CC BY
163
УДК 577.1 13.5, 577.151.4
Олигонуклеотидный микрочип
для идентификации генов карбапенемаз
молекулярных классов Д, B и D
М. М. Уляшова1, Ю. И. Халилова1, М. Ю. Рубцова1,2*, М. В. Эйдельштейн3,
И. А. Александрова4, А. М. Егоров1
1 Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 3
2 ЗАО «НПП ИММУНОТЕХ», 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 11А
3 НИИ антимикробной химиотерапии, Смоленская государственная медицинская академия, 214019, Смоленск, а/я 5
4 НИИ нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко РАМН, 125047, Москва, 4-я Тверская-Ямская ул., д. 16 *E-mail: [email protected]
Поступила в редакцию 23.08.2010 г.
РЕФЕРАТ Разработан метод гибридизационного анализа на ДНК-микрочипах для одновременной идентификации и типирования генов, кодирующих ферменты карбапенемазы, продуцируемые микроорганизмами -возбудителями инфекционных заболеваний. Метод состоит из нескольких этапов, включающих выделение ДНК из клинического образца, амплификацию генов карбапенемаз методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с одновременным включением биотина в качестве метки, гибридизацию меченого ПЦР-продукта с олигонуклеотидными зондами, иммобилизованными на поверхности ДНК-микрочипа на основе нитроцеллюлозы. Молекулы биотина в ДНК-дуплексах выявляются конъюгатом стрептавидин-пероксидаза хрена с последующей колориметрической детекцией фермента. Был выполнен дизайн оли-гонуклеотидных зондов и оптимизированы условия гибридизационного анализа на мембранных микрочипах для идентификации семи типов генов карбапенемаз, относящихся к молекулярным классам А, В и D с дополнительным типированием на подгруппы. Тестирование микрочипов проводили с использованием контрольных штаммов микроорганизмов, несущих гены карбапенемаз, охарактеризованных методом сек-венирования. Разработанный метод гибридизационного анализа применен для исследования клинических штаммов Pseudomonas spp. и Acinetobacter spp., продуцирующих карбапенемазы различных классов по данным фенотипических тестов. Все штаммы Acinetobacter baumanii, резистентные к карбапенемам, являлись носителями генов двух ОХА-карбапенемаз (ОХА-51 в сочетании с ОХА-23 (1 штамм), ОХА-40 (5 штаммов) или ОХА-58 (4 штамма)). У всех резистентных к карбапенемам штаммов Pseudomonas aeruginosa был обнаружен ген металло-Р-лактамазы VIM-2-типа. При тестировании штаммов, чувствительных к кар-бапенемам, гены карбапенемаз не обнаружены. Метод идентификации генов карбапенемаз на микрочипе характеризуется хорошей точностью и производительностью. Он может быть использован в клинических микробиологических лабораториях для идентификации и изучения эпидемиологии карбапенемаз. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА ДНК -микрочипы, пероксидаза хрена, колориметрическая детекция, антибиотикорези-стентность, карбапенемазы.
ВВЕДЕНИЕ
В течение последних 20 лет Р-лактамные антибиотики прочно удерживают одно из лидирующих положений в лечении широкого круга тяжелых инфекций, вызываемых грамотрицательными микроорганизмами. Среди них одной из наиболее удачных групп антибактериальных препаратов являются карбапе-немы, химическая структура которых изображена на рис. 1. Действие этой группы антибиотиков характеризуется широким спектром активности, низкой
токсичностью, хорошими фармакокинетическими параметрами [1]. Вместе с тем эффективность их применения в последнее время ограничена вследствие развития антибиотикорезистентности, или устойчивости микроорганизмов к действию антибиотиков. Устойчивые к карбапенемам штаммы микроорганизмов наиболее часто встречаются у возбудителей нозокомиальных (внутрибольничных) инфекций, относящихся к родам Pseudomonas spp. и Acinetobacter spp. В лечебных учреждениях РФ также отмечается
Рис. 1. Химическая структура карбапенемов. Р-Лактамное кольцо обозначено пунктиром.
заметный рост числа возбудителей, нечувствительных к действию карбапенемов, среди Pseudomonas aeruginosa число таких штаммов составляет уже 38% [2].
Формирование резистентности к Р-лактамным антибиотикам у представителей грамотрицатель-ных бактерий может быть связано с различными механизмами, включающими изменение проницаемости наружной клеточной мембраны из-за возникновения дефектов пориновых каналов [3, 4], активацией систем эффлюкса [5], однако наибольшее клиническое и эпидемиологическое значение имеет продукция бактериальных ферментов, гидролизующих Р-лактамное кольцо антибиотиков - Р-лактамаз [6, 7]. В настоящее время известные Р-лактамазы разделяют по структуре первичной последовательности белка на четыре молекулярных класса - А, B, С и D. Ферменты классов А, С и D относятся к гидролазам серинового типа, ферменты класса В являются металлосодержащими гидролазами, в активном центре которых содержатся один или два атома цинка [8]. Карбапенемазной активностью обладают представители разных молекулярных классов Р-лактамаз, однако наиболее распространенными и клинически важными в настоящее время являются карбапене-мазы KPC-типа из молекулярного класса A [9], пяти групп металло-Р-лактамаз (VIM, IMP, SPM, GIM, SIM) [10], а также ряд ферментов OXA-типа из молекулярного класса D (подгруппы OXA-23, OXA-40, OXA-51, OXA-58) [11].
Из всего многообразия Р-лактамаз именно карба-пенемазы представляют собой наибольшую угрозу, так как обладают высокой каталитической активностью и широким спектром субстратной специфичности, включающим практически все классы Р-лактамных антибиотиков. Вследствие плазмидной локализации генов распространение карбапенемаз среди возбудителей инфекционных заболеваний человека происходит достаточно быстро. В связи с многообразием и опасностью широкого распространения карбапенемаз необходимы надежные методы выявления продукции ферментов данного типа как для выