантности животных к гетеротрансплантатам человеческих опухолей.

РОЛЬ МАРКЕРОВ АП0ПТ03А, ПРОЛИФЕРАЦИИ И АНГИОГЕНЕЗА В ПРОГРЕССИРОВАНИИ РАКА ЯИЧНИКОВ

Дбар Ж.Н.. Полушкина И.Н., Степанова Е.В., Шишкин Ю.В., Барышников А.Ю.

НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического научного центра им. ПН.Блохина РАМН, Москва, Россия

Карцинома яичников составляет 20-25% среди различных локализаций генитального рака. Большое количество ростовых факторов или регуляторных пептидов и их рецепторов экспрессируются в опухолевых клетках, стимулируя их деление. Целыо нашего исследования было определить молеку-лярно-биологический профиль рака яичников с включением 10 различных белков (р53, Вс1-2, Вах, С095Ь, УЕСР, ЬРвР, НЕК-2/пеи, тимидилат синтетаза, тимидин фосфорилаза, Ю-

67) и оценить их прогностическое значение для общей выживаемости больных.

В исследование вошло 98 больных раком яичников, пролеченных в РОНЦ РАМН. Все больные после операции получали адъювантные режимы химиотерапии на основе соединений платины или таксанов. Исследование проводилось им-муногистохимическим методом на парафиновых блоках опухолей, полученных в ходе рутинной работы. Результаты окрашивания подсчитывались полуколичественно.

Средняя пролиферативная активность опухоли (по индексу Ki-67) составила 43±33% (медиана - 40%). Экспрессия bcl-2 коррелировала с присутствием CD95L в опухолевых клетках (р=0,038). У больных положительных по Вс1-2, экспрессия CD95 лиганда достигала 82,8%, а у отрицательных по белку -57,1%. При отсутствии bcl-2 в опухолевой ткани, большинство опухолей были также Вах отрицательными (72,2%). Низкодифференцированные опухоли характеризовались более высокой пролиферативной активностью, высокой частотой экспрессии р53 в опухолевых клетках и тимидин фосфорила-зы в стромальных клетках. Анализ общей выживаемости больных показал что, экспрессия Вах и bFGF в опухоли являются маркерами укорочения безрецидивной выживаемости (р=0,017 и 0,01, соответственно). Отсутствие Вах в опухолевых клетках ассоциировалось с укорочением выживаемости больных раком яичников вне зависимости от типа лечения. Опухоли положительные по bFGF имели более короткое время жизни.

Исследование молекулярно-биологических маркеров может помочь спрогнозировать течение и прогноз больных раком яичников.

СОСТОЯНИЕ ИММУННОГО СТАТУСА БОЛЬНЫХ БОЛЕЗНЬЮ ХОДЖКИНА В РАЗНЫЕ ПЕРИОДЫ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Долгонолова Е.В.. Никитин В.Ю., Цыган В.Н.

Военно-медицинская академия,

Санкт-Петербург, Россия

В странах СНГ заболеваемость болезнью Ходжкина (БХ) составляет 3-4 случая на °/ населения и имеет явную тенденцию к омоложению. Несмотря на явные успехи в терапии данного заболевания, проблема возникновения, прогнозирования и лечения ранних и поздних рецидивов до сих пор остается актуальной.

Цель. Сравнительный анализ изменений иммунологических показателей у больных БХ до лечения и во время рецидива, и выявление предпосылок к развитию рецидива.

Материалы и методы. Обследовано 22 больных БХ (из них 6 с вариантом СК II и III стадий и 16 с НС II и III стадий в возрасте 23±5 лет). Наблюдение за состоянием иммунной системы проводили до ПХТ, в процессе лечения и после него.

Субпопуляционный анализ лимфоцитов проводили на проточном цитометре; исследовали функциональную активность Т-лимфоцитов и нейтрофилов; оценивали содержание иммуноглобулинов основных классов (Ig), циркулирующих иммунных комплексов (ИК), компонентов системы комплемента.

Результаты. В результате исследований было установлено, что при БХ - у 90% больных были нейтрофильный лейкоцитоз (в 65% выраженный), относительная лимфопения; недостаточность Т-клеточного звена иммунитета - уменьшение абсолютного числа CD3, CD4, CD8 Т-лимфоцитов у 80% больных (р<0,05) и имму-норегуляторного индекса у 70%, а также незначительное снижение функциональной активности Т-лимфоцитов в 95% случаев (р<0,1). Число клеток CD25 и натуральных киллеров (NK) у 30% пациентов находилось в пределах нормы при нормальном со-

держании Т-лимфоцитов, у 70% отмечалось достоверное снижение экспрессии CD25 на поверхности Т-клеток и увеличение NK. Со стороны гуморального звена иммунитета наблюдалось умеренное снижение количества В-лимфоцитов (CD20, CD19) в 85% случаев и повышение концентрации IgA, IgG, IgM и IgG2 в крови (р<0,01), в 60% - увеличение IgE. Уровень средне- и особенно низкомолекулярных ИК превышал значения контрольной 1~руппы, содержание же высокомолекулярных ИК было в норме. При анализе компонентов системы комплемента (СЗ, С4, С5)

- выявлено увеличение СЗ в 2 раза (р<0,01).

Комбинированная ПХТ усугубила уже имеющиеся нарушения иммунитета, полная ремиссия заболевания была достигнута не у всех больных, примерно через 1-2 года у 30% развился рецидив БХ (БР). В период динамического наблюдения у БР происходило повышение содержания лейкоцитов, нейтрофилов и снижение лимфоцитов, тогда как у больных без рецидива (БРБ) эти показатели колебались в пределах нормы. Содержание основных субпопуляцнй Т- (CD3, CD4, CD8, CD25) и В-лимфоцитов (CD19, CD20), NK постепенно возрастало в обеих группах, однако не достигало значений контрольной группы, кроме этого отмечался дисбаланс в соотношении CD4 и CD8 Т-клеток (CD4<CD8), который в дальнейшем исчезал у БРБ. Уровень Ig после лечения постепенно нарастал, достигая верхней границы нормы к 9 мес, а затем наступало своеобразное плато. Концентрация ИК в обеих группах, на всем протяжении наблюдения, колебалась в пределах нормы (исключение: повышенное содержание высокомолекулярных ИК у БР). Период рецидива сопровождался увеличением числа лейкоцитов, нейтрофилов, NK и резким снижением количества Т- и В-клеток, значительным уменьшением функциональной активности Т-лимфоцитов. Наряду с этим отмечалось резкое увеличение уровня IgA и IgM, подъем в несколько раз содержания средне- и низкомолекулярных ИК, причем эти показатели превышали данные до лечения (р<0,05).

Выводы.

1. У больных БХ наблюдалось выраженное угнетение Т-си-стемы иммунитета, повышенное содержание натуральных киллеров. Несмотря на невысокое количество В-лимфоцитов в крови, отмечалась активация гуморального звена иммунитета.

2. После лечения у большинства пациентов происходило постепенное восстановление большинства иммунологических показателей, однако их значения не достигали значений контрольной нормы.

3. Во время рецидива у больных отмечались прогредиен-тные изменения со стороны всех звеньев иммунитета по сравнению с первичными больными.

СУБПОПУЛЯЦИОННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МАРКЕРОВ АПОПТОЗА В НОРМЕ И ПРИ ГЕМОБЛАСТОЗАХ

Заботина Т.Н.. Буркова А.А., Кадагидзе З.Г., Барышников А.Ю.

Российский онкологический научный центр им. Н. II. Блохина РАМН, г. Москва, Россия

Одной из причин возникновения лимфопролиферативных заболеваний являются нарушения в программе апоптотической гибели клеток, начиная от клеток-предшественников в костном мозге до зрелых клеток периферической крови. При наличии широкого спектра специфических маркеров, характерных для дискретных этапов дифференцировки клеток, а также из-за доступности исследуемого материала, изучение феномена апоптоза клеток оказалось наиболее актуальным в гематологической практике.

Цель исследования. Изучить особенности ко-экспресии маркеров апоптоза CD95, MDR, Вс1-2, р53, Вах, на различ-

пых этапах дифференцировки В-клсток в норме и при гемоб-ластозах.

Материалы и методы. В качестве исследуемого материала использовали мононуклеарную фракцию костного мозга н/или периферической крови первичных больных хроническим лимфолейкозом (В-ХЛЛ) (п=25) и здоровых доноров (п=5).Для выяснения линейной принадлежности клеток использовали моноклональные антитела (МКА) к поверхностным ан тигенам CD3, CD5, CD 19, CD20, HLA-DR. Анализ мембранных маркеров аноптоза и внутриклеточных онкобелков осуществляли с помощью МКА к Р-гликопротеину, CD95, р53, Вс]-2, Вах, конъюгированных с FITC, РегСР или РЕ (Beclon Dickinson, США, DAKO, Дания).Проточно-цитофлуоримст-ричсский анализ проводился на приборе FACSCalibur(Becton Dickinson, США).

Результаты. Однопараметровый анализ экспрессии антигена CD95 на клетках первичных больных ХЛЛ без учета стадии заболевания не выявил закономерностей его распределения. Однако, при использовании метода двойного окрашивания и DotPlot анализа установлено, что у больных в дебюте заболевания антиген CD95 определяется исключительно па CD3* Т-клетках, a CD20\ CD19\ HLA-DR^ - В-лимфоциты отрицательны по экспрессии CD95. Снижение уровня CD95 коррелирует с прогрессированием заболевания (лейкоцитоз до 300 тыс., лимфоцитоз 90-95%, пролимфоцитоз до 10%) и объясняется элиминацией Т-клеток, NK-клеток и преимущественным выживанием В-клеток. Обращает на себя внимание тот факт, что и при 1, и при IV стадии ХЛЛ ( по R.Rai) митохондрии лейкемических CD5+, CD19\ CD20+ В-клсток гиперэксп-рессируют Вс1-2 белок. При этом, у 98% первичных больных ХЛЛ независимо от стадии заболевания обнаружена гомодн-мерная форма белка Вс1-2. Анализ гиподиплоидной фракции ДНК CD5+, CD 19* В-клеток до и в процессе проведения специфической терапии показал, что элиминация лейкозных клеток при отсутствии CD95 антигена на мембране осуществляется по независимому Fas-лиганд-рецепторному пути.

Трехцветный анализ субпопуляций лимфоцитов периферической крови здоровых доноров показал, что все CD197 CD3 , CD207CD3 . HLA-DR7CD3 В-лимфоциты несут на своей поверхности антиген CD95 и Р-гликопротсин, однако являются негативными по экспрессии внутриклеточных онкобелков Вс1-2 и р53. Несмотря на высокий (более 50%) уровень CD95’ лимфоидных клеток, антиген CD95 коэкспресси-руется на 60-75% CD3+ Т-лимфоцитах.

СОДЕРЖАНИЕ АУТОАНТИТЕЛ К РНК В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ТИПА ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ

Зайнуллина А.С., Винтер В.Г.. Ишмухаметова Д.Г., Шакиров К.Т*.

Казанский государственный университет, кафедра биохимии. Республиканский онкологический центр, Казань, Россия

Введение. Аутоиммунная реакция организма в норме, как и нормальный иммунный ответ, направлена на сохранение гомеостаза организма. Аутоиммунное состояние организма, возникающее в результате аутоиммунных патологий, отличается от аутоиммунной реакции в норме лишь тем, что это - ответ вышедший из-под контроля регуляторных механизмов иммунной системы. Причем этиология возникновения аутоиммунного состояния многофакторна, и не существует одной единственной причины развития этого состояния.

В этом отношении просматривается явное сходство между развитием аутоиммунного состояния и злокачественным ростом. Злокачественное перерождение является результатом множественных причин, и при возникновении опухоли также наблюдается потеря подчинения регулирующим механизмам, что приводит к неконтролируемому росту.

Такое сходство развития аутоиммунного состояния и злокачественного роста, очевидно, не является чисто внешним и случайным, а указывает на возможную связь между двумя этими событиями.

Целью настоящей работы было определение аутоантигел (ААТ) к РНК в сыворотке крови пациентов Республиканского онкологического центра с применением разработанной авторами тест-системой на основе ИФА.

Материалы и методы. В качестве антигена использовали суммарную дрожжевую РНК, ЕМ)/Е = 2,3. В качестве ко-пьюгата использовали меченые пероксидазой антитела против иммуноглобулинов человека.

В лунки планшетов вносили по 100 мкл раствора РНК в нитратном буфере, pH 5.0, облучали УФ - светом 10 минут, не связавшийся антиген, отмывали ФСБт, pH 7.2. Сыворотки крови вносили в разведении ФСБт 1:100, инкубировали 2 ч при 37°С, отмывали и инкубировали 1,5 ч при 37°С с раствором коньюгага. После отмывки не связавшегося коньюгата в лунки вносили субстратную смесь (0,1 М фосфат - 0,05 М цитратного буфера, pH 5,0; 0,05% Н20, и 0,4 млг/мл ОФД). Оптическую плотность реакции измеряли на приборе “Multiskan” (Flow, Великобритания) при длине волны 405нм (ОП ).

Во всех опытах в качестве стандарта использовали одну и ту же сыворотку здоровых доноров с низким уровнем ААТ к РНК для сравнения анализов, проводимых в разные дни. Полученные результаты представляли как соотношение ОП ( , опыта / ОН стандарт и выражали в относительных единицах (отн. ед.).

О чувствительности и воспроизводимости ИФА судили по результатам статистической обработке данных, вычисляя среднее арифметическое (М) из 5 повторов, ошибку среднего (т) и коэффициент вариации (Cv%) для каждой индивидуальной сыворотки. Достоверность результатов определяли по t - критерию Стыодснта (с вероятностью 95%).

Основные результаты. Нами было проанализировано содержание ААТ к РНК в сыворотке крови 156 больных из республиканского онкологического центра и 51 больного из гематологического отделения 5-ой городской больницы г. Казани Индивидуальные уровни содержания ААТ к РНК в сыворотке крови в группе больных колеблются от 1,17 отн.ед. до 5,55 от-н.ед. У большинства (75%) обследованных пациентов уровень содержания аутоантител к РНК в сыворотках крови находится в диапазоне 1,38-2,50 отн.ед. Среди онкологических больных лишь 10% имеют содержание ААТ к РНК, значительно превышающие средние значение группы и 19% - уровень содержания аутоантител не превышающий пороговое значение группы здоровых людей. Среднее значение уровня содержания ААТ к РНК у данной группы составило 1,91 ±0,08 отн. ед. и в 1,6 раз дос товерно превышало норму (1,17±0,02).

Повышенный уровень содержания ААТ к РНК в сыворотке крови пациентов был обнаружен в большинстве случаев при исследовании различных злокачественных опухолей. Исключение составили лимфопролиферативные заболевания, такие как лимфогранулематоз и различные формы лейкозов. У больных этих групп уровень содержания аутоантител к РНК не превышает порогового значения нормы, а в случае хронического лимфолейкоза значительно ниже этого значения (0,77±0,11).

Уровень содержания ААТ также зависит и от стадии развития опухоли. Достоверное повышение уровня содержания

ААТ к РНК наблюдается в III стадии развития опухоли (2,05±0,14), с тенденцией к понижению в IV стадии. Такой высокий уровень содержания антинуклеарных антител в сыворотке крови онкологических больных является характерным для аутоиммунного состояния.

Заключение. Роль и значение ААТ к нуклеиновым кислотам остаются еще до конца не изученными. Появление этих ААТ в сыворотке крови и значительное повышение уровня их содержания при развитии опухоли не является случайными, а отражает серьезные нарушения в функционировании иммунной системы в организме опухоленосителей. Полученные нами результаты позволяют утверждать, что повышенный синтез ААТ к РЫК является одним из центральных событий в иммунологических взаимоотношений опухоли и организма.

ЭКСПРЕССИЯ CD133+/CD34+ АНТИГЕНОВ НА СТВОЛОВЫХ КРОВЕТВОРНЫХ КЛЕТКАХ У БОЛЬНЫХ ОСТРОЙ ЛЕЙКЕМИЕЙ ДЕТЕЙ

Зотова В.В.. Эбенер У., Вернер С., Бортникова О.Г., Бондарева М.П., Фисенко Л.Н.

Областная детская больница,

Ростов-на-Дону, Россия

Университет им. Гёте,

Центр детской гематологии и онкологии,

Франкфурт-на-Майне, Германия

Введение. Проблема трансплантации стволовых кроветворных клеток больным острой лейкемией (ОЛ), получающих высокодозную полихимиотерапию (ПХТ), остаётся наиболее актуальной. Необходимость её проведения обусловлена иммуносупрессивным действием ПХТ нагемопоэз. Побочные эффекты, в виде инфекционных заболеваний и кровотечений, можно преодолеть посредством трансплантации стволовых клеток. Поскольку аутологичная трансплантация сопряжена с риском переноса опухолевых клеток, необходима их очистка посредством иммуносорбции с моноклональными антителами.

Цель работы: изучение экспрессии CD 133* (АС 133*) и CD34* антигенов на стволовых кроветворных клетках у больных OJI в зависимости от иммунофенотипа и стадии заболевания.

Материалы и методы: под наблюдением находилось 70 больных (28 девочек и 42 мальчика в возрасте от 1 года до 17 лет), больных ОЛ (55 - ОЛЛ и 15 — ОМЛ). Иммунофенотипи-рование проводилось согласно критериям группы EGIL в соответствии с общим протоколом на проточном цитометре FACScalibur (BD). Оценка и обработка данных производилась на Macintosh Quadra 650 с применением Cell Quest Software. Результаты исследования считались положительными при экспрессии рецептортв выше 20%.

Результаты: частота экспрессии CD34 антигена на бла-стных клетках первичнодиагностируемых больных ОЛЛ и ОМЛ оказалась одинаковой ( 47% и 46,7%). У больных ОЛЛ экспрессия CD 133* оказалась ниже (18%) по сравнению с больными ОМЛ (46,7%). В пяти случаях (12,5%) у больных ОЛЛ и ОМЛ выявлялась коэкспреесия исследуемых маркеров. В зависимости от иммунофенотипа ОЛ наиболее высокий процент клеток, экспрессирующих CD34*, выявлялся при бифенотипических вариантах, недифференцированном ОЛ и ОМЛ. У больных ОЛЛ в период рецидива в высоком проценте выявлялась экспрессия CD34* и CD34* CD 133* антигенов.

Заключение: выявление у больных ОЛ экспрессии СЭ34+ и С0133* маркеров свидетельствует о необходимости изоляции клеток, несущих эти антигены, при аутологичной пересадке стволовых кроветворных клеток, выделенных из периферической крови.

ОСОБЕННОСТИ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО СТАТУСА У ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ

Кадагидзе З.Г.. Заботина Т.Н., Короткова О.В.

Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН,

Москва, Россия

Бурное развитие биотехнологии и выявление все новых фенотипов иммунокомпетентных клеток значительно обострило проблемы интерпретации значимости тех или иных иммунологических показателей у онкологических больных. Почти 30 летний опыт исследования иммунологической реактивности и ее связи с клиническим течением и прогнозом заболевания выявил, что рост большинства злокачественных новообразований сопровождается изменением различных звеньев иммунитета. В течение длительного времени приоритетное внимание уделялось нарушениям соотношения иммунорегуляторных Т лимфоцитов, однако, с ростом числа наблюдений у больных с начальными стадиями заболевания выявлено, что от 60% до 80% больных (в зависимости от нозологической формы опухоли) имеют практически нормальный уровень этих показателей. Данные о количестве и функциональной активности естественных киллеров указывают, что частота их нарушений в этой группе больных достигает лишь 48%. В последние годы для оценки иммунного статуса исследуется свыше 20 маркеров для определения фенотипа иммунокомпетентных клеток, выявляющих их суб-популяционную структуру. Особый интерес вызывает изучение уровня НЬА-ОИ, С038, С025, С050, С095 антигенов. Исследования показали, что хотя их показатели несколько чаще снижены у онкологических больных, но при начальных стадиях заболевания они не могут быть использованы для диагностических целей. Некоторым исключением, возможно, является экспрессия С095, которая отличается у больных с некоторыми доброкачественными и злокачественными опухолями, причем как на лимфоцитах, так и на опухолевых клетках. Безусловно, при генерализации опухолевого процесса процент числа нарушений отдельных иммунологических показателей возрастает до 60-80% случаев, но ни по одному из них он не достигает 100%. В то же время динамика экспрессии ряда маркеров может быть использована для оценки эффективности лечения и прогноза заболевания: снижение экспрессии СЭ50 свидетельствует о неблагоприятном прогнозе, что было показано как для больных раком желудка, подвергшихся оперативному лечению, так и у больных лимфопролиферативными заболеваниями, получивших высокодозную химиотерапию с последующей трансплантацией клеток-предшественников гемопоэза. Аналогично, экспрессия С095 на мембране бластных клеток больных ОЛЛ является прогностически благоприятным признаком безрецидивной и общей выживаемости; такие же данные получены и у больных миелодиспластическим синдромом и некоторыми солидными опухолями. Проведенные исследования показывают, что основное внимание следует уделять мониторингу индивидуальных иммунологических показателей в процессе лечения, где отрицательная динамика свидетельствует о неблагоприятном прогнозе заболевания, а также может служить основанием для иммунокоррекции.

2002, Т. 4. №2

Он ко имл ty нол огня

ОСОБЕННОСТИ ИММУННОГО СТАТУСА У ПАЦИЕНТОВ С ГИГАНТОКЛЕТОЧНЫМИ ОПУХОЛЯМИ КОСТНОЙ ТКАНИ

Кармацких О.Л. Куфтырев Л.М., Чепелева М.В.

ГУН Российский научный центр “Восстановительная травматология и ортопедия ” им. академика Г.А.И.шзарова,

Курган, Россия

Известно, что важную роль в патогенезе онкологических заболеваний играют нарушения со стороны системы иммунитета, осуществляющей надзор за возникновением и пролиферацией трансформированных клеток.

Цель данной работ ы - исследование гуморального и клеточного звеньев иммунитета у больных с гигантоклеточной опухолью кости.

Исследование иммунного статуса проведено у 12 больных в возрасте от 17 до 38 лет. Патологический очаг располагался в длинных трубчатых костях: в 6 случаях в бедренной, в

5 - в большеберцовой, в 1 - в локтевой. Длительность заболевания варьировала от 6 месяцев до 2 лет.

Лабораторно-иммунологическое исследование включало подсчёт общего числа лимфоцитов, определение количественного содержания Т и В- лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования, иммуноглобулинов классов А, М и в методом радиальной иммунодиффузии по Манчини, циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) методом осаждения с полиэтиленгликолем.

Анализ иммунологической картины у пациентов с гигаиток-леточной опухолью кости выявил наличие дисбаланса в клеточном звене иммунитета: уменьшение количества Т-лимфоцитов (32,6±2,26%) при нормальном содержании общего числа лимфоцитов (32,7± 1,73%) и Т-акгивных лимфоцитов (31,4±4,79%) в периферической крови. В гуморальном звене иммунитета отмечено достоверное снижение концентрации иммуноглобулина класса О (7,4±0,46 г/л.). Отклонений в содержании иммуногло-

Табл. ИЗМЕНЕНИЯ НЕКОТОРЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИММУНОГРАММЫ У БОЛЬНЫХ КОЛОРЕКТАЛЬНЫМ РАКОМ

После операции

Показатели Контроль До операции без иммунокоррекции с иммунокоррекцией

CD3, абс. 1362±14 803±157 534+63* 804± 145

CD4, абс. 862±105 611+131 453+69* 633±115

CD8, абс. 629±38 780±140 404+53*а 597±111

CD16, абс. 592±70 1185+222* 662±91а 706±147

CD22, абс. 377+46 472±65 339+36 485+136

CD25 абс. 754± 186 977+183 481 ±49а 855+1656

CD4/CD8 1,4+0,2 0,7±0,06* 1,4+0,За 1,2±0,2а

IgG, г/л 16,1 ±0,8 15,4± 1,6 12,8+1,1 ' 12,0+1,0’

IgA, г/л 2,7+0,1 3,1 ±0,2 2,6±0,4 2,9±0,3

IgM, г/л 1,3+0,04 1,9+0,1' 3,0±0,4'а 1,8±0,36

Фагоцитарное число 0,97±0,04 1,37±0,15‘ 1,77±0,20" 1,31 ±0,23

Абс. число объектов фагоцитоза 4821±255 7369+1149' 11843±2169' 11722±2639‘

НСТ стим., экстинкция при 710 нм 0,59±0,19 0,22±0,04 0,17+0,04 0,66+0,18аб

* - р<0,05 по (-критерию Стыодепта по отношению к контрольной группе; “ - то же к больным до операции; " - то же к больным после операции без иммунокоррекции; все абс. показатели приведены в расчете на I мм1 крови.

булинов классов А и М, В-лнмфоцитов, циркулирующих иммунных комплексов зарегистрировано не было.

Полученные результаты подтвердили наличие у пациентов с гигантоклеточной опухолью костной ткани нарушений со стороны как клеточного, так и гуморального звеньев иммунитета: Т-клсточного иммунодефицита и дисиммуноглобу-линсмии, что оправдывает применение у данной категории больных иммунокорригирующей терапии, позволяющей оптимизировать лечебный процесс и сократить сроки реабилитационного периода.

ИЗМЕНЕНИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ У БОЛЬНЫХ КОЛОРЕКТАЛЬНЫМ РАКОМ В УСЛОВИЯХ ЛИМФОТРОПНОЙ ИММУНОКОРРЕКЦИИ МИЕЛОПИДОМ

Катаев В.П.. Шилова Н.А.,

Ш плов Ю.И., Черкасов В.А.

Пермская государственная медицинская академия М3 РФ,

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Больные с колоректальным раком составляют одну из наиболее вероятных групп риска развития послеоперационных инфекционных осложнений, частота которых составляет 30-60%, и в 75% случаев они являются основной причиной смерти больных.

Целью работы явилось исследование изменений отдельных звеньев иммунной системы в условиях применения регионарной лимфотропной иммунокоррекции миелопидом в раннем послеоперационном периоде и оценка ее клинической эффективности у больных с осложненными и распространенными формами рака толстой и прямой кишок.

Материалы и методы. Обследовано 142 больных преимущественно с 4-й и 3-й стадией колоректального рака. У 94

человек использовались только общепринятые методы хирургического лечения, 48 пациентам в послеоперационном периоде проводили лимфотропную иммунокоррекцию миелопи-дом. Последний вводился в разовой дозе от 3 до 6 мг в сутки по методу Ю.М. Левина с 1-го по 5-8-й день после операции подкожно на стороне поражения (суммарная доза - от 15 до 53 мг). Иммунологическое обследование проводили в динамике. Использовали стандартный набор методов, включающих фенотипирование лимфоцитов с помощью моноклональных антител против CD3, CD4, CD8, CD22, CD16, CD25.

Основные результаты. До операции у больных колоректальным раком выявлена глубокая недостаточность 'Г-лимфо-цитарного звена со снижением относительного числа CD3+ (до 32,6±3,0%), CD4+лимфоцитов (до 24,9±2,7%), отношения CD4/CD8 (таблица). Число CD16* лимфоцитов значительно увеличивалось. Отмечено умеренное повышение фагоцитарной активности лейкоцитов и уровня IgM. В послеоперационном периоде у больных без иммунокоррскции сохраняется нарастание недостаточности Т-клеточного звена со снижением числа CD3*, CD4+ и CD8+ лимфоцитов, однако отмечено восстановление числа CD16+ клеток и отношения CD4/CD8. У больных с иммунокоррекцией выявлено восстановление абсолютного числа CD3\ CD4+, CD8+, CD25+, CD16^ лимфоцитов, выраженная активация фагоцитоза, повышение показателей НСТ-теста. Однако сохраняющиеся признаки иммунной недостаточности диктуют необходимость продолжения иммунокоррскции. В клиническом плане применение иммунокоррскции у 48 из 144 больных позволило снизить послеоперационную летальность среди плановых больных с 12% (75/9) до 5,6% (36/2), у неотложных больных - с 47,4% (19/9) до 16,7% (12/2).

ПРИМЕНЕНИЕ ОНКОМАРКЕРА СА 125 В ДИАГНОСТИКЕ ОПУХОЛЕЙ ЯИЧНИКОВ

Коновалов В.И., Аскерова М.Г., Казанцева С.В., Соколова Ю.А.

Уральская государственная медицинская академия, Екатеринбург, Россия

Для решения вопроса о ранней диагностике опухолей яичников перспективно использование иммунологических методов, основанных на определении содержания опухолевых маркеров в сыворотке крови больных.

По данным литературы, наибольшими показателями чувствительности и специфичности обладает опухолеассоциированный антиген СА 125.

За дискриминационную концентрацию СА 125 принимается уровень - 35 Ед/мл.

Цель исследования. Выяснить возможность применения онкомаркера (ОМ) СА 125 для диагностики, использования в дифференциальной диагностике и контроле за эффективностью лечения, у пациенток с опухолями яичников и различными заболеваниями органов репродуктивной системы.

Материалы и методы. На базе гинекологических отделений ГКБ №40 и ГКБ №6, женских консультаций №1, №2 и №35 г.Екатеринбурга проведено обследование и наблюдение 119 женщин различного возраста (от 15 до 76 лег). Пациентки разделены на группы по возрастному показателю и в зависимости от нозологии .

У всех пациенток до проводимой терапии определяли концентрацию СА 125 в сыворотке крови, полученной из локтевой вены, натощак. Повторный анализ проведен 11 больным через 1-3 месяца после оперативного лечения и химиотерапии.

Основную группу составляют пациентки старше 45 лет (54 человека). Среди нозологических форм (по количеству больных с данной патологией) первое место принадлежит второй группе (доброкачественные опухоли и опухолевидные образования яичников - 68 человек). В этой группе на первом месте по возрастному показателю также женщины старше 45 лет ( 26 человек).

Из 119 обследованных женщин уровень СА 125 выше “критического” обнаружен у 27 больных, что составляет 24% от общего числа обследованных женщин. Высокие концентрации СА 125, превышающие 35 Ед/мл, не обнаружены у женщин контрольной группы, пациенток с миомой матки (4-я группа), воспалительными заболеваниями органов репродуктивной системы (9-я группа).

Больные с доброкачественными опухолями и опухолевидными образованиями яичников (2-я группа) занимают первое место по количеству пациенток (68 человек) и второе по величине повышенных значений СА 125: средняя концентрация СА 125 в этой группе составила 46,7±14,0 Ед/мл. А у 14 пациенток зарегистрирован повышенный уровень данного антигена: средняя концентрация равна 110,9±26,2 Ед/мл (12,3%). Две самые высокие концентрации наблюдались у больных с кистомами яичников (346,9; 318,8 ЕД/мл.).

В третьей группе у 77% (7 из 9) больных со злокачественными опухолями яичников обнаружено значительное повышение концентрации СА 125. Эта группа занимает первое место по величине средней концентрации и величине повышенных значений (131,2±50,6 и 164,2±62,5 Ед/мл. соответственно). Распространенность опухолевого процесса оценивалась по международной классификации TNM . Зависимости между высокими значениями СА 125, размером, степенью вовлечения в процесс лимфоузлов и метастазированием, выявлено не было.

Эндометриоз различной локализации занимает третье место по количеству больных, у которых концентрация СА 125 превышает “критическое” значение, что составляет 3,3% от всего количества обследованных женщин. В 6-й группе (ретроцервикальный эндометриоз) выявлена одна пациентка с высокой концентрацией данного маркера (102,5 Ед/мл.), а в 7 группе (эндометриоз яичников) высокие концентрации отмечены у 2 больных: 55,8 и 69,6 Ед/мл. В обоих случаях в процесс вовлечены два яичника.

При миоме матки в сочетаннии с кистой яичника (5-я группа), внутреннем эндометриозе (8-я группа) процент повышенных значений для каждой группы составил 0,8% от общего числа обследованных больных и 16,6% (1 из 6) внутри групп.

Через 1-3 месяца после оперативного лечения и химиотерапии 11 пациенткам с высоким уровнем концентрации СА 125 проведено повторное определение данного маркера. Снижение концентрации в среднем в 3-5 раз отмечено у 9 больных, а у 2-х пациенток концентрация антигена практически не изменилась.

Таким образом, у обследованных пациенток с миомой матки, эндометриозом закономерностей в значениях концентраций, характерных для каждой из изученных патологий не выявлено, а внутри групп наблюдаются большие индивидуальные вариации этого параметра. Следовательно, больным с повышенными цифрами опухолевых маркеров необходимо проводить более углубленное обследование и лечение. Мы согласны с мнением ряда авторов о том, что высокий уровень СА 125, превышающий “критический” в несколько раз, должен рассматриваться как показание к проведению диагностической лапароскопии.

Данный метод может использоваться в комплексной диагностике злокачественных и доброкачес твенных новообразований яичников, служить методом для контроля за эффективностью хирургического вмешательства.

ПРИМЕНЕНИЕ ПОЛИОКСИДОНИЯ В ЛЕЧЕНИИ БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Короткова О.В.. Заботина Т.Н., Артамонова Е.В., Манзюк Л.В.

Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва, Россия

Внедрение комплексных методов лечения при раке молочной железы, в частности хирургических и химиолучевых, приводит к усилению иммунодефицитов, характерных для опухолевого процесса. Повышение эффективности терапии рака молочной железы и улучшение качества жизни данного контингента больных диктует необходимость направленной иммунокоррекции.

Цель исследования: изучить иммуномодулирующее действия полиоксидония при сочетанном применении с адъювантной химиотерапией и химиолучевой терапией у больных раком молочной железы после радикального хирургического лечения.

Материалы и методы: иммунологическое обследование проведено у 40 больных, которые были рандомизированы методом блоковой рандомизации на две группы. 1 группа получала химиотерапию по схеме FAC или FAC + лучевая терапия; 2 группа получала в интервалах между курсами аналогичной терапии полиоксидоний по 0,006 г в/м через день с 3-го по 19 дни. Оценку клеточного иммунитета проводили по экспрессии на лимфоцитах периферической крови антигенов CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, CD20, CD16, HLA-DR, CD38, CD1 lb, CD50, CD71, CD95, CD25 методом проточной цитофлюориметрии.

Результаты: отклонения в показателях иммунного статуса наблюдались в 25% случаев и выражались в снижении общего числа Т-лимфоцитов (CD3\ CD5+, CD7+), в дисбалансе основных субпопуляций Т-клегок (CD4\ CD8*), а также в изменении количества CD 16+лимфоцитов. В контрольной группе на фоне терапии у 8 из 20 больных выявлено значительное снижение исходно нормального числа CD3+ лимфоцитов с 65,0±,5% до 46,8±1,3% , CD4+ с 46,3±1,8% до 33,1±1,0%; падение уровня CD 16^ клеток отмечено у 10 из 20 больных с 22,6± 1,1% до 11,6± 1,3%. У 7 из 20 пациентов, получавших полиоксидоний, зарегистрировано повышение исходно сниженных параметров до нормальных значений CD3* клеток с 51,2±1,4% до 66,9±1,5%, CD4* с 27,6±0,9% до 42,5±0,8%; у 9 из 20 больных - повышение уровня CD 16 с 10,7±0,7% до 18,4±0,5%. В то же время в контрольной группе не наблюдалось ни одного случая восстановления этих иммунологических показателей. Отрицательного эффекта от проведенной терапии полиоксидонием не отмечено ни в одном случае.

Выводы: предварительные результаты свидетельствуют о положительном иммуномодулирующем эффекте полиоксидония у больных раком молочной железы на фоне химиотерапии. Аналогичные данные нами были получены ранее у больных лимфогранулематозом, подвергшихся высокодозной полихимиотерапии с последующей трансплантацией клеток предшественников гемопоэза.

ДЕЙСТВИЕ ПОЛИДАНА НА ИММУНИТЕТ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ СО ВТОРИЧНЫМИ ИММУНОДЕФИЦИТНЫМИ СОСТОЯНИЯМИ, ВЫЗВАННЫМИ ХИМИОЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИЕЙ

Кузьмина Е.Г., Ненрнна Г.С., Сироткина Н.П., Ватин О.Е., Крикунова Л.И.

Медицинский радиологический научный центр РАМН, Обнинск, Россия

Введение. Одним из осложнений комбинированной химиолучевой терапии является развитие у больных вторичных

иммунодефицитных состояний (ВИДС), затрудняющих проведение лечения в полном объеме и значительно отягощающих состояние пациентов между курсами терапии. Поэтому поиск и включение в схему лечения онкологических больных препаратов, улучшающих состояние иммунитета, является актуальным. В качестве потенциального иммуностимулятора исследовано действие полидана, стимулирующего продукцию и дифференцировку клеток-предшественников. Исследования выполнены на базе гинекологического отделения и лаборатории клинической иммунологии МРНЦ РАМН.

Целью исследования явилась оценка действия на иммунитет полидана, примененного у больных с онкологическими заболеваниями гинекологического профиля с ВИДС, индуцированными лучевой и полихимиотерапией, ПХТ.

Материал и методы. Обследовано 18 больных раком шейки и тела матки, яичников через 1 мес - 5 лет после проведения комбинированного лечения или сочетанной лучевой терапии в возрасте от 40 до 65 лет. Больные получали поли-дан по 75 мг в/к или в/м первый раз в день перед началом и 2-й раз через день после начала очередного курса ПХТ или гамма-терапии. Обследование больных проводили 3 раза: до приема полидана, через 5-7 дней, и через 3-5 недель после приема полидана. Первую контрольную группу (без полидана, исторический контроль) составили 45 пациентов с аналогичными заболеваниями, лечившиеся в предыдущие годы в клинике МРНЦ РАМН по аналогичным схемам без применения полидана близкие по возрастному составу. Во вторую группу контроля вошли данные состояния иммунитета 56 практически здоровых людей в возрасте от 35 до 65 лет.

В периферической крови оценивали число циркулирующих лейкоцитов, численность и функциональное состояние основных классов лимфоцитов. Определяли Т-клетки (общие, CD3+), хелперы-индукторы (CD4+), супрессоры-килле-ры (CD8*), активированные Т-клстки (CD3+ HLA-DR+), реакцию бластной трансформации Т-клеток (РБТЛ) индуцированную ФГА), В-клетки (CD19+), уровни сывороточных иммуноглобулинов (ИГ) классов М, G, А, циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК), НК-клетки (CD16+56*), их ци-тотоксический индекс (ЦИ). Использовали моноклональные антитела фирмы Becton Dickinson и проточную цитофлюо-риметрию (FACScan). Оценивали состояние фагоцитарной функции нейтрофилов по отношению к микробной культуре St. aureus.

Результаты. В исходном статусе общей группы больных выявлено вторичное иммунодефицитное состояние, обусловленное предшествующей агрессивной терапией и характеризующееся лимфоцитопениен, низкой численностью Т- , В- и НК- клеток, снижением функции Т-лимфоцитов, активацией фагоцитоза и функции В-лимфоцитов.

Действие полидана при регистрации эффекта через 5-7 дней после его применения показало более раннее начало восстановления иммунного статуса больных. Оно осуществляется благодаря выходу в циркуляцию большего числа нейт-рофильных лейкоцитов и лимфоцитов, преимущественно относящихся к Т-ряду, имеющих маркеры CD4+ и осуществляющих хелперную и индукторную функции, и усиление РБТЛ Т-клеток. К эффектам полидана, зарегистрированным через 3-5 недель после курс терапии, можно отнести сохранение более высоких темпов восстановления численности Т-хелпе-ров, способствующее оптимизации соотношения иммуноре-гуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов. иммунорегулятор-ного индекса.

Заключение. Обосновано применение полидана на фоне курса ПХТ или гамма-терапии в программах комбинированного лечения онкологических больных. Полидан оказывает

мягкое иммуностимулирующее действие и снижает проявления виде.

В-ЛИНЕЙНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ЭКСПРЕССИИ ОНКОГЕНА TEL-AML1 ПРИ ОСТРЫХ ЛЕЙКОЗАХ У ДЕТЕЙ

Кустанович А.М.. Савицкая Т.В., Липам Н.В., Буглова С.Е., Белевцев М.В., Потапнев М.П.

Республиканский научно-практический центр детской онкологии и гематологии, Минск, Беларусь

Злокачественная трансформация лимфобластов определяется мутациями генов, в норме функционирующих в клег-ках-предшествснницах кроветворной и иммунной систем. Наиболее распространенной транслокацией при детских острых лимфобластных лейкозах (ОЛЛ) является транслокация t(12;21) (pl3;q22), которая приводит к формированию химерного онкогена TEL-AML1 и выявляется в 25% (15-35%) В-линейных ОЛЛ. Это пример мутации с участием гена AML1 (CBFa) (AML1- acute myeloid leukemia), найденной при лимфолейкозах. Обычно транслокации с участием гена АМН (t(3;21), t(8;21), t(17;21), t(l;21) и др) выявляются преимущественно при остром миелобластном лейкозе.

Целью данного исследования было определение линейной (Т-,В- или миелоидной) специфичности экспрессии гена TEL-AML1 в лейкозных клетках, полученных от больных с острым лейкозом.

Методы. Гнездная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией для выявления экспрессии гена TEL-AML1 выполнялась с использованием РНК, выделенной по методике Chomczhinski & Sacchi (1987) из ядерных клеток костного мозга и/или периферической крови, полученных от детей с ОЛ. Иммунофенотипическая характеристика лейкозных клеток проводилась методом двухцветной проточной цитофлуориметрии с использованием панели, включающей 25 типирующих моноклональных антител. Статистическая обработка проводилась по критерию Мапп-Whitney с использованием пакета статистических программ Statistica (StatSoft).

Результаты и обсуждение. Были проанализированы опухолевые клетки 97 пациентов с В-линейным ОЛЛ, 14 - с Т-линейным ОЛЛ и 18 - с ОМЛ. Экспрессия онкогена TEL-AML1 отсутствовала в лейкозных клетках при ОМЛ (18 обследованных образцов) и Т-линейных ОЛЛ (14 образцов). При В-ли-нейных ОЛЛ вывление TEL-AML1 было ограничено лейкоз-ными клетками с common- и пре-В-иммунофенотипом (14 TEL-AMLl-позитивных образцов из 90 обследованных -15,5%). Образцы костного мозга от 7 пациентов с про-В-ОЛЛ были TEL-AML1-негативными.

Учитывая, что исследованный онкоген выявляется в лейкозных В-клстках не всех стадий дифференцировки, мы провели анализ гено-фенотипических связей по линейно- и стадийноспецифичным фенотипическим маркерам. Для этого выделили группы В-линейных ОЛЛ с TEL-AML1-позитивными и TEL-AML1 негативными лейкозными клетками. Было показано, что выявление онкогена достоверно связано с коэкспрессией CD13 (pcO.OOOl), CD117(р<0.05 ) и CD33 (р<0.05).

Полученные данные указывают на то, что экспрессия онкогена TEL-AML1 ограничена В-линейным иммунофенотипом лейкозных клеток и ассоциирована с коэкспрессией мие-ломаркеров CD 13, CD33HCD117.

ЦИТОКИНЫ В СЛЕЗНОЙ ЖИДКОСТИ БОЛЬНЫХ УВЕАЛЬНОЙ МЕЛАНОМОЙ

Лихваццева В.Г.. Слепова О.С.

Научно-исследовательский институт глазных болезней имени Гельмгольца, Москва

Увеальная меланома (УМ) относится к редким внутриглазным злокачественным, как правило, монокулярным опухолям, угрожающим не только зрению, но и жизни пациентов.

Цель работы - изучение системной и местной продукции цитокинов у больных с различными стадиями УМ.

Материалы и методы. Исследовали (ИФА) продукцию TNF-a, IL-6, 1L-6sR, IL-8, 1L-4, IL-1 (3, IL-10, IFNa и IFNy в сыворотке крови (CK) и слёзной жидкости (СЖ) обоих глаз -больного (БГ) и парного здорового (ПГ)- у больных с УМ.

Результаты. Было установлено, что уже на начальных стадиях УА/был нарушен синтез белков-регуляторов иммунного ответа, в частности, снижена продукция цитокинов, отвечающих за индукцию противоопухолевого иммунитета на уровне больного глаза. Прежде всего, это касалось TNF, который выявлялся крайне редко (8,3%) и на низком уровне (Мср.= 24,6 ±11,2 пкг/мл, при норме -12,3% и Мер. =69,3±12,7 пкг/ мл), 1L-8 (87% и Мср.237,0±88,0 пкг/мл при норме 100% и Мср.=529±126 пкг/мл). IFNa, обладающий антипролифера-тивным действием, IL-1 (3 - регулятор АГ-презентирующих функций макрофагов не обнаруживались ни в одной из проб СЖ БГ. Вместе с тем, имело место, по-видимому, компенсаторное усиление секреции других цитокинов с антипролифе-ративными свойствами: IFNy (100%, Мср.= 12000± 1800 пкг/ мл при норме 100% и Мср.=7990±900 пкг/мл), 1L-6 (17,4%, Мср.= 1360± 130 пкг/мл) и IL-6sR (76,4%, Мср=306±84 пкг/мл), не обнаруживаемого в норме.

В СЖ парного глаза при начальных УМ отмечалась активизация продукции TNFa, IFNy, IL-8,1L-6, сменившаяся к развитой стадии УМ полным подавлением их секреции и выявлением (в 5%) IL-4. Выявленный феномен можно объяснить как кратковременный противоопухолевый иммунитет на парном органе, обусловливающий раритет билатерализации УМ.

В системной продукции также имел место дефицит TNF (12%, Мср.=21±3 при норме 66,6% Мср.= 1012±229 пкг/мл), IFNa(3%, Мср.=11±3 пкг/мл при норме 55% и Мср.46±17 пкг/ мл), IL-8 обнаруживали чаще (90% против 30% ), но на низком уровне (Мср.=44±12 пкг/мл при норме Мср.= 180±90 пкг/ мл). Показатели IL-6, IL-4, IL-2R.S не отличались от контроля.

Развитые стадии УМ отличались активизацией продукции в СЖ Б Г TNF (18%, Мер. 39±12 пкг/мл), 1L-8 (100%, Мср.=2181±301 пкг/мл), IFNy (100%, Мср.=57000±3500 пкг/ мл), IL-6sR (70%, Мср.=664±210 пкг/мл), 1L-6 (30%, Мср.=890±236 пкг/мл). Мы расценили это как попытку местного иммунитета наладить противоопухолевую защиту на уровне глаза. Однако, исходные дефекты, мешали развитию адекватной реакции.

Сходные реакции наблюдали в системной продукции: в СК повышались уровни TNFa (23%, Мср.=77±23 пкг/мл), IFNa (274±31 пкг/мл) IL-8 (20%, Мср.= 168±42 пкг/мл), IL-6 (12%, 131±45 пкг/мл), IL-4 (10%, 270±101 пкг/мл), IL-10 (20%, Мср.=20,0±2 пкг/мл).

Поздняя и генерализованная стадии УМ характеризовались глубоким местным дефицитом TNF (0%), подавлением продукции IFNy(25%, Мср.7000±260 пкг/мл) IL-8 (33.3%, Мср.121±24 пкг/мл), появлением в СЖ IL-10 (ч.в.-75% при Мср.=81,3±26,6 пкг/мл) - супрессора иммунного ответа.

Прогрессирование опухоли сопровождалось дальнейшей

разбалансировкой в сети цитокинов на уровне системной продукции. Глубокий дефицит TNF протекал на фоне выброса в кровоток поочередно вначале IFNa (до 750 пкг/мл), а затем IFNy (до 96000 пкг/мл) и IL-8.

На всех стадиях опухолевого роста не выявляли в СК и СЖ IL-2 и 1L-1(3, ключевые цитокины, определяющие характер и амплитуду иммунного (противоопухолевого) ответа.

Выводы. 1. Снижение на начальных стадиях УМ продукции TNF, IFNa, IL-8 - цитокинов, регулирующих запуск различных механизмов противораковой защиты, может служить причиной дефектов в системе местного противоопухолевого иммунитета и способствавать прогрессированию.

2. Кинетика продукции IFNy, IL-8, IL-10, IL-6/IL-6Rs на различных стадиях УМ свидетельствует о развитии глубокого дисбаланса в системе цитокинов в целом и разобщении межклеточного взаимодействия на уровне местных факторов иммунной, в том числе и противоопухолевой, защиты органа зрения.

ЭКСПРЕССИЯ ВАСКУЛЯРНОГО ЭНДОТЕЛИАЛЬНОГО РОСТОВОГО ФАКТОРА И ТИМИДИН ФОСФОРИЛАЗЫ ПРИ МЕСТНО-РАСПРОСТРАНЕННОМ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Лукашина М.И.. Жукова Л.Г., Озерова О.А., Барышников А.Ю.

Российский Онкологический Научный Центр им.Н.Н.Блохина РАМН,

Москва, Россия

Васкулярный эндотелиальный ростовой фактор (VEGF) является активно исследуемым ангиогенным и потенциально прогностическим маркером при различных типах опухолей. Тимидин фосфорилаза (TPh), играющий важную роль при синтезе ДНК de novo, является предполагаемым ангиогенным фактором.

Цель: 1) определить частоту экспрессии VEGF на эндотелиальных и опухолевых клетках, TPh в опухолевой и окружающей тканях при раке молочной железы (РМЖ); 2) оценить прогностическое значение маркеров при данной опухоли.

Материалы и методы. Экспрессию VEGF и TPh определяли иммуногистохимическим методом на парафиновых блоках операционного материала, полученного от 50 больных РМЖ, проходивших лечение в 94-98 годах в РОНЦ им.Н.Н.Б-лохина. Критерии оценок уровня экспрессии маркеров: а) на опухолевых клетках - интенсивность окраски + количество окрашенных опухолевых клеток = балл. Если балл был более

3, опухоли считали позитивно-экспрессирующими; б) TPh в прилежащей ткани - среднюю и сильную интенсивность окрашивания оценивали положительно; в) VEGF на сосудах -более трех окрашенных сосудов в поле зрения определяли как положительную реакцию.

Результаты. Гиперэкспрессия VEGF была обнаружена в 54.0% (27/50) случаев РМЖ на опухолевых клетках и 62.0% (31/50) тех же больных на эндотелиальных клетках кровеносных сосудов. Анализ выживаемости показал, что экспрессия VEGF на опухолевых клетках не имела статистически значимого влияния на безрецидивную (БРВ) и общую выживаемость (ОВ) больных РМЖ. В группе пациентов с положительной экспрессией VEGF на эндотелиальных клетках наблюдали лучшие результаты БРВ по сравнению с отрицательной группой (р=0.04); при анализе ОВ статистически значимых различий не обнаружено. Экспрессия TPh была определена в 67.3% (33/49) случаев РМЖ в опухолевой ткани и 71.4% (35/49) тех

же больных в прилежащей ткани. Выявление TPh в опухолевой ткани коррелировало с выживаемостью таких больных: БРВ и ОВ были хуже у больных с положительной экспрессией TPh (р=0.05 и р=0.07, соответственно). В ткани, окружающей опухоль, экспрессия данного маркера значения не имела. Проведенный корреляционный анализ не обнаружил взаимосвязи между двумя исследованными маркерами при местнораспространенном РМЖ.

Заключение: представленные нами данные (экспрессия TPh в опухоли и VEGF на эндотелиальных клетках) говорят о возможном использовании этих маркеров как прогностических при местно-распространенном РМЖ.

ЭКСПРЕССИЯ АПОПТОТИЧЕСКИХ БИОМАРКЕРОВ BCL-2, ВАХ И CD95 НА В-КЛЕТОЧНЫХ СУБПОПУЛЯЦИЯХ ПРИ ЛИМФОПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

Лысюк Е.Ю.. Логачева Н.П., Полосухина Е.Р., Шишкин Ю.В., Барышников А.Ю.

Российский Онкологический Научный Центр им.Н.Н.Блохина РАМП

Целью нашей работы было изучение роли апоптотичес-ких биомаркеров при онкогематологических заболеваниях В-клеточного происхождения. Как известно, большинство таких заболеваний развивается в результате неконтролируемой пролиферации субпопуляций В-клсток, поэтому данные заболевания удобно использовать в качестве моделей для изучения В-лимфоцитов на различных стадиях дифференциров-ки.

В периферической крови 66 больных хроническим лим-фолейкозом (61% леченых и 39% первичных больных) мы исследовали экспрессию онкобелков Вс1-2, Вах и CD95 рецептора. Экспрессия Вс1-2 и CD95 изучалась также в костном мозге 13 детей и 15 взрослых больных с острым лейкозом (ОЛ) и у 19 больных множественной миеломой (ММ). Исследование проводилось методом проточной цитофлуориметрии (ци-тофлуориметр FACScalibur, Becton Dickinson) с использованием моноклональных антител к белкам Bcl-2 (DAKO, Clone 124), Вах (lmmunotech) и CD95 (МедБиоСпектр, ICO-160).

Высокая экспрессия Вс1-2 наблюдалась в обеих группах больных хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ): 14/20 (70%) и 28/33 (85%) больных в первичной и леченой группах соответственно. У леченых больных (ЛБ) при ремиссии, что выражалось в нормальном лейкоцитозе, нормальных размерах лимфоузлов и т.д., экспрессия Вс1-2 была отрицательна в большинстве случаев. В том случае, если ремиссия не была достигнута, то есть сохранялся повышенный лейкоцитоз и другие признаки, сохранялся высокий уровень экспрессии Bcl-2. У 3 из 5 первичных больных с повышенным лейкоцитозом наблюдалось повышенное соотношение Bcl-2/Bax (1,2-1,3), в то время как у больных с нормальным лейкоцитозом это соотношение было близко к нормальным значениям (0,04-0,2). В группе ЛБ соотношение Bcl-2/Bax составляло 0,5-0,8 однако у 4 из 5 леченых больных, у которых исследовали это соотношение, наблюдалась клиническая ремиссия (нормальное количество лейкоцитов), но сохранялась высокая экспрессия Вс1-2. Такие больные требуют дальнейшего исследования в динамике, так как, возможно, сохранение экспрессии Вс1-2 может быть признаком быстрого рсцидивирования. Также у больных ХЛЛ мы наблюдали небольшое усиление экспрессии CD95 после лечения.

При детских ОЛ мы обнаружили только 3 Bcl-2-положи-тельных случая (23%) и ни одного Bcl-2-положительного слу-

чая при 0J1 у взрослых. При ММ повышенная экспрессия Вс1-2 выявлялясь у 2/14 (14%) больных. Положительная экспрессия CD95 была обнаружена у 8/18 (44%) больных.

Таким образом, клетки больных XJIJI, которые происходят из зрелых В-лимфоцитов, экспрессируют белок Вс1-2, и существует корреляция между количеством лейкоцитов в крови и уровнем экспрессии Вс1-2. Экспрессии Вс1-2 на предшественниках В-лимфоцитов и на плазматических клетках не наблюдалось.

ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ МТТ-ТЕСТА ДЛЯ ОЦЕНКИ ОТВЕТА БОЛЬНЫХ ОСТРЫМИ ЛЕЙКОЗАМИ НА ХИМИОТЕРАПИЮ

Мицкевич П.Б., Потапова С.М.. Ибрагимова Ж.А., Мыслицкий В.Ф., Усс Е.В.

Республиканский центр трансплантации костного мозга 9 ГКБ, НИИ гематологии и переливания крови, г. Минск, Беларусь

Основной проблемой лечения лейкозов остается невозможность предсказать ответ на химиотерапию у конкретного больного. Хотя к настоящему времени предложены и используются десятки противолейкозных препаратов, открытым остается вопрос о назначении наиболее оптимальной их комбинации.

Еще в начале 60-х годов в экспериментальной онкологии для оценки чувствительности опухолевых клеток к химиотерапевтическим агентам были использованы методы обработки клеток лекарственным препаратами in vitro (Bruce W., 1966). Такой подход к “глобальной” оценке химиочувствителыюсти представляется весьма перспективным и, главное, технически доступным в рутинной клинической практике, но пока не позволил придти к однозначным выводам относительно прогностического значения.

Цель исследования - изучить химиочувствительность опухолевых клеток in vitro МТТ-методом у больных острыми лейкозами и определить прогностическое значение данного подхода для оценки эффективности химиотерапии.

Материалы и методы. В исследование были включены 27 пациентов в возрасте от 18 до 65 лет с впервые установленным диагнозом острого лимфобластного лейкоза (OJIJ1) и острого нелимфобластного лейкоза (OHJ1J1). Диагноз был установлен в соответствии с Франко-Амери-кано-Британской классификацией. Исследовались образцы костного мозга и периферической крови, содержащие не менее 50% бластных клеток. Выживаемость лейкозных клеток, инкубированных с

6 различными концентрациями цитостатических препаратов определяли МТТ-методом. Высчитывали концентрацию препарата, приводящую к гибели 50% клеток (LC50).

Результаты. В результате проведенного исследования выявлено несколько закономерностей, важных с точки зрения возможности прогнозирования ответа in vivo на химиотерапию.

Во-первых, при изучении степени чувствительности лейкозных клеток к цитостатическим препаратам в зависимости от ответа больных OHJ1JI и OJTJT на химиотерапию установлено, что у больных OHJ1J1 LC50 доксорубицина и цитараби-на (медиана 0,26 мкг/мл, р<0,05 и 0,14 мкг/мл, р<0,02) достоверно ниже в группе больных ответивших иа терапию, но сравнению с больными, у которых ремиссия не была достигнута после 2-х курсов химиотерапии (медиана 1,35 и 9,33 для доксорубицина и цитарабина, соответственно).

Во-вторых, у больных ОЛЛ также отмечена достоверная разница в чувствительности лейкозных клеток к L-аспараги-назе, винкрисгину и преднизолону в группах ответивших на терапию, и не ответивших на терапию.

В-третьих, для решения вопроса о том, могут ли данные по оценке химиочувствительности in vitro быть использованы в качестве прогностических критериев оценки ответа больного на химиотерапию in vivo, мы провели бальную оценку чувствительности лейкозных клеток больных ОНЛЛ и ОЛЛ к цитостатическим препаратам in vitro и ответа больных на терапию in vivo (Астрелина Т.А.,2001). Следует подчеркнуть, что именно применение бальной (ранговой) оценки позволило решить проблему сопоставления эффекта цитостатиков, обладающих различным концентрационным диапазоном активности in vitro, с эффектом терапии in vivo. Таким образом, в изученной группе больных ОНЛЛ сравнение чувствительности лейкозных клеток к химиопрепаратам in vitro и in vivo показало хорошее совпадение результатов у практически всех изученных больных. Т.е. если клетки больного были отнесены к “чувствительным” по результатам теста in vitro, то у них, как правило, наблюдался хороший ответ на индукционную терапию и регистрировалась гематологическая ремиссия. И наоборот, если клетки больного были резистентны к цитостатику in vitro, то в изученной группе больных не наблюдалось ремиссии при терапии данным(и) препаратом (или препаратами). Близкие результаты были получены нами и в группе больных ОЛЛ. Из 10 изученных больных, у 7 наблюдалось полное совпадение результатов, полученных in vitro, с результатами ответа больного на терапию in vivo.

Таким образом, результаты тестирования лейкозных клеток на чувствительность к химиопрепаратам in vitro МТТ-методом могут иметь прогностическое значение для оценки эффективности проводимой химиотерапии.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЕПТИДНЫХ ФАГОВЫХ БИБЛИОТЕК ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ, СПЕЦИФИЧНЫХ К ОПУХОЛИ ЭРЛИХА

Некрасов Б.ГЛ Кувшинов В.Н.1, Ушакова Т.А.', Каледин В.И.2, Ни кол ип В.П.2, Малкова Е.М.1, Туманова О.Ю.1, Ильичев А.А.1

; ГНЦВБ ‘‘Вектор", п. Кольцово, Новосибирская обл.,

2Институт цитологии и генетики,

Новосибирск, Россия

Системное лечение диссеминированных злокачественных опухолей основано на применении цитотоксической химиотерапии. Однако используемые в настоящее время химиопрепараты обладают токсическим действием на нормальные ткани. Проблема может быть разрешена селективной доставкой циготоксических препаратов непосредственно в опухоли. Таким образом, токсические препараты могут стать более безопасными и эффективными, что и объясняет особый интерес к поиску опухоль-адресованных лигандов, которые могут использоваться для адресной доставки лекарственных препаратов и диагностических агентов.

Цель исследования заключалась в получении с помощью пептидных фаговых библиотек опухоль-специфических пептидов, которые могут использоваться для адресной доставки лекарственных препаратов и диагностических агентов. В качестве экспериментальной модели использовалась опухоль Эрлиха

Результаты. Для селекции пептидов, специфически взаимодействующих с опухолью Эрлиха была использована фаговая пептидная библиотека, содержащая все возможные пептиды длиной 15 а.о., экспонированные на поверхности бактериофагов в составе белка pill. Фаговую библиотеку в количестве 10° фаговых частиц (TU - трансдуцирущих единиц) вводили в хвостовую вену мышам с привитой опухолью Эрлиха.

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ПО ТКАНЯМ ФАГОВ, НЕСУЩИХ ОПУХОЛЬ-СПЕЦИФИЧНЫЕ ПЕПТИДЫ

№ клона Пептид, экспонированный на поверхности фага Опухоль Tu/mg Мышца Tu/mg Легкое Tu/mg

Fuse2 - - - -

1 GGSACTGSAFGSVCW 3x103 -

2 LFSHHDTWSLGARWV 5x103 - -

3 GRTGPGGPACPAVRA 1.5x104 - -

4 RYRVGFTPGTIAAVL 2.7x104 - -

Через несколько минут мышей забивали под анестезией и выделяли опухолевую ткань, на которую вели селекцию. Опухоль гомогенизировали, отмывали от не связавшихся фагов, а связавшиеся фаги после амплификации в E.coli повторно вводили мышам. В результате трех раундов селекции из пептидной фаговой библиотеки, были отобраны опухоль-специфич-ные пептиды. При внутривенной инъекции мышам линии СВА с привитой опухолью Эрлиха селектированные фаги, несущие специфические пептиды, аккумулировались в опухоли в количестве 1-10 тысяч вирионов на мг (Tu/mg) и сохранялись там спустя 24 часа, когда в других органах (легкое и мышца) они не обнаруживались. Контрольный неселективный фаг fuse 2, который не несет на своей поверхности специфического пептида, не обнаруживается ни в опухоли, ни в других органах. С помощью секвенирования соответствующих участков фаговой ДНК по методу Сэнгера была определена аминокислотная последовательность пептидов.

Для локализации отобранных фагов в структуре опухоли было проведено гистохимическое исследование образцов ткани опухоли на парафиновых срезах с использованием кроличьих антител к дикому бактериофагу. В структуре опухоли продукт преципитации антигена накапливается на онкоцитах не имеющих признаков деградации. Специфическое диффузное окрашивание визуализируется в просветах сосудов и новообразованных капилляров.

Заключение. Мы предполагаем, что пептиды, способные доставлять фаги в опухоль могут быть использованы также для адресной доставки лекарственных препаратов и диагностических агентов. В дальнейшем планируется получить конъюгат с противоопухолевым препаратом Доксорубицином и использовать его в модельных экспериментах по лечению мышей с привитой опухолью Эрлиха. Данный подход с использованием фаговых пептидных библиотек может быть использован при разработке новых диагностических и лекарственных препаратов в онкологии.

СТАБИЛЬНОСТЬ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ПОТЕНЦИАЛЬНОГО ИММУНОТОКСИНА VL-БАРНАЗА

Одинцов С.Г.. Цыбовский Я.И., Кедров А.А., Кравчук З.И., Стремовский О.А.*, Баландин Т.Г.*, Деев С.М.*,Марцев С.П.

Институт биоорганической химии НАН Беларуси, Минск, Беларусь, *Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, Россия

Введение. Иммунотоксины представляют собой новый класс “химерных” молекул, сконструированных для цитогок-сической терапии рака. Структура иммунотоксинов включает по меньшей мере два основных фрагмента: узнающий и

токсический. Узнающий фрагмент служит для направленной доставки токсина к клеткам опухоли и содержит антигенсвя-зывающие домены антитела, направленного к определенному опухолевому маркеру. В качестве цитотоксического фрагмента используются токсины различных организмов, в том числе РНКазы, например барназа из Bacillus amyloliquefaciens. Одним из опухолево-ассоциированных маркеров является ферритин, который экспонирован на поверхность клеток опухоли при некоторых видах рака, таких как миелоидная лейкемия, лимфогрануломатоз, гепатоцеллюлярная карцинома. Ранее мы показали, что индивидуальный VL домен моноклонального антиферритинового антитела F11 способен связывать антиген и поэтому представляет собой минимальный антигенсвязывающий фрагмент данного антитела.

Цель работы. Оценить возможность использования химерного белка VL-барназа, сконструированного на основе VL домена мышиного моноклонального антитела F11, направленного к ферритину селезенки человека, и барназы, бактериальной РНКазы, в качестве иммунотоксина путем анализа анти-генсвязывающей и РНКазной активностей а также стабильности in vitro.

Материалы и методы. Клетки Е. coli BL21(DE3) трансформировали плазмидой, сконструированной в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва. Химерный белок получали в растворимой фракции клеточного лизата. Очистка белка производилась при помощи аффинной хроматографии на колонке с Ni-NTA сефарозой в присутствии 6М мочевины. Рефолдинг проводили путем диализа против буферного раствора, не содержащего денатуранта. Конформацию VL-барназы анализировали флуоресцентной спектроскопией, как собственной, так и в присутствии флуоресцентного зонда АНС. Стабильность химерной конструкции изучали, измеряя концентрацию белка и активности обоих фрагментов молекулы после икубации при 37°С в течение различных промежутков времени.

Основные результаты. Рекомбинантный белок VL-барназа получен в растворимом виде с высоким выходом и чистотой более 95%. Его локализация в растворимой фракции клеточного лизата позволяет сделать вывод о шапероноподобной функции барназного фрагмента, повышающего растворимость VL домена, который в свободном виде (без барназы) формирует тела включения. В растворе VL-барназа существует в виде димера, что связано с известной тенденцией VL доменов к димеризации. Константа ассоциации с ферритином составляет 2.8х107, что незначительно отличается от параметра афинности изолирован-ронного VL домена (4Т07). РНКазныс активности химерного белка и индивидуальной барназы близки. По данным флуоресцентной спектроскопии, VL-барназа обладает полностью компактной третичной структурой, типичной для правильно фол-дированных белков. При инкубации в буферном растворе при 37°С время полуинактивации составило 35 часов.

Заключение. В составе химерного белка барназа проявляет шапероноподобные свойства. Рекомбинантный химерный

белок VL-барназа обладает сформированной пространственной структурой и сохраняет активность обоих фрагментов, узнающего и цитотоксического. В совокупности с высокой стабильностью, это обуславливает его потенциальную применимость в качестве иммунотоксина. С другой стороны, димерная форма молекулы увеличивает молекулярную массу и потенциальную иммуногенность при повторных введениях in vivo.

АНАЛИЗ ВЗАИМОСВЯЗИ ЭКСПРЕССИИ CD71, CD95 И HLA-DR НА ЛИМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЖЕЛУДКА В КАРЕЛИИ

Олейник Е.К.. Шибаев М.И., Олейник В.М., Толстогузова Т.И.

Институт биологии Карельского научного центра РАН, г. Петрозаводск, Россия

Рак желудка занимает одно из первых мест по заболеваемости и смертности среди всех злокачественных опухолей в Карелии. В 2001 году в нашем регионе при первичном обращении у каждого третьего больного раком желудка выявлялась IV стадия заболевания. Таким образом, рак желудка является одной из наиболее актуальных медицинских и социальных проблем в Карелии. В связи с этим назрела необходимость изучения особенностей течения данного заболевания и поиск способов ранней диагностики.

Нет сомнения в том, что у больных раком желудка существует нарушение функций иммунной системы. Но до сих пор нет единого мнения о механизмах формирования иммунологической недостаточности при данной патологии. Изучение состояния функциональной активности иммунной системы и выявление особенностей иммунологической реактивности позволит определить подходы для более ранней диагностики и последующего мониторинга больных раком желудка.

Целью настоящей работы явилось изучение функционирования иммунной системы по уровню активации лимфоцитов периферической крови больных раком желудка, проживающих в Карелии, и анализ взаимосвязи экспрессии активационных маркеров (CD25, CD71, CD95, CD98 и HLA-DR).

Материалом исследования служили лимфоциты периферической крови 66 больных раком желудка и 18 здоровых доноров из различных районов республики Карелия. Уровень экспрессии активационных маркеров оценивали методом непрямой иммунофлюоресценции с помощью моноклональных антител.

В результате исследования было выявлено значительное усиление экспрессии CD71 и CD95 на лимфоцитах периферической крови больных с опухолями желудка (18.64± 1.93 и 18.22±2.10) по сравнению с контрольной группой (8.55±4.06 и 8.00±4.60) (р<0.05).

Был проведен анализ взаимосвязи экспрессии активационных маркеров в группах больных с исходно высоким (>25%) и низким (< 10%) уровнями CD71, CD95 и HLA-DR на лимфоцитах периферической крови онкологических больных. У лиц с низким уровнем СБ95+лимфоцитов отмечалось снижение экспрессии CD25, CD71 и CD98 по сравнению с группой больных с высоким уровнем CD95: 14.72±3.25 и 29.36±4.39; 12.86±3.64 и 24.38±3.64; 11.61±3.92 и 19.54±4.65 (р<0.05).

Подобная закономерность отмечалась и в группах больных с различным уровнем экспрессии CD71 (таблица).

В группах больных с крайними показателями уровня HLA-DR+лимфоцитов значительных различий в экспрессии остальных активационных маркеров не наблюдалось.

Таким образом, на лимфоцитах периферической крови больных раком желудка выявлено усиление экспрессии CD71 и CD95. При этом повышение уровня лимфоцитов CD71 * и CD95’ сопровождалось увеличением экспрессии CD25 и CD98.

ГМДП ПОТЕНЦИИРУЕТ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ TNF-cx И ЦИТОСТАТИКОВ НА ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ

Петрова Е.Э.. Валякина Т.И., Несмеянов В.А.

Институт биоорганической химии

им. М. М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова, РАН,

Москва, Россия

Введение. Несмотря на большие успехи химиотерапии в лечении онкологических заболеваний, рецидивы злокачественных заболеваний остаются основной причиной смерти этой категории больных даже при использовании высокодозовой терапии. Для усиления противоопухолевого эффекта дальнейшее увеличение дозы химиотерапевтических препаратов не представляется возможным из-за высокой органотоксичности. В связи с этим получает распространение комбинаторный подход, в котором основным моментом является рациональное сочетание химиотерапии и иммуномодуляторов, позволяющее снижать дозу вводимого цитотоксического агента. К числу таких иммуномодуляторов относятся мурамил-пептиды, в том числе. N-ацетилглюкозаминилмурамоилди-пептид - ГМДП.

Цель и задачи. Целью настоящей работы явилось изучение потенциирующего действия ГМДП на цитотоксическую активность фактора некроза опухоли (TNF-а) и противоопухолевых агентов цисплатина (ЦП), актиномицина Д (Акт Д) и доксорубицииа (Доке) при их комбинаторном использовании in vivo и in vitro.

Материалы и методы. Определение in vitro цитотоксичности препаратов ГМДП, TNF-a, цисплатина, актиномицина Д и доксорубицииа проводили на культуре клеток L929 и карциномы Эрлиха. Для тестирования активности плотность клеток в лунке 96-луночного планшета составляла 2х104кл. В культуры вносили по 20 мкл исследуемых препаратов, TNF-a в концентрациях от 1000 до 1 ед/мл, ГМДП от 1 до 0,001 мкг/ мл, цитостатиков от 8 до 0,5 мкМ. Цитотоксичность определяли в тесте с МТТ, с трипановым синим, а также в клоногенном тесте.

Оценку in vivo противоопухолевого действия ГМДП, TNF-a и цисплатина проводили на перевиваемой мышиной опухоли - асцитной карциноме Эрлиха. Клетки опухоли имплантировали мышам линии Balb/С. Через сутки вводили внутри-брюшинно 150 мкг ГМДП, 40 мкг ЦП и 5x10'’ ед. рекомбинантного TNF-a. Группа животных, которым вводили одинаковую комбинацию препаратов, включала 11 особей. Оценивали среднюю продолжительность жизни и выживаемость

Таблица.

CD71 CD25 CD95 CD98 HLA-DR

<10% 15.41 ±3.13 12.04±3.58 12.04+2.90 20.23±4.21

>25% 29.64+4.48 24.87±4.18 20.71 ±3.70 17.69+3.34

2002, Т. 4, №2

Оико иммун ол огия

Основные результаты. На клетках линии мышиной фиб-росаркомы L929, чувствительных к цитотоксическому действию TNF-a, в тесте с МТТ показали, что при совместном введении ГМДП и TNF-a в культуру наблюдалось увеличение числа мертвых клеток по сравнению с культурой, обработанной одним TNF-a. В присутствии ГМДП низкая концентрация TNF-a вызывала тот же цитотоксический эффект, что и высокая концентрация в отсутствии мурамилпептида. Степень потенциирующего действия ГМДП прямо коррелировала с его дозой.

В клоногенном тсстс прослеживались тс же закономерности. Однако, более высокая чувствительность теста позволяла регистрировать эффект ГМДП при низкой концентрации TNF-a (0,5 ед./мл), при которой цитотоксическое действие в тесте с МТТ не наблюдалось.

Цитотоксическая активность TNF-a in vitro усиливалась Акт Д. В связи с этим исследовали влияние ГМДП на цитотоксическое действие комбинации TNF-a/Акг Д и одного Акт Д. Совместное действие ГМДП и Акт Д при концентрации 1 мкг/мл, не оказывающей влияния на жизнеспособность клеток L929, приводило к увеличению числа мертвых клеток в культуре. Эффективность действия зависела от концентрации ГМДП.

В комбинации ГМДП с TNF-a и Акт Д мурамилпептид потенциировал цитотоксическое действие TNF-a/Акт Д не менее эффективно, чем действие одного TNF-a.

ГМДП потенциировал также цитотоксическое действие на опухолевые клетки двух других цитостатиков ЦП и Доке. Для достижения равного цитотоксического эффекта в присутствии Г МДП требовались более низкие концентрации цитосгати-ка.

ГМДП потенциировал цитотоксическое действие комбинаций TNF-a/ЦП и TNF-a/Докс. Введение в данные комбинации ГМДП позволяло снижать концентрацию TNF-a в пять раз и обеспечивало 100% гибель клеток фибросаркомы.

Цитотоксический эффект тройной комбинации превосходит действие TNF-a/ЦП в отношение иных, чем L929, TNF-чувствительных клеточных линий, а именно клеток U937, MCF7 и ЕАТ.

При оценке противоопухолевого действия сочетанного введения препаратов ГМДП, TNF-a и ЦП на карциному Эрлиха, имплантированную мышам Balb/С, показали, что выживаемость этой группы животных составили 100%, в то время как аналогичные показатели для контрольных групп мышей были заметно ниже.

Заключение. Показано, что комбинация ГМДП с TNF-a и цитостатиками более эффективно разрушает TNF-a чувствительные опухолевые клетки in vivo и in vitro, чем комбинации TNF-a с цитостатиками в отсутствии ГМДП.

ВОЗМОЖНОСТИ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ПУЛА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СОСТОЯНИЯ ЛИПОПЕРЕКИСНОГО ГОМЕОСТАЗА У ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ПОЛИДАНА

Полуэктова М.В.. Кузьмина Е.Г., Крикунова Л.И., Чиркова Т.В, Тлепшуков И.К .

Медицинский Радиологический Научный Центр РАМН, г. Обнинск, Россия

Серьезным осложнением комбинированного лечения, включающего химиотерапию, лучевую терапию, является развитие лейкопении, что значительно тормозит проведение лечения, либо полностью его отменяет. Важную роль в разви-

тии лейкопении играют процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ), имеющие большое значение для жизнедеятельности любой клетки.

Поиск препаратов, стимулирующих лейкопоэз, и включение таковых в схему комбинированного лечения, является актуальным. Появление препарата полидан, представляющего собой стимулятор продукции и дифференцировки клеток предшественников нейтрофильного ряда, общего количества лейкоцитов, не провоцирующего появление компенсаторной цитопеничсской паузы, привлекло наше внимание. Полидан был апробирован на базе гинекологического отделения Центра.

Целью настоящего исследования явилась оценка действия полидана на лейкопоэз в зависимости от состояния липопе-рекисного гомеостаза у онкологических больных гинекологического профиля на этапе комбинированного лечения.

Задачи исследовани51:

1. Изучить состояние ПОЛ у больных до и после лечения с использованием полидана.

2. Изучить сопряженность изменений показателей липо-перекисного гомеостаза с эффективностью восстановления лейкоцитарного пула.

Материалы и методы По стандартной схеме обследовано 13 больных: рак тела матки - 4 , рак шейки матки -2, рак яичников -5; рак влагалища - 2 . Возраст больных колебался от 40 до 62 лет. Контролем служили данные обследования 30 практически здоровых доноров, средний возраст которых составил 52 года. Полидан применяли на фоне цикла химио-(полихимио) терапии и у-облучения очагов поражения в рамках комбинированного лечения. Полидан вводили 2 раза через деньпо 75 мг в/к или в/м. Кровь исследовали до и после курса лечения.

Продукты ПОЛ определяли в плазме крови, полученной с помощью 0,1% раствора ЭДТА: диеновые коньюгаты (ДК), диенкетоны и триены (КД), изолированные двойные связи (Дв) по Волчсгорскому И.А., малоновый диальдегид (МДА) по Журавлеву, активность каталазы - по Королюк М.А.; общая антиоксидантная активность плазмы (ОАА) по Промыслову М.Ш., Димук М.Л., содержание средних молекул (СМ) по Габриелян Н.И.. Уровень лейкоцитов определяли на гемана-лизаторе “Бузглех НЕ-7000”. Больные подразделены на три группы: 1 группа-с нормальным уровнем лейкоцитов до и после лечения (п=4); 2-е нормализацией после терапии сниженного уровня лейкоцитов (п=6); 3 - с лейкопенией до и после лечения (п=3).

Результаты: До начала лечения у больных общей группы отмечается активация ПОЛ: уровень первичных и вторичных продуктов значительно превышает контроль (ДК - в 1,5 раза, КД- в 5-7 раз). Состояние антиперекисной системы нестабильно, несмотря на повышение активности каталазы, снижается ОАА плазмы на 28%. Подобные нарушения ПОЛ часто встречаются при онкопатологии. Проводимое лечение полиданом на фоне комбинированной терапии оказывает мягкое стабилизирующее действие на систему липоперекисного гомеостаза больных (снижается уровень КД изопропиловой фракции, усиливаются антиперекисные процессы на 20%). Лейкопения до лечения отмечена у 9 больных из 13 (70%). После комбинированной терапии с применением полидана она наблюдалась только у 3 больных - 23%. После лечения уровень первичных и вторичных продуктов ПОЛ у больных 3 группы значительно превышал значения тех же метаболитов 1 и 2 групп ( уровень ДК-из., КД-из. - в 3 раза, ДВ-из. - в 2 раза, КД-г. - в 4 раза), а показатели антиоксидан-тной системы были более низкими.

Заключение. Применение полидана в схеме комбиниро-

ванного лечения онкологических больных гинекологического профиля было успешным в 77% случаев от общего числа выборки - уровень лейкоцитов не снижался или возрастал. Особенности состояния ПОЛ и антиоксидантной системы в разных группах позволили выявить условия, при которых реализовалось положительное влияние полидана. Его применение неэффективно при резком усилении ПОЛ.

ВАКЦИНАЦИЯ БЕЛКАМИ ТЕПЛОВОГО ШОКА 70, СЕКРЕТИРУЕМЫМИ КЛЕТКАМИ ЛИМФОМЫ EL4 IN VITRO, ПОДАВЛЯЕТ РАЗВИТИЕ ЭТОЙ ОПУХОЛИ IN VIVO

Пономарёв А.Д.. Гусарова Г.А., Моисеева Е.В., Сапожников А.М.

Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Москва, Россия

Белки теплового шока (БТШ) 70 кДа и 90 кДа обладают выраженными иммуностимулирующими и адъювантными свойствами. Способность БТШ образовывать прочные комплексы со всем репертуаром синтезируемых в клетке пептидов используется для разработки противоопухолевых вакцин на основе таких комплексов. В целом ряде работ было продемонстрировано, что, полученные из разрушенных опухолевых клеток комплексы БТШ70 и БТШ90 с пептидами являются эффективными препаратами для предотвращения роста опухоли в перевиваемых моделях. В данных исследованиях использование клеточного лизата связано с тем, что БТШ являются внутриклеточными протеинами. В то же время известно, что многие линии опухолевых клеток экспрессируют БТШ на своей поверхности. Более того, в литературе имеются сведения о том, что БТШ секретируются рядом клеточных линий в межклеточное пространство. Механизмы экзоцитоза БТШ в настоящее время не изучены, однако наши данные указывают на возможность сбрасывания в межклеточное пространство БТШ, представленных на клеточной поверхности. Действительно, мы обнаружили, что в супернатанте культуры клеток мышиной лимфомы EL-4 присутствуют БТШ70, экспрессирующиеся на цитоплазматической мембране этих клеток. В данной работе мы провели предварительное исследование возможности использования БТШ70, содержащихся в супернатанте культуры клеток лимфомы EL-4, для вакцинации животных в модели перевиваемой опухоли.

Препараты для иммунизации животных получали из кондиционированного супернатанта культуры клеток EL4 с помощью высаливания протеинов сульфатом аммония, последующего диализа и лиофилизации. В экспериментах использовали мышей линии C57BL/6. Иммунизацию мышей проводили дозами препаратов, содержащих 5 или 50 мкг белка. Животные получали две подкожных инъекции препарата с интервалом 7 дней. Через неделю после второй инъекции мышам прививали опухоль. Рост опухоли оценивали с помощью серии измерений ее размеров, проводимых два раза в неделю. Регистрировали также продолжительность жизни мышей-опухоленосителей.

Было установлено, что вакцинация заметно снижает рост опухоли, а в некоторых случаях рост опухоли полностью предотвращается. Существенно, что эффект иммунизации был наиболее выраженным в группе животных, получивших максимальную дозу препарата. Так, средняя продолжительность жизни мышей в контрольной группе составила после прививания опухоли около тридцати дней. Группа животных, про-иммунизированная 5 мкг препарата, имела достоверно боль-

шую среднюю продолжительность жизни (около 50 дней). Половина же третьей группы мышей, получивших максимальную дозу препарата, прожила более 50 дней, а остальная часть этой группы характеризовалась отсутствием опухолеобразо-вания. В дополнение к наблюдениям за ростом опухоли и продолжительностью жизни животных, погибших мышей подвергали вскрытию. У мышей, получавших препарат, отмечалось отсутствие видимых метастазов в печени и легких и очагов инфильтрации подкожной жировой клетчатки, наблюдаемых у всех контрольных животных. В отдельном предварительном эксперименте тестируемый препарат супернатанта продемонстрировал также свою эффективность при лечении уже развившейся опухоли. В этом опыте не проводилось предварительной иммунизации животных данными препаратами. Исходно в опытную и контрольную мышь была привита лим-фома ЕГ-4. После достижения размеров опухоли около 1см в диаметре опытной мыши еженедельно (в течение 3 недель) вводилось по 50 мкг препарата. Реакцией на первое введение препарата было уменьшение размера опухоли на 20-30%. Затем отмечалось выраженное замедление роста опухоли и увеличение продолжительности жизни (до 50 дней) по сравнению с контролем (30 дней).

Таким образом, проведенное исследование указывает на возможность разработки противоопухолевых препаратов на основе БТШ, секретируемых опухолевыми клетками. Полученные результаты являются основанием для расширения исследований в данном направлении.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 00-04-48898).

ДИСБАЛАНС В СИСТЕМЕ ИММУНИТЕТА БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ОПИСТОРХОЗОМ КАК ПРОМОТОРНЫЙ ФАКТОР ПЕРВИЧНОГО ХОЛАНГИОЦЕЛЮЛЯРНОГО РАКА ПЕЧЕНИ

Рыбка А.Г.. Шайн А.А., Степанова ТФ., Кальгина Г.А., Сметанникова М.В.

Тюменская государственная медицинская академия, Научно-исследовательский институт краевой инфекционной патологии, Тюмень, Россия

Введение. Известно, что у больных хроническим опис-торхозом (ХО) первичный холангеоцеллюлярный рак печени (ПХЦРП) возникает значительно чаще, чем среди неинфици-рованного населения. На этом основании ХО рассматривается как факультативный предрак (А.А. Шайн, 1974г.). Многочисленными авторами установлено, что одним из факторов, способствующих развитию злокачественных опухолей, является нарушение механизмов иммунного ответа организма, особенно Т-клеточного звена.

Целью нашей работы явилось экспериментально-клини-ческое исследование влияния хронической описторхозной инвазии на состояние иммуннореактивности организма и активность пролиферативных процессов в тканях здоровых органов, а также в злокачественных опухолях.

Материалы и методы исследования. Экспериментальные исследования выполнены на мышах СВА /Ьас, ДВА /2, А /8п, С 57 В1 /6, Ва1Ь /с (У) с длительностью описторхозной инвазии 4-6 мес.(25метацеркариев на мышь).Злокачественные опухоли моделировали перевивкой сипгенных опухолевых штаммов. В иммунологических методах исследования использовали Н’-тимидин, Сг51, Кон А, ФГА, культуры клеток-мишеней. Проанализированны показатели иммунного

статуса (тесты I-II уровня) 110 больных ХО до начала лечения и 35 - через 3-12 мес. после дегильминтизации бильгри-цидом или азиноксом (возрост 20-60 лет).

Основные результаты. Полученные результаты показали, что первые этапы описторхозной инвазии индуцируют изменения в иммунной системе организма. Антигены мета-церкариев активируют систему гуморального иммунитета (АОК, В-памяти), антигены описторхов ингибируют активность клеточного иммунитета (РБТЛ на ФГА и Кон.А, НСТ-тест), метаболиты описторхов на фоне низкой функциональной активности лимфоцитов (ЕК, НСТ-тест) стимулируют пролиферативную активность митоген-нндуцированных Т-лимфоцитов. При хронической описторхозной инвазии отмечается значительный дисбаланс в системе иммунитета: существенное снижение специфической и неспецифической супрессорной активности лимфоцитов ассоциируется с их хел-перно-амплифаерной активацией. Это обусловливает высокую генеративную активность Т-лимфоцитов и антителообразующих клеток, активацию синтеза Ig, образования ЦИК и накопление их в организме (результат низкой функциональной активности моноцитарно-макрофагального звена). Ингибируется активность специфических и нсспецифических киллеров. В отдаленные сроки после дегельминтизации, наряду с тенденцией некоторых показателей к положительной динамике, дисбаланс в системе иммунитета остается.

Установлено, что на фоне дисбаланса системы иммунитета, обусловленного описторхозной инвазией, имеет место активация пролиферативных процессов не только в протоковом эпителии и печени, но и в тканях других органов, а также в злокачественных опухолях. Это свидетельствует о снижении противоопухолевой резистентности организма, опосредуемой иммунной системой.

Заключение. Нарушение иммунореактивности организма при описторхозной инвазии является одним из ведущих промоторных факторов холангиоканцерогенеза. Следовательно, одним из мероприятий профилактики первичного холан-гиоцеллюлярного рака печени на фоне описторхозной инвазии является коррекция иммунореактивности организма.

ЦИТОТОКСИЧЕСКИЕ Т-КЛЕТОЧНЫЕ КЛОНЫ, ИНДУЦИРОВАННЫЕ СИНТЕТИЧЕСКИМ ПЕПТИДОМ, РАСПОЗНАЮТ ЛЕЙКОЗНЫЕ КЛЕТКИ БОЛЬНЫХ ОСТРЫМ МИЕЛОИДНЫМ ЛЕЙКОЗОМ (ОМЛ)

Садовникова Е.Ю., Паровичникова Е.Н., Савченко В.Г., Stauss H.J.*

Гематологический Научный Центр РАМН,

Москва, Россия,

*Imperial College Medical School, London UK

Введение. Слабая иммуногенность опухолево-ассоциированных антигенов часто связана с тем, что опухолевые маркеры могут экспрессироваться также и на нормальных клетках, вызывая толерантность аутологичного Т клеточного репертуара в результате негативной селекции в тимусе или на периферии. CD68 - белок, обнаруживаемый в клетках больных острым и хроническим миелоидными лейкозами и в ряде других опухолей, но не в CD34+ кроветворных прсдшесгвсниках, может рассматриваться как потенциальная мишень для иммунной атаки, однако этот антиген присутствует также и на зрелых моноцитах и макрофагах. Ранее мы показали, что для преодоления толерантности к нормальному клеточному белку в целях получения цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), специфически распознающих опухолево-ассоциированный антиген, можно использовать Т-клсточный репертуар доно-

ра, несовместимого по НЬА. Методом “обратной иммунологии” из клеток НЬА-А2 донора нами были получены ЦТЛ, распознающие синтетический пептид, соответствующий участку молекулы С068, в комплексе с молекулой НЬА-А2. Целью настоящего исследования было изучение способности клонов ЦТЛ, индуцированных синтетическим пептидом, специфически лизировать лейкозные клетки, экспрессирующие данный антиген эндогенно.

Материалы и методы: Экспрессию НГА-А2 и внутриклеточную продукцию С068 исследовали в клетках лейкоз-ных клеточных линий человека и в бластных клетках периферической крови и костного мозга больных ОМЛ с помощью проточной цитофлюоримстрии. Т-клсточные клоны, индуцированные синтетическим пептидом, культивировали в присутствии НЬА-А2* стимуляторов, сенсибилизированных пептидом, фидеров и интерлейкина 2. Оценку цитотоксической активности производили с помощью колориметрического метода (Ргоггк^а).

Результаты: В исследовании использовались Т-клеточные клоны, способные лизировать Н1_А-А2-положительные мишени, обработанные иммунизирующим (329-337), но не контрольным пептидом. Клоны обладали высокой авидностыо: менее 1 нМ пептида нужно было для сенсибилизации клеток-мишеней. Такие клоны специфически лизировали клетки лей-козной линии человека ТНР-1, экспрессирующие СЭ68, но не клетки С1Я-А2, отрицательные по этому антигену. Цитолиз не связан с активностью натуральных киллеров (НК), т.к. клоны не узнавали клетки линии К.562, чувствительной к действию НК, ио не экспрессирующей НЬА-А2. Клетки К562, трансфецированные геном Н1_А-А2, распознавались 329-337-специфичными клонами, т.е. лизис был зависим от молекул комплекса гистосовместимости. На это же указывает тот факт, что распознавание мишепий блокировалось антителами против НЬА-А2. Наиболее важными результатами является демонстрация цитолитической активности клонов по отношению к клеткам крови и костного мозга НЬА-А2+больных ОМЛ. Важно отмстить, что клоны не лизировали клетки крови здоровых доноров, что может быть связано со сниженным уровнем презентации изучаемого эпитопа моноцитами периферической крови.

Заключение: В ходе приведенного исследования доказано, что Т-клеточные клоны, полученные путем индукции клеток периферической крови НЬА-А2'донора синтетическим пептидом-производным маркера С068, способны специфически лизировать лейкозные клеточные линии и бластныс клетки больных ОМЛ, положительных по НЬА-А2. Такие клоны могут иметь значение для разработки подходов к адоптивной иммунотерапии минимальной остаточной болезни или очистки костного мозга больных в случае аутологичной трансплантации костного мозга.

АУТОАНТИТЕЛА К НАТИВНОЙ И ДЕНАТУРИРОВАННОЙ ДНК - ПОКАЗАТЕЛЬ АУТОИММУННОГО ПРОЦЕССА У ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ

Сагтарова Л.И., Ишмухаметова Д.Г., Винтер В.Г.

Консультативно-диагностический центр,

Казанский государственный университет, Россия

Аутоантитсла (АА'Г) к различным аутоантигенам (ААГ) собственных тканей являются иммунологическими маркерами аутоиммунных патологий и широко используются при диагностике аутоиммунных заболеваний (АИЗ). Среди ААТ особое место занимают ААТ к ядерным ААГ, в частности.

"Дни иммунологии в СПб ‘2002’

Мед и цине кая Иммунол огия

ААТ к ДНК, повышенный уровень которых в сыворотке крови наблюдается при всех аутоиммунных патологиях. Это означает, что ААТ к ДНК, по-видимому, являются неотъемлемым атрибутом аутоиммунного состояния организма.

Замечено, что у больных со злокачественными опухолями наблюдается ряд признаков, характерных для аутоиммунного состояния: дисбаланс иммунорегулятор-ных клеток, появление в сыворотке крови ААТ к различным тканевым антигенам. При изучении взаимосвязи развития злокачественных опухолей и аутоиммунных процессов в качестве критерия аутоиммунного состояния организма нами использовано определение ААТ к нативной и денатурированной ДНК (нДНК и дДНК) у онкологических больных.

В работе использована сыворотка крови 60 здоровых доноров, 20 больных системной красной волчанкой (СКВ), 72 онкологических больных с установленным диагнозом. ААТ к нДНК и дДНК определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием в качестве ААГтимусной ДНК. Статистическую обработку полученных результатов проводили по общепринятым методам. Достоверную разницу между полученными данными двух выборок определяли, исходя из 1-кри герия Стьюдента (I >1 6 ).

Результаты исследований показали, что у здоровых людей в сыворотке крови всегда присутствуют ААТ к нДНК и дДНК. Пороговый уровень (Хс ^38) их содержания составляет: для ААТ к нДНК - 0.82±0.06 отн.ед., ААТ к дДНК -1,08±0.08 отн. ед. В сыворотке крови больных СКВ содержание ААТ к нДНК находится в пределах 0.94 - 1.89 отн.ед., ААТ к дДНК в пределах 1.24 — 2.12 отн.ед. Эти значения превышают таковые средние значения их содержания в норме более чем на За и в среднем составляют 1.18±0.06 отн.ед. и 1.32±0.05 отн.ед., соответственно. У онкологических больных во всех образцах сывороток обнаружены ААТ к нДНК и дДНК (таблица).

Анализ отдельных групп онкологических больных, объединенных в соответствии с видом опухоли, позволят выявить некоторые закономерности в распределении ААТ. Во всех группах обследованных больных наблюдается достоверное увеличение (Р>0.999, Р>0.99) содержания ААТ к нДНК и дДНК, что сравнимо с уровнем ААТ в сыворотке крови больных СКВ (исключение составляет группа больных раком желудочно-кишечного тракта, IV стадии). В группе больных раком молочной железы на Ш-1У стадии развития опухоли имеется тенденция к повышению содержания ААТ к нДНК и дДНК по сравнению с теми же показателями у больных 1-11

стадии. Кроме того, при наличии процесса мстастазирова-ния уровень исследуемых ААТ в большинстве случаев также повышен. У больных раком легких и раком желудочно-кишечного тракта (РЖКТ) уровень ААТ также достоверно превышает пороговый уровень нормы. Следует отметить, что в группе больных РЖКТ не удалось заметить различий в содержании ААТ у больных с III и IV стадией развития опухоли в сравнении с общей группой. Лишь у больных с наличием метастазов отмечалась тенденция к повышению содержания ААТ к и ДНК.

Присутствие в сыворотке крови при неогшазии достоверно повышенного уровня ААТ к нДНК и дДНК свидетельствует о тесной взаимосвязи аутоиммунного состояния и злокачественного роста. Обнаруживаемые у онкологических больных симптомы аутоиммунного состояния могут быть индуцированы воздействием факторов, сскретнрусмых опухолевыми клетками, на иммунную систему опухоленосителей. Одним из биологически активных веществ, выделяемых опухолевыми клетками, является РНК, которая, как ранее нами было показано, обладает иммуномодулирующим свойством и способна индуцировать поликлональную активацию аутореактивных лимфоцитов.

ИЗУЧЕНИЕ АДГЕЗИВНЫХ СВОЙСТВ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК (ДК), ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ВЛАСТНЫХ КЛЕТОК БОЛЬНЫХ ОСТРЫМ МИЕЛОИДНЫМ ЛЕЙКОЗОМ (ОМЛ)

Свинарсва Д.А.. Садовникова Е.Ю., Семикина ЕЛ.*, Белкин В.М., Паровичникова Е.Н., Копыль-цова Е.А.*, Торубарова Д.А.*, Савченко В.Г.

Гематологический научный центр, Москва, Россия, *Центр здоровья детей и подростков,

Москва, Россия

Введение. Несмотря на интенсификацию методов химиотерапии, достижение долгосрочных ремиссий остается основной проблемой при лечении больных ОМЛ. В связи с этим, особую актуальность представляет разработка альтернативных подходов, в частности иммунотерапии для эради-кации резидуальных клеток лейкозного клона. Исследования последних лет показали, что наиболее эффективным адъювантом для противоопухолевых вакцин являются ДК, благодаря их способности экспрессировать иммунные костиму-ляторные молекулы, которые необходимы для инициации

СРЕДНИЕ ЗНАЧЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ААТ К НДНК И ДЦНК В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ

Вид опухоли Кол-во чел. ААТ к нДНК ААТ к дДНК

ХсР±т Хср±т

Рак молочной Всего 23 1.09+0.05 10.74* 1.35+0.04 14.16*

железы Метастазы 7 1.13+0.06 13.58* 1.22±0.05 5.25*

1-11 10 1.01 ±0.12 3.16** 1.40+0.08 7.76*

111-1У 7 1.18+0.16 4.33* 1.44+0.15 4.76*

Рак легкого Рак желудочно- Всего 18 0.98+0.04 7.48* 1.36±0.04 13.02*

кишечного Всего 31 0.95±0.05 5.53* 1.30+0.03 17.52*

тракта Метастазы 8 1.09±0.15 3.47* 1.31+0.13 3.42*

III 6 0.95±0.07 3.96* 1.37±0.07 7.86*

IV 9 0.93+0.13 1.65 1.30+0.15 2.86**

* - Р>0.999, ** - Р>0.99

иммунного ответа. Ранее нами и в других лабораториях было показано, что бластныс клетки, полученные из периферической крови больных OMJI, можно индуцировать в культуре к экспрессии костимуляторных молекул. Такие клетки, экспрессирующие опухолевоспецифичные антигены эндогенно, представляют особый интерес с точки зрения создания противоопухолевых вакцин. Мы показали, что модифицированные лейкозные клетки (лейкозные ДК) индуцируют противоопухолевый ответ in vitro, однако остается открытым вопрос о способности лейкозных ДК in vivo к локализации во вторичные лимфоидные органы - места контакта с наивными Т-лимфоцитами. Целью данного исследования было изучение адгезивных свойств ДК, полученных из властных клеток крови больных ОМЛ и анализ экспрессии рецепторов, отвечающих за миграцию и прикрепление клеток к компонентам внеклеточного матрикса.

Материалы и методы. Получение ДК. Фракцию моно-нуклеаров периферической крови больных ОМЛ М4 и М2 (более 80% бластов) в дебюте заболевания и здо ровых доноров выделяли в градиенте плотности и культивировали в присутствии ГМ-КСФ, IL-4, TNFcc, факторов роста (ФР) или модулятора кальциевого обмена (А23 187).

Адгезивные свойства изучали, инкубируя клетки на коллагеновой, фибронектиновой подложках или на пластике в течении 1,5 часов.

Иммунофенотипическое исследование. Клетки окрашивали методом прямой флуоресценции с помощью антител против антигенов CD80 и CD83, методом непрямой флуоресценции против антигенов CD40, CD86, ин тегриновых рецепторов (аД, аД, а5, а4, аД, аД, (3, и Р5) и корецептора иигегринов трансглутаминазы (ТГ). Анализ уровня экспрессии проводили с помощью проточной цитофлуориметрии.

Результаты. Анализ адгезивных свойств показал, что бластные клетки, выделенные из периферической крови больных ОМЛ практически не прикрепляются к фибронек-тину, коллагену или пластику, тогда как после культивирования с ФР или А23187 клетки 3 из 4 больных приобретали сродство к фибронектипу. В одном случае наблюдалось высокое сродство клеток к субстратам как до, так и после воздействия ФР. CD14* моноциты, выделенные из крови здорового донора после воздействия А23187 теряли маркер CD 14 и начинали экспрессировать CD40, CD80 и CD86. Наряду с иммунокостимуляторными молекулами, на поверхности ДК выявлялись интегрины схД, ехД, а,, аД, аД и ТГ. Полученные в результате воздействия ФР или А23187 CD40'CD80+CD86* клетки больных ОМЛ экспрессировали тот же набор интергинов и ТГ, что и ДК здоровых доноров. Клетки больных, изначально отрицательные по аД, аД и ТГ, приобретали эти маркеры в процессе культивирования. Бластные клетки фенотипа а Д*аД *се5+аД+аД+сс4+ТГ+ сохраняли экспрессию ТГ и всех интегринов. кроме а . Уровень последнего снижался после воздействия ФР как в клетках больных, так и в ДК, полученных из клеток здорового донора. Экспрессия а4 коррелировала со степенью зрелост и ДК и появлением маркера CD83.

Заключение. В результате модификации клеток больных ОМЛ одновременно с индукцией костимуляторных молекул наблюдается изменение адгезивных свойств бластных клеток. Клетки больных ОМЛ после воздействия ФР или А23187 экспрессируют рецепторы компонентов внеклеточного матрикса - ламинина, фибронектина, нативного и денатурированного коллагена, витронектина, остеопонтина. Таким образом, после воздействия ФР или А23187 обмена клетки больных ОМЛ не только становятся компетентными с точки зрения профессиональной презентации антигенов, но и при-

обрстают способность экспрессировать рецепторы, отвечающие за адгезию и миграцию ДК, что может способствовать хомингу лейкозных ДК при введении их в организм больного. Полученные данные указывают на потенциальную возможность использования лейкозных ДК для разработки терапии минимальной остаточной болезни.

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ В ПАТОГЕНЕЗЕ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМЫ

Серебряная Н.Б., Скороход И.А., Подольцева Э.И.

Медицинская академия последипломного образования, Медицинская академия имени Мечникова, Сан кт - Пет ербхрг, Ро с с и я

Множественная миелома (ММ) - клональная В-клсточ-ная опухоль из терминально дифференцированных В-лим-фоцптов - плазматических клеток (ПК). Клинически ММ может последовательно проходить различные стадии: от индо-лентной, в которой клетки опухоли почти не пролиферируют и являются зрелыми плазматическими клетками, через активную стадию с малым процентом (< 1%) пролиферирующих плазмобластов к скоротечной терминальной стадии, на которой увеличивается число плазмобластных клеток костного мозг а (КМ) и часто возникают очаги экстрамедулляр-ной пролиферации.

До настоящего времени остаются не полностью изученными факторы, определяющие злокачественную трансформацию ПК, хотя выявлена существенная роль событий, приводящих к дизрегуляции генов, контролирующих клеточный цикл, онкогенов и ингибиторов апоптоза. В развитие генных нарушений вовлечены процессы физиологической перестройки генетического материала, протекающие при антигенной селекции в зародышевых центрах, а именно вторичные реараижировки сегментов иммуноглобулиновых генов и соматические гипермутации. Попадание онкогенов под контроль энхансерных элементов генов иммуноглобулинов приводит к гиперпродукции онкопротеинов (например, Ьс1-1), кроме того, некоторые онкогены могут становиться объектами соматических мутаций (например, ЬсГб), что создает преимущественные условия роста и выживания для клеток, имеющих такие генетические изменения.

Наряду с молекулярно-генетическими событиями, для развития ММ необходимы и иммунологические аномалии, в частности высокая продукция IЬ-6 клетками стромального микроокружения костного мозга. Причинами гипернродук-ции указанного цитокииа могут быть как избыточная стимуляция стромальных клеток трансформированными плазматическими клетками (за счет взаимодействия через адгезионные молекулы СЭ56, не экспрессируемые нормальными ПК), так и изменения свойств стромальных клеток (например, в результате инфицирования герпесвирусом, ассоциированным с саркомой Капоши). Наряду с 1Ь-6 регуляторами пролиферативной активности клеток ММ могут быть 1Ь -15, О-СЗР, 1Ь-10, 1Ь-3, ЗСИ, "ШНа и другие цитокины. Последствиями избыточной стимуляции клеток ММ и постоянного проведения активационного сигнала через 1Ь-6Я являются дополнительные мутации, чаще всего в генах га.у и с-тус. Дополнительные генетические аномалии в клетках ММ могут приводить к тому, что злокачественные клетки начинают аутокринно поддерживать собственную пролиферацию и перестают зависеть от продукции цитокинов клетками стромы костного мозга. Выход клеток ММ в периферическую кровь свидетельствует о трансформации ММ в

плазмобластный лейкоз и переходе заболевания в терминальную стадию.

С целью определения активности течения и выявления дополнительных прогностических маркеров заболевания мы исследовали спонтанную и стимулированную ФГА (10 мкг/ мл) продукцию цитокинов (1Ь-6,1Ь-4 и 1Ь-1(3) мононуклеар-ными клетками КМ (МНКМ) у 42 больных ММ. Выявили, что продукция 1Ь-6 МНКМ позитивно связана с количеством С038* клеток в КМ больных, их пролиферативной активностью (определяемой по количеству аргентофильных ядрышкообразующих регионов) и негативно - с экспрессией СЭ95. Кроме того, при наличии в КМ клеток с плазмобластной морфологией, продукция 1Ь-6 МНКМ была достоверно выше, чем при наличии клеток с морфологическими характеристиками зрелых плазматических клеток. Анализ клинических данных выявил достоверную связь активности течения заболевания с продукцией 1Ь-б МНПК и несколько менее выраженную ассоциацию с продукцией 1Ь-1)3. С количеством продуцируемого 1Ь-1(3 были тесно связаны такие параметры как выраженность остсодеструктивного синдрома и поражения почек. Продукция 11.-4 МНКМ больных ММ и сывороточная концентрация этого цитокина были существенно ниже у пациентов, чем у здоровых лиц. При этом сывороточная концентрация 1Ь-4 у больных ММ была позитивно связана с количеством С095' МНКМ.

Полученные результаты свидетельствуют, что определение продукции цитокинов позволяет получить дополнительную информацию об активности пролиферации и сохранности механизмов Раэ-зависимого апоптоза МНКМ больных ММ. Представляется, что такие параметры цитокинового статуса, как продукция 11.-6, 11.-4 и 1Ь-1 (3 МНКМ являются независимыми прогностическими факторами при ММ и могут дать дополнительную информацию о степени активности заболевания и возможности ответа на терашпо.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АФП-СВЯЗЫВАЮЩИХ ЛИГАНДОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ С ПОМОЩЬЮ ПАНЕЛИ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

Синенко С.А., Беляев Н.Н.

Институт молекулярной биологии и биохимии им.М.А.Айтхожина, Алматы. Казахстан

По данным литературы в сыворотке крови онкологических больных присутствуют компоненты, мешающие иммунохими-ческому выявлению альфа-фетопротеина (АФП). Такими факторами могут быть денатурированный АФП, АФП, связанный с сывороточными АФП-связывающими белками, а также свободные клеточные рецепторы к АФП или аутоан гитела.

Мы провели анализ образцов плазмы крови онкологических больных с диагнозом колоректальный рак, а также здоровых доноров с помощью полученной нами панели моноклональных антител (МКА) к АФП, выявляющих 5 независимых эпитопов. Использовали АФП человека 97% чистоты, полученный в нашем институте.

С помощью ингибиторного ИФА мы установили, что цельная плазма значительно (на 80-100%) подавляет связывание трех МКА (204, 1С7 и 2Е10) и менее сильно (на 20-30%) подавляет связывание МКА 1ЕЗ и 1Е9 с иммобилизованным АФП. Однако при 10-кратном разбавлении плазмы подавлялось связывание только антител ЮЛ (10-20%) и в меньшей степени 1С7 (5-12%). Между результатами, полученными при тестировании 1С7 и 204, отмечалась высокая степень корреляции (г=0,81), что свидетельствует, по-видимому, о том, что оба эпитопа присутствуют на сывороточ-

ных формах АФП или же блокируются одним и тем же лигандом. Однако проведение ингибиторного ИФА в варианте предварительной инкубации плазмы с сорбированным АФП показало, что ингибирование обусловлено присутствием в плазме свободных лигандов, которые, связываясь с иммобилизованным АФП, или блокируют или конформируют эпигоны 204 и 1С7. Ингибиторная активность плазмы, связанная с лигандами, значительно варьировала от образца к образцу и отсутствовала у здоровых доноров.

Как показали обширные иммунохимические исследования, эпитоп 204 является конформационным, поскольку возникает на молекуле АФП только при иммобилизации АФП на пластике. МКА 1С7 характеризовалось тем, что выявляло цитоплазматические белки опухолевых клеток Яа]1 и К562 в иммуноблоттинге.

Предполагается в дальнейшем оценить значение сывороточных АФП-связывающих лигандов и диагностическую ценность МКА 204 и 1С7 при мониторинге онкологических больных в процессе терапии.

СТРУКТУРА АДАПТАЦИОННЫХ РЕАКЦИЙ И ПОКАЗАТЕЛИ СИСТЕМЫ ИММУНИТЕТА У БОЛЬНЫХ ПРЕД0ПУХ0ЛЕВАМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ И РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Сгахеева М.Н., Гарбуков Е.Ю., Чердынцева Н.В., Слонимская Е.М., Бабышкина Н.Н., Афримзон Е.А.

Научно-исследовательский институт онкологии ТНЦ СО РАМН, Томск, Россия

Нарушения функционирования иммунной системы сопровождают практически все этапы злокачественной трансформации. Показано, что уже на этапе предопухолевых изменений в молочной железе начинает формироваться перестройка клеточно-опосредованного и гуморального иммунитета [Гриневич Ю.А., 1982]. С другой стороны, большое значение для развития и характера течения патологии имеет уровень реактивности организма в целом, находящий свое выражение в типе адаптационной реакции организма [Гар-кави Л.Х. и др., 1998].

Целью работы явилось исследование взаимосвязи типа адаптационной реакции и показателей гуморального и клеточного иммунитета у пациенток с доброкачественными изменениями в ткани молочной железы и раком.

Материалы и методы. В исследование включены наблюдения за 237 женщинами, среди которых были 34 здоровые, 87 больных с проявлениями ФКМ, 51 больная ФА и 65 больных РМЖ (^ (1Ч(| ,М()). Диагноз устанавливался на основании результатов маммографического, ультразвукового и цитологического исследований. Изучаемые группы были репрезентативны но возрасту и состоянию менструальной функции. Типы адаптационных реакций определяли по процентному содержанию лимфоцитов в лейкоцитарной формуле и по их отношению к процентному содержанию сегментоядерных ней-трофилов [Гаркави Л.Х. и др., 1998]. Клеточный иммунитет оценивали по количеству 'Г-лимфоцитов периферической крови, используя моноклональные антитела против СОЗ-антиге-на (“Медбиоспектр”, Россия) в реакции непрямой иммуно-флюоресцеиции. Содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови определяли методом радиальной иммунодиффузии по Маичини. Все исследования проводили до начала лечения.

Результаты. В отличие от здоровых лиц у всех пациенток с патологией молочной железы в структуре адаптационных реакций отсутствовала реакция острого стресса (ОС).

Вероятно, с хронизацией патологического процесса уменьшается диапазон вариантов ответа, либо истощаются резервы, необходимые для ответа по типу ОС. Среди групп с патологией молочной железы наиболее сбалансированной по адаптационному статусу оказалась группа больных ФА: в ней преобладали реакции тренировки (РТ), спокойной активации (РСА) и повышенной активации (РПА), которые характеризуются высоким уровнем реактивности и не приводят к истощению энергетических, пластических и функциональных резервов организма. Развитие ФКМ сопровождалось большим напряжением адаптационных систем: практически у половины больных встречалась РПА и наблюдалась тенденция к увеличению частоты встречаемости реакций переактивации (ПА) и хронического стресса (ХС). У пациенток с РМЖ неблагоприятные энергозатратные реакции ПА и ХС занимали еще большую долю в структуре адаптационного статуса. Соотношение благоприятных типов адаптационных реакций к неблагоприятным в группе больных ФА было равно 9, у пациенток с мастопатией 4, а у женщин с РМЖ 2,3. Уровень СОЗ’лимфоцитов у пациенток с ФА при всех типах адаптационных реакций оставался в пределах физиологической нормы (55 - 80%) за исключением РТ, когда данный показатель имел достоверно меньшие значения (р<0,01 относительно РСА, РПА, ПА). У больных ФКМ доминировали сниженные значения Т-лимфоцигов. Увеличение процента СОЗ'лимфоцитов до уровня физиологической нормы оказывалось возможным лишь в ситуации функционального напряжения Г1А (р<0,02 относительно РТ). В группе больных РМЖ уменьшение содержания Т-лимфоци-тов наблюдалось от РТ к ХС, причем при благоприятных типах реакции количество клеток находилось в пределах физиологической нормы. Количество для больных ФКМ оставалось в пределах нормы здорового контроля при всех типах адаптационных реакций. У пациенток с ФА при переходе к более энергоемким типам реагирования выявилась тенденция к увеличению уровня (р<0,05 между РТ и РПА). Наибольшее значение показателя отмечено при ХС. У больных РМЖ содержание в сыворотке крови при увеличении уровня активации систем адаптации не возрастало, а снижалось (р<0,02), что, вероятно, указывает на истощение функциональных резервов.

Заключение. В структуре адаптационного статуса пациенток при переходе от доброкачественных пролиферативных заболеваний молочной железы к раку выявлена устойчивая тенденция к увеличению доли ресурсоемких реакций (ХС и ПА). У больных РМЖ с вышеуказанными типами отмечается истощение функциональных резервов клеточного и гуморального иммунитета, что проявляется в снижении числа Т-лимфоцитов и количества в сыворотке крови по сравнению с показателями у пациенток, отвечающими по типу РТ, РСА и РПА.

ЭКСПРЕССИЯ АПОПТОЗ-СВЯЗАННЫХ БЕЛКОВ В УВЕАЛЬНОЙ МЕЛАНОМЕ

Степанова Е.В.. Дбар Ж.Н., Лихванцева В.Г., Давыдов А., Абрамов М.Е., Бровкина А.Ф., Барышников А.Ю., Личиницер М.Р.

НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва, Россия, Институт глазных болезней им. Гемгольца,

Москва, Россия

Увеальная меланома (УМ) - наиболее часто встречающаяся внутриглазная опухоль взрослого населения. Из-

вестно, рост опухоли определяется балансом количества пролиферирующих и умирающих клеток. Основными регуляторами апоптоза являются продукт гена супрессора опухолевого роста р53 и белки семейства Вс1-2. В настоящей работе мы исследовали экспрессию белков р53, Вс1-2 и Вах в ткани УМ и их роль в метастазировании опухоли.

В исследование включен 81 больной УМ, получивших хирургическое лечение (энуклеация, блокэксцизия, экзен-терация) в институте глазных болезней им. Гемгольца (Москва) в период между 1982-1999 гг. Иммуногистохи-мическое исследование проводили по стандартной методике.

В качестве первичных антител использовали моноклональные антитела кр53 (клон 007, разведение 1:200, ОАКО Согр), Вс1-2 (клон 124, разведение 1:40, БАКО Согр) и кроличьи поликлональные антитела к Вах (разведение 1:500, ОАКО Согр).

Положительное ядерное р53 окрашивание было обнаружено в 23 (28,4%) случаев УМ. Экспрессия Вс1-2 и Вах была найдена у 58 (71,6%) и 29 (35,8%) больных, соответственно. Экспрессия Вс1-2 и Вах не была связана друг с другом. Экспрессия Вс1-2 и Вах имела тенденцию быть связанной с присутствием р53 в опухоли. Опухоли, экспрессирующие р53, имели низкий уровень экспрессии Вс1-2, высокий уровень экспрессии Вах и, что наиболее важно, соотношение Вс1-2:Вах < 1.

Экспрессия р53, Вс1-2, Вах и индекс Вс1-2:Вах не коррелировали с размером опухоли, гистологическим типом, наличием некрозов в опухоли или эпибульбарным ростом. Меланомы цилиарного тела характеризовались более высокой частотой экспрессии р53 (55,6%), и соотношением Вс1-2:Вах < 1 (76,7%), тогда как меланомы хориоидеи - отсутствием накопления р53 и преобладанием экспрессии Вс1-2 (Вс1-2:Вах > 1).

59 исследованных больных имели срок наблюдения 5-19 лет после хирургического лечения. У 23 (39,0%) из 59 больных появились метастазы в разные сроки после операции.

Среднее время до появления метастазов составило 46±37 мес (медиана 36 мес, от 6 до 156 мес.). 21 (35,6%) из 59 больных умерли от метастатической болезни за время наблюдения. У всех больных метастазы были обнаружены в печени. Средняя продолжительность жизни составила 50±30 мес. (медиана 42 мес, от 11 до 121 мес.). Низкая безрецидивная и общая выживаемость наблюдалась у больных, положительных по Вах, по сравнению с Вах отрицательной группой (р=0,061 и р=0,022, соответственно).

Было оценено комбинированное влияние экспрессии маркеров на прогноз заболевания. 4 возможных комбинации Вс1-

2 и Вах имели статистически значимые отличия в показателях безрецидивной и общей выживаемости (р=0,043 и 0,02, соответственно). Статистическая достоверность различий выживаемости была также получена между отдельными группами Вс1-2- /Вах- и Вс1-2- /Вах+ (р=0,01 для безрецидивной выживаемости и р=0,009 для общей выживаемости). У больных с УМ, не экспрессирующей Вс1-2 и Вах, наблюдалась самая высокая безрецидивная и общая выживаемость. При Вах-положительной, но Вс1-2-отрицательной УМ частота метастазирования и ранней смерти достигала самых высоких значений.

Экспрессия белков, регулирующих апоптоз в клетках УМ, требует дальнейшего изучения. Научный поиск по модулированию экспрессии апоптоз-связанных белков при меланоме глаза представляется перспективным.

IMMUNE MECHANISMES IN ANTITUMOR EFFECTS OF P53 IgG TO CHEMICALLY INDUCED COLON CANCER IN RODENTS

Yevgenie Tendler*. Oren Zinder*, Aleksander Panshin** and Itshak Zusman***

*Department of Clinical Biochemistry, Rambam Medical Center, Haifa, Israel **Kimron Veterinary Institute, Bait Dagan, Israel ***Koret School of Veterinary Medicine, Faculty of Agricultural, Food and Environmental Quality Sciences, Hebrew University of Jerusalem, Rehovot, Israel

It has previously been shown that rabbit antibodies generated against soluble p53 can exert tumor-suppressive effects on chemically induced colon cancer in rats (Cancer J, 10:116-120, 1997). Here we analyze the role of some components of the immune system in the response of the rat colon mucosa exposed to the carcinogen dimethylhydrazine (DMH) and treated with anti-p53 antibodies (slgG). The following groups of rats were studied: i) control non-treated rats; ii) tumor-free non-vaccinated rats exposed to DMH; iii) tumor-bearing non-vaccinated rats; iv) tumor-free vaccinated rats exposed to DMH; v) tumor-bearing vaccinated rats. The rate of apoptosis, proliferating cell nuclear antigen (PCNA), mitotic index (MI), the number of T lymphocytes and p53-posi-tive cells was compared in different rat groups. The apoptotic index (AI) and the number of p53-positive cells and T-lymphocytes were significantly higher in colon adenocarcinomas obtained from vaccinated rats than in non-vaccinated counterparts. PCNA was lower in tumors from vaccinated rats , whereas the MI was not different between these rat groups.

We also found that vaccination of human p53 promoter-transgenic mice exposed to low doses of DMH, with different p53 antibodies (monoclonal - PAB 421 and DOl, and polyclonal -aH-p53 and slgG), significantly increased the expression of the p53 promoter. The enzymatic CAT activity was determined in the ileum and colon 8 weeks later the final injection of DMH. Expression of the p53 transgene in the normal ileum was twice as high as in the colon. Treatment with DMH significantly decreased the expression of the p53 transgene both in the ileum (from 100% tol8%)andin the colon (from 52% to 10%). Vaccination of mice protected at least in part such a decrease. The most effective results were found after the treatment of mice with polyclonal aH-p53 and to a lesser extent with slgG. No difference was found in the effects of antibodies on the small and large intestines. We concluded that polyclonal antibodies were more effective than monoclonal ones in protection against anti-p53 action of DMH.

We speculate that anti-p53 antibodies stimulate production of anti-idiotype antibodies Ab2. These antibodies are, apparently, immunoglobulins with specificity directed against determinants located within an available region of antigen-specific antibodies Ab 1 (anti-p53 antibody). Certain Ab2 recognize idiotypes within the antigen-combining sites of Abl and can mimic the three-dimensional structure of an antigen that generated the Abl (i.e., p53 protein). It is not clear whether anti-idiotypic antibodies may trigger antitumor effects by suppressing the growth of p53-expressing cancer cells directly or by activating the host’s immune response. It has been shown that a subset of antigen-presenting cells can produce antigens which present in the extracellular fluid with MHC class I molecules. Apparently, anti-p53 antibodies stimulated cellular components of the system that are responsible for tumor suppression. Such an effect causes an increase in apoptosis and p53 promoter expression. The mechanism of such effects is not clear. Our findings demonstrated that vaccination significantly activated apoptosis and

induced synthesis of p53 protein in both normal and malignant types of colon tissue. Vaccination with anti-p53 antibodies seemed to activate the immune system and to stimulate some of its cellular components responsible for tumor suppression.

ИММУННЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ЭФФЕКТА IgG ПРОТИВ Р53 ПРИ ХИМИЧЕСКИ ИНДУЦИРОВАННОМ РАКЕ ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА У ГРЫЗУНОВ

Евгений Тендлер1, Open Зиндер1, Александр Паньшин2 и Исаак Зусман3

'Отделение клинической биохимии, медицинский центр Ромбам, Хайфа, Израиль 2Ветеринарный институт им. Кимрона, Бейт Даган, Израиль 'Школа ветеринарной медицины им. Корет, факультет сельского хозяйства, питания и качества окружающей среды, Еврейский университет, Иерусалим, Израиль

Ранее было показано, что кроличьи антитела против растворимого р53 белка проявляют опухоле-подавляющий эффект при химически индуцированном раке толстого кишечника у крыс (Cancer J, 10:116-120, 1997). В данной работе анализируется роль некоторых компонентов иммунной системы в реакции слизистой толстого кишечника на введение диме-тилгидразина (ДМГ) и последующее лечение анти-р53 антителами. Были исследованы следующие группы животных: I) Контрольные крысы. II) Свободные от опухолей не вакцинированные крысы. III) Имеющие опухоли не вакцинированные крысы IV) Неимеющие опухолей вакцинированные крысы V) Имеющие опухоли вакцинированные крысы. Уровень апоп-тоза, пролиферирующего клеточного ядерного антигена (PCNA), митотический индекс, количество Т лимфоцитов и р53 позитивных клеток изучалось в различных группах животных. Апоптотический индекс, количество р53 позитивных клеток и Т лимфоцитов было достоверно выше в аденокарциномах полученных от вакцинированных крыс, чем от не вакцинированных. PCNA был ниже в опухолях от вакцинированных животных, в то время как митотический индекс был одинаков и в той и в другой группе.

Нами также было найдено, что вакцинация обработанных низкими дозами ДМГ трансгенных мышей , несущих человеческий р53 промотор, при помощи различных анти-р53 антител (моноклональных - РАВ 421 и ДО 1, поликлональных -ссН-р53 и анти-р53 IgG), статистически достоверно повышает экспрессию р53 промотора. Ферментативная CAT активность определялась в ileum и в colon через 8 недель после последнего введения ДМГ. Экспрессия трансгена в нормальной ileum была в 2 раза выше, чем в нормальной colon. Введение ДМГ снижало экспрессию трансгена как в ileum (от 100% до 18%), так и в со1оп(от 52% до 10%). Вакцинация частично предотвращала это снижение. Наиболее результативным было введение аН-р53, несколько менее успешным - введение аити-р53 IgG. Не было обнаружено разницы в воздействии антител на толстый и тонкий кишечник. Таким образом поликлональные антитела оказались более эффективны чем моноклональные, при подавлении обусловленного ДМГ анти р53 действия.

Можно предположить, что анти р53 антитела стимулируют выработку анти-идиотипичсских антител АЬ 2. Эти антитела, по видимому, являются иммунноглобулинами, специфически направленными против детерминант, локализованных внутри области антиген-специфических антител АЬ Данти р53

антитела). АЬ 2 узнают идиотипы внутри ангиген-связываю-щих сайтов Ab 1 и могут повторять третичную структуру антигена, который генерировал АЬ 1(т.е. р53 белка). Неясно могут ли антиидиогирические антитела запускать антиопухоле-вый эффект непосредственно подавляя рост р53 экспрессирующих раковых клеток, или посредством активации иммунного ответа хозяина. Известно что антиген-презентирующие клетки могут представлять антигены, присутствующие в эк-страцеллюлярной жидкости в комплексе с молекулами гисто-совместимости 1типа. Видимо анти р53 антитела стимулируют клеточные компоненты системы, ответственной за подавление опухолей. Например, вызывают повышение уровня апонгоза и активацию р53 промотора. Механизм такого эффекта не до конца ясен. Наши данные демонстрируют, что вакцинация активирует апоптоз и индуцирует синтез р53 белка как в нормальной, так и в злокачественной ткани слизистой colon. Таким образом иммунизация анти р53 антителами активирует иммунную систему и стимулирует клеточные компоненты, ответственные за подавление опухоли.

ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ МИЕЛОПИДА В ЛЕЧЕНИИ ДЕТЕЙ С ПАПИЛЛОМАТОЗОМ ГОРТАНИ

Хайруллина P.M., Макарова Г.У. Давлетбаева Г.А.

Республиканская детская клиническая больница,

Уфа, Россия

Цель и задачи исследовании. Оценить эффективность мислопида в комплексной терапии папилломатоза гортани у детей в условиях иммунологического мониторинга. Иммунологический мониторинг включал проведение обследования до и после терапии миелопидом с использованием данных иммунофенотипирования лимфоцитов, определения содержания иммуноглобулинов, циркулирующих иммунных комплексов, активности комплемента и оценку системы фагоцитоза по поглотительной и метаболической активности.

Материалы и методы. Под наблюдением находилось 12 детей с диагнозом- папилломатоз гортани. Клиническое течения процесса характеризовалось частыми рецидивами , короткими ремиссиями и отсутствием эффекта от традиционного оперативного метода лечения

Результаты. Иммунологический мониторинг до проведения терапии миелопидом. Имунофенотипкрование включало определение субпопуляциониого состава лимфоцитов CD3’, CD4*, CD8*, CD 16*, CD22’ , определение маркеров активации CD25", CD95\ HLA-DR. По данным иммунофенотипирования содержание основных субпопуляций лимфоцитов соответствовало хроническому течению процесса, проявлялось Т-и В-

лимфопенией. Достоверно значимым было снижение показателей СО 16, С025, установленное 94% обследованных Нарушения в гуморальном звене системы иммунитета проявлялись селективной недостаточностью ^А-50%. У одного ребенка был выявлен гипер ^А синдром, в одном случае дисиммуноглобу-линемия проявлялась снижением ^С, ^А У всех обследованных отмечались явления дисфагоцитоза , сопровождавшиеся депрессией поглотительной и метаболической активности по данным ФАЛ, НСТ-теста и спонтанной люминол-зависимой хемилюминесценции Характер изменений спонтанной люми-нол-зависимой хемилюминесценции (монотонный тип кривой, снижение светосуммы и уровня максимальной светимости) был патогномоничен для торпидно текущих процессов

Терапия миелопидом проводилась в послеоперационном периоде папилломэктомии по следующей схемс:0,05 мг\кг, внутримышечно, №5-7, ежедневно Положительный клинический эффект характеризовался стабилизацией общего состояния, стойкой ремиссией, в ряде случаев, превышающей 1,5 года, уменьшением числа рецидивов. Модулирующий эффект мислопида характеризовался нормализацией соотношения им-мунокомпетентных клеток( С04/С08), увеличением количества 1ЧК-клсток, устранялась дисиммуноглобулинемия и проявления дисфагоцитоза.

Положительная клинико-иммунологическая динамика на фоне терапии миелопидом-основание для включения миело-пида в базисный комплекс терапии папилломатоза гортани в педиатрической практике.

ИССЛЕДОВАНИЕ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА, ОПОСРЕДОВАННОЙ ЧЕРЕЗ МАННОЗНЫЙ РЕЦЕПТОР

Чкалуа Г.З.. Заботина Т.Н., Буркова А.А., Огородникова Е.В., Кадагидзе З.Г., Барышников А.Ю.

НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН,

Москва, Россия

За последние 5 лет в онкологической практике стали интенсивно разрабатывать противоопухолевые вакцины на основе дендритных клеток (ДК). Существуют различные способы “нагрузки” ДК опухолеассоциированными антигенами, эго связано не только с источником антигена, но и с функциональным состоянием используемых ДК. Незрелые ДК (нДК), обладающие фагоцитарной активностью, захватывают антигены, перерабатывают и экспрессируют их пептидные фраг-

Табл.1. ИММУНОФЕНОТИП И ФАГОЦИТАРНАЯ АКТИВНОСТЬ НДК, КУЛЬТИВИРУЕМЫХ В СРЕДЕ С 2% ЧП (2% СПК). 7ЫЕ СУТКИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Изотип. контроль CD83 Изотип. контроль МР Фагоцитоз (37”С)

% 0,1 (0,2) 0,5 (0,8) 0,4 (0,3) 98,2 (98,0) 67,33 (84,83)

Mean 8,69 (4,99) 7,53 (5,27) 6,26 (4,65) 983,7 (965,3) -

Табл. 2. ИММУНОФЕНОТИП И ФАГОЦИТАРНАЯ АКТИВНОСТЬ ЗДК, КУЛЬТИВИРУЕМЫХ В СРЕДЕ С 2% ЧП (2% СПК). 9ЫЕ СУТКИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Изотип. контроль CD80 CD83 Изотип. контроль МР Фагоцитоз (37“С)

% 0,15 (0,25) 52,5 (72,01) 63,4 (73,46) 0,15 (0,6) 94,81 (94,01) 26,9 (27,2)

Mean 5,79 (5,12) 23,5 (22,15) 39,49 (24,95) 4,68 (5,85) 300,1 (181,3) -

менты вместе с главным комплексом гистосовместимости (ГКГС). У зрелых ДК (зДК) фагоцитарная активность значительно снижена, вследствие чего ДК “нагружают" пептидами, которые способны взаимодействовать с ГКГС. Захват антигена дендритными клетками может происходить за счет двух различных механизмов: макропиноцитоза (цитоскелет-зави-симый эндоцитоз) и рецептор-зависимого эндоцитоза (за счет Fcy-рецептора и маннозного рецептора (МР)).

Целью работы явилось исследование фагоцитарной активности и экспрессии МР на дендритных клетках человека.

Материалы и методы. Клетки культивировали при 37°С и 5% С02 в RPMI-1640, содержащей 2% человеческой плазмы (ЧП) группы АВ или 2% сыворотки пуповинной крови человека (СПК), L-глутамин, HEPES, антибиотики, витамины, гепарин, (3-меркаптоэтанол (далее полнея среда (I1C)). Мононукле-ары периферической крови (МПК) выделяли из лейкомассы, центрифугируя в градиенте плотности Ficol-Hepaque (Pharmacia, Швеция) (р=1,077). МПК ресуспсндировали в ПС и наносили на чашки Петри d=90 мм (Linbro, Великобритания) в количестве 5010'’ клеток в 10 мл среды и инкубировали в течение 1,5 ч при 37°С и 5% С02. Затем отбирали не прилипшие клетки, а к адгезированным на пластике моноцитам добавляли 10 мл ПС, содержащей 2% ЧП или 2% СПК, 80 нг/мл ГМ-КСФ (Leucomax, Shering-Plough) и 20 нг/мл 1L-4 (ICN, США). На 2“ 4ЫС и 6“ сутки культивирования к клеткам добавляли по 1 мл соответствующей ПС, содержащей 800 нг ГМ-КСФ и 200 нг IL-4. Для терминальной дифференцировки ДК на 7“ сутки к культуре клеток добавляли фактор некроза опухоли-а (конечная концентрация 20 нг/мл) (1CN, США) и простагландин Е, (конечная концентрация 250 нг/мл) (1CN, США) и культивировали в течение 2х суток. Фагоцитарную активность нДК (7ые сутки культивирования) и зДК (9ь|е сутки культивирования) определяли по фагоцитозу Candida albicans меченной F1TC (любезно предоставленной Д.В. Мазуровым). Опытные образцы инкубировали 30 мин при 37"С, тогда как контрольные образцы инкубировали 30 мин при 4"С. Соотношение Candida^K составляло 2:1. На 7ЫС и 9ь|е сутки культивирования определяли иммунофенотип ДК с помощью прямой реакции иммунофлуорссцснции. В работе использовали антитела, коньюгированные с FITC, к антигенам CD80 (PharMingen, США), CD83 (Caltag, США) и антитела к МР (Immunotech, США), коньюгированные с фико-эритрином. Иммунофенотип и фагоцитарную активность ДК определяли на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton-Dickinson, США).

Результаты. На 7Ы' сутки культивирования все ДК высоко экспрессировали МР, что сочеталось с высокой фагоцитарной активностью (табл.1). В процессе дифференцировки ДК процент клеток несущих маннозный рецептор остается прежним, тогда как уровень экспрессии (mean) значительно снижается. Фагоцитарная активность зДК также снижалась (табл.2). Культивирование ДК в среде с 2% СПК по сравнению с 2% ЧП позволяло получить более высокий процент зрелых ДК, что сочеталось с более низким уровнем экспрессии МР.

ОСОБЕННОСТИ ИММУНОРЕАКТИВНОСТИ БОЛЬНЫХ С ГЛИОБЛАСТОМОЙ В ПРЕДОПЕРАЦИОННОМ ПЕРИОДЕ

‘Чумаков В.А.. 'Биктимиров Р.Г., ‘Качков И.А., 'Зубова Ю.Е., 'Пронина О.А., 2Гнучев Н.В., ’Кузнецов В.П., 'Сучков С.В.

'МОНИКИ, 2ИБГ РАН, 1ПИИЭИМ им. Н.Ф. Гамалеи, Москва, Россия

Для разработки комплексной схемы послеоперационного мониторинга и лечения больных с глиобластомой (Г), необхо-

димо изучение особенностей иммунного статуса в пред- и послеоперационном периодах. Это позволит выработать показания для применения современных средств противоопухолевой иммунофармакотерапии, задача которой заключается в мобилизации собственных ресурсов иммунной системы и усилении противоопухолевого иммунитета [Graf М.R., Merchant R.E., 1999].

Целыо работы являлось исследование состояния клеточного, гуморального и других звеньев иммунореактивности у больных с Г в предоперационном периоде.

Материалы и методы исследовании. Сыворотки больных с Г. [п=28] получены из отделения нейрохирургии МОНИКИ. Возраст больных 23-60 лет, длительность заболевания - 2-6 мес. Для комплексной оценки параметров иммунитета образцы крови исследовали методом ИФА на содержание онкомаркеров - AFP, СЕА и NSE; методом иммунофено-типирования уровень субпопуляций СО+-клеток. Также определяли содержания IgG, IgM и IgA, фагоцитарную функцию, уровень естественной цитотоксичности (ЕЦТ) и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК).

Результаты исследований. В зависимости от характера выявленных иммунологических нарушений все пациенты распределялись на 2 группы: / (n= 19) с выраженным иммунодефицитом и //(п=9) - со слабовыраженным иммунодефицитом или его отсутствием.

Для 12 из 19 больных группы 1 отличительной особенностью являлась супрессия клеточного звена иммунитета-снижение содержания активных Т-лимфоцитов, ряда иммуноре-гуляторных индексов и уровня ЕЦТ в среднем на 5-30%. Это было связано со значительным дефицитом Т-клеток и диспропорциями в составе субпопуляций. В меньшей степени отмечались признаки иммунодефицита гуморального звена -снижение титров сывороточных иммуноглобулинов IgM, IgG и IgA на 5-25% и индексов активации В-клеток на 5-15%. В отдельных случаях (в 6 из 19) наблюдалось появление в крови онкомаркеров в различных сочетаниях.

В группе II в 4 из 9 случаев установлено небольшое снижение уровней ЕЦТ и субпопуляции СОЗ+-лимфоцитов. Ни в одном случае не отмечено супрессии гуморального звена или фагоцитарной функции. Ни у одного из больных этой группы не обнаружено онкомаркеров.

Таким образом, при Г характерно наличие двух иммунологических фенотипов, что должно учитываться при разработке клинико-иммунологических критериев лечения Г.

ПОЛИМОРФИЗМ РАМ И ММР-1 У БОЛЬНЫХ С ОНКОГЕМАТОЛОГИЧЕСКИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ: ВОЗМОЖНАЯ СВЯЗЬ С ПОСТТРАНСПЛАНТАЦИОННЫМИ ОСЛОЖНЕНИЯМИ

Чухловин А.Б., Забелина Т.С., Зубаровская Л.С., Афанасьев Б.В., Цандер А., Фезе Б.

Санкт-Петербургский Государственный медицинский Университет им. И.Павлова, М3 РФ, Россия; Гамбургский Университет, Германия

Острая реакция “трансплантат против хозяина” (ОРТПХ) является частым осложнением посттрансплантационного периода и связана с активацией аллореактивных Т-клеточных клонов донора. Учитывая наличие тесных функциональных связей между системой фибринолиза коллагенолиза и процессами инвазии донорских клеток в кроветворных тканях организ-ма-хозяина, представляется весьма важным исследование взаимосвязей генного полиморфизма плазминоген-активатор ингибитора типа 1 (РА1-1)иматрикс-металлопротеиназы-1 (ММР-

2002, Т. 4, №2

Онко или iy нол огия

1) с вероятностью развития веноокклюзионной болезни и/или ОРТПХ после кондиционирующей терапии и трансплантации аллогенных стволовых гемоиоэтических клеток (ТГСК).

В настоящей работе обследовано 111 больных трансплантационного контингента, в т.ч. с острыми лейкозами (п=40); хроническим миелоидным лейкозом (п=37); миеломной болезнью (п= 15); миелодиспластическим синдромом (п=6); другими заболеваниями (п=13). Больным проводилась интенсивная кондиционирующая терапия и ТГСК (в 60 случаях - от родственников, и в 51 - неродственная). Трансплантация костного мозга и периферических стволовых клеток осуществляли, соответственно, в 53 и 47% случаев. При этом ОРТПХ I-

IV степени была диагностирована у 51% больных, несмотря на применение стандартных схем профилактики РТГ1Х. Оценка инсерционно-делеционного полиморфизма промоторов генов РАМ и ММР-1 проводилась в образцах геномной ДНК лейкоцитов больных и доноров, с применением аллель-спе-цифической ДНК-ПЦР.

Результаты исследования. В целом, частота гомо- и гете-розиготности по альтернативным аллелям (4G/5G для PAI-1 и 1G/2G для ММР-1) в популяциях доноров и общей группе больных была близкой к классическому распределению (1:2:1), что обеспечивало возможность оценки посттрансплантационного химеризма в 28% случаев по аллелям ММР-1 и 32% - по PAI-1. При малом числе доказанных случаев ВОБ в данной группе, не было выявлено достоверной корреляции между частотой 4G и SG-аллелями PAI-1 и развитием этой тяжелой патологии гемостаза. В то же время распределение аллелей ММР-1 оказалось значительно измененным в группе больных с ОРТПХ. Действительно, лишь 5/57 больных ОРТПХ (9%) были гомозиготными по более активной MMP/2G аллели, по сравнению с 13/54 (26%) в группе без ОРТПХ (р<0,03). Наряду с этим, более индуцибельный генотип ММР (2G/2G) у доноров чаще встречался в случаях ОРТПХ у больных (р<0,03). Сочетание более “активного” генотипа ММР у донора с менее "активным” у больного оказалось также более частым при ОРТПХ по сравнению с больными без данной патологии.

Следовательно, реализация иммунологических эффектов, связанных с пролиферацией аллореактивных Т-клеточных клонов и специфическими поражениями эпителиальных тканей при ОРТПХ может быть обусловлена активацией генов коллагеназы и ремоделлингом межклеточного матрикса. В связи с этим требуются дальнейшие исследования по оценке локальной экспрессии генов семейства металлопротеиназ и их специфических продуктов в ходе развитая ОРТПХ. Известно, что ингибиторы металлопротеиназ являются весьма перспективными препаратами для предотвращения и лечения ОРТПХ. Таким образом, понимание механизмов, лежащих в основе РТПХ, может помочь в создании новых стратегий терапии данного состояния.

ПЕРСПЕКТИВЫ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЦЕПТОРОВ ГОРМОНОВ ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Шатинина Н.Н*.. Арзуманов А.С., Маркочев А.Б.

* Российская Академия Медицинских Наук Онкологический Научный Центр им. Н.Н. Блохина, Москва, Центральный научно-исследовательский рентгенорадиологический институт М3 РФ, Санкт-Петербург

Рак молочной железы относится к наиболее распространённым заболеваниям среди женщин Европы и Америки. Учитывая то, что в основе принципов гормонотерапии лежит

блокада воздействия гормонов (эстрогенов) на клетки опухоли, актуальна не только информация о наличии рецепторов на ядрах опухолевых клеток, но и оценка их количества. Рецепторы к эстрогену и прогестерону определяются не только на ядрах опухолевых клеток, но и на ядрах нормальных клеток, а также вне ядер, не являясь в этом случае функционально активными. Современные иммуногистохимические методы определения рецепторов к эстрогену и прогестерону при раке молочной железы следует считать предпочтительными, учитывая возможность количественно оценивать такие показатели как процент позитивных опухолевых клеток и плотность рецепторов на ядерной мембране (Н-счёт).

Цель исследования: уточнение прогностических возможностей количественной оценки рецепторов к эстрогену и прогестерону при раке молочной железы.

Методы: объектом для исследования послужили 100 первичных опухолей и 63 л/у с метастазами от больных (Т2-3N0M0 и T2-4N1-3M0) инфильтрирующим протоковым раком молочной железы (средний возраст больных 57±2,4 года). Иммуногистохимическое исследование для выявления ядер-ных рецепторов к гормонам (РГ+) эстрогену и прогестерону проводили в формалин фиксированных образцах после депа-рафинизации срезов с использованием моноклональных антител 1D5 и 1А6. Количественный учёт проводили в первичных опухолях молочной железы и в метастазах, используя Н-счст [DAK.0,1998],

Результаты. Из 100 обследованных больных у 49% опухоли были позитивны, согласно рекомендациям DAK.0 (Н-счёт превышал значение 50). В группе больных с негативным рецепторным статусом количество пациентов с метастазами составило 58%, тогда как в группе с позитивным рецепторным статусом количество пациентов с метастазами было несколько меньшим (31%). В группе больных с позитивным рецепторным статусом рецепторы только к эстрогену были у 21% больных, только к прогестерону - у 31% и к эстрогену и прогестерону - у 48% больных. Из оставшихся рецептор негативных пациентов у 34% опухоли оказались абсолютно негативными и у 17% больных имелись “следовые количества” рецепторов гормонов (Н-счёт менее 50). Случаи объективных ремиссий при гормонотерапии больных с негативным рецепторным статусом по литературным данным составляют 10-15% [Harris ctal., 1996].

Заключение. С учётом представленных данных и сведений из клинической практики о возможности объективных ремиссий при рецептор отрицательных опухолях примерно у 10-15% больных, целесообразно уточнить шкалу Н-счёта для дальнейшего исследования, выделив в ней дополнительную зону “следовых количеств” (Н-счёт менее 50).

ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАВИСИМОСТИ ЭФФЕКТА ХИМИОТЕРАПИИ У БОЛЬНЫХ АГРЕССИВНЫМИ ФОРМАМИ НЕХОДЖСКИНСКИХ ЛИМФОМ ОТ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ОПУХОЛИ И СОДЕРЖАНИЯ В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ ОНКОСУПРЕССОРНОГО (Р53)

И АНТИАПОПТОТИЧЕСКОГО (BCL2) ПРОТЕИНОВ

Шаиева Т.А.. Мухина М.С.

Военно-медицинская академия, Санкт-Петербург, Россия

Несмотря на различие в механизмах воздействия на клетку, реализация противоопухолевой химиотерапии происходит через активацию апоптоза. В значительном проценте случаев агрессивных неходжскинских лимфом (НЛ), особенно В-диффузных

крупноклеточных, трансформированных из фоликулярных лим-фом, отмечаются аберрации генов Ьс12 и р53. С аберрациями указанных генов связывают химиорезистентность злокачественных опухолей, преодоление которой составляет одну из главных задач современной терапии. Наряду с химиорезистентностью определенную сложность в лечении агрессивных НЛ представляет пролиферативная активность опухоли.

Целью настоящего исследования являлось определение зависимости эффекта химиотерапии у больных агрессивными формами неходжскинских лимфом (НЛ) от пролиферативной активности опухоли и от содержания в опухолевых клетках он-косупрессорного (Р53) и антиапоптотического (Вс12) протеинов.

Проведено иммуногистохимическое исследование Р53, ВСЬ2 и маркера пролиферации К167 антигена в опухолевых клетках биоптатов лимфоузлов 9 больных В-диффузными крупноклеточными, 5 - анапластическими крупноклеточными и 6 больных периферическими Т-клеточными лимфомами. С учетом интенсивности окрашивания Р53 и ВСЬ2 вычисляли показатели накопления протеинов в опухолевых клетках. По количеству К167 позитивных клеток рассчитывали индекс пролиферативной активности опухоли. Полученные величины сравнивали с эффективностью проведенной химиотерапии: с достижением полной ремиссии (ПР), частичной ремиссии (ЧР) и плохим эффектом (ПЭ). Последним термином объединяли эффект стабилизации заболевания, достижение менее, чем частичной ремиссии, прогрессирование заболевания и фатальный исход.

У 30% исследованных больных было выявлено слабой интенсивности накопление Р53. Достоверной корреляции между показателями накопления протеина и эффектами химиотерапии не наблюдалось. Р53 присутствовал в опухолевых клетках больных как с положительным или частично положительным эффектом на химиотерапию, так и резистентных к ней. Наименьшая интенсивность накопления ВСЬ2 (<68±26) отмечалась в опухолевых клетках больных, у которых в процессе лечения была достигнута ПР. По мере увеличения показателя накопления (>89±17) эффект химиотерапии ухудшался. Результаты корреляционного анализа показали существование достоверной умеренной положительной связи между коэффициентом накопления ВСЬ-2 и эффективностью химиотерапии первой линии у больных агрессивными формами НЛ. При исследовании Кл67 индекс пролиферативной активности опухоли до начала химиотерапии был достоверно ниже в группе больных, достигших ПР (0,37±0,14), чем у больных с ЧР или с ПЭ (0,69±0,23). При сравнении величин данного показателя в двух последних группах достоверного различия между ними не определялось.

Результаты проведенного исследования указывают на существование определенной зависимости эффекта химиотерапии от пролиферативной активности опухоли. Наиболее значимым в оценке зависимости эффекта химиотерапии у больных агрессивными формами НЛ, является определение показателя накопления ВСЬ2 в опухолевых клетках.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АПОПТОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК ПРИ ОСТРЫХ ЛЕЙКОЗАХ У ДЕТЕЙ

Шман Т.В.. Савицкий В.П.

Республиканский научно-практический центр детской онкологии и гематологии, Минск, Беларусь

Нарушение механизмов клеточной гибели (апоптоза) является причиной ряда заболеваний, в том числе онкологических, что объясняет большой интерес к проблемам апоптоза.

Целью нашей работы была оценка методами флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуориметрии способности опухолевых клеток к спонтанному (индуцированного культивированием in vitro) апоптозу при различных типах первичного острого лейкоза (ОЛ) у детей.

Обследовали детей в возрасте 0,5-17 лет, поступивших для лечения в РНПЦДОГ с диагнозом острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) и острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). Лей-кемические клетки, выделенные на градиенте плотности, культивировали в питательной среде RPMI-1640 с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина, смеси антибиотиков при 37°С во влажной атмосфере 5% С02 в течение 20 часов. Для определения спонтанного апоптоза использовали различные методы: флуоресцентная микроскопия с окрашиванием акридиновым оранжевым и бромистым этидием (АО+ЕВ); изменение митохондриального трансмембранного потенциала (ММП) выявляли с использованием ли-пофильного катионного зонда JC-1; определение разрывов нитей ДНК проводили с использованием APO-BRDU Kit; для детекции клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК клетки окрашивали раствором пропидия иодида (PI). Исследование апоптотических изменений проводили с использованием флуоресцентного микроскопа ЛЮМАМ РПО-11 (ЛОМО) и проточного цитофлуориметра FACScan (Becton Dickinson).

По данным всех используемых методов, опухолевые клетки лимфоидного происхождения оказались наиболее подвержены спонтанному апоптозу in vitro по сравнению с лейкеми-ческими клетками миелоидного происхождения (р<0,003). Достоверных различий между уровнем спонтанного апоптоза лейкемических клеток при Т-линейном по сравнению с В-линейным ОЛЛ не выявили (р>0,05).

Анализируя данные в пределах В-линейного ОЛЛ, выявили, что лейкемические клетки, находящиеся на ранних стадиях дифференцировки, характеризуются наименьшим уровнем спонтанного апоптоза (ргоВ). По данным морфологического анализа и учета апоптотических клеток по гиподиплоидному количеству ДНК увеличение спонтанного апоптоза при В-линейном ОЛЛ наблюдали в ряду proB<preB<commonB; по данным APO-BRDU Kit и исследовании митохондриального потенциала - в ряду proB< commonB<preB.

Использование нескольких методов, основанных на различных принципах, позволяет выявлять клетки как на ранних (падение ММП, разрывы ДНК, конденсация хроматина), так и на поздних стадиях (потеря ДНК, фрагментация хроматина) апоптотического процесса. Более высокие значения спонтанного апоптоза получены при учете ранних апоптотических изменений, наименьшие значения - при анализе поздних событий. По увеличению уровня спонтанного апоптоза при В-линейном ОЛЛ методы располагаются в следующем порядке: определение количества ДНК < морфологический анализ < изменение ММП < разрывы ДНК. Мы выявили положительные корреляционные связи между всеми методами. Наиболее высокие значения коэффициента корреляции (R) установлены при сравнении методов окрашивания АО + ЕВ и JC-1 (R = 0,8 при р=0,002), BrdU и JC-1 (R=0,8 при р<0,003).

Таким образом, наиболее чувствительными методами определения спонтанного (индуцированного культивированием in vitro) апоптоза лейкемических клеток, полученных от больных, являются методы детекции ранних этапов апоптоза: определение падения ММП, разрывов ДНК, конденсации хроматина. Одновременное использование нескольких методов позволяет выявить особенности апоптоза опухолевых клеток различного происхождения.

2002, Т. 4, Ns2

Онко гшмунол огия

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ЛИПОСОМАЛЬНОГО ДОКСОРУБИЦИНА НА ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ АКТИВНЫЙ РСР170

Шоуа И.Б.. Шпрах З.С., Полозкова А.П., Рыбалкииа Е.Ю., Логачева Н.П., Полосухина Е.Р., Оборотова Н.П., Барышников А.Ю.

НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва, Россия

Одним мі наиболее важных механизмов множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) является резистентность, обусловленная активностью транспортного белка Pgp 170 (продукт гена МОЇ? I).

Целью работы явилось исследование действия липосо-мального доксорубицина на опухолевые клетки, экспрессирующие активный Р§р 170,

Исследование чувствительности проводили in vitro, с помощью МТТ-теста, оценивая LD50 для резистентных клеток. Тестирование проводили в триплетах, на клеточной линии К562 экспрессирующей функционально активный Pgp 170. В качестве контроля использовали родительскую линию К562 не экспрессирующую Pgp 170 и свободный док-сорубицин. Препарат использовали в 10 концентрациях с шагом 2 (0,08; 0,04; 0,02; 0,01; 0,005; 0,0025; 0,001; 0,0005; 0,0002; 0,0001 мг/мл).

В контрольной линии LD50 достигалось при концентрации свободного доксорубицина 0,0002 мг/мл, тогда как для липосомального доксорубицина LD50 достигалось при 0,0005 мг/мл. Свободный доксорубицин у Pgp 170 положительной линии вызывал LD50 при концентрации 0,0025 мг/мл, тогда как липосомальная форма препарата при 0,0005 мг/мл (р<0,02). Таким образом липосомальный доксорубицин был в 5 раз более активный, чем свободный препарат.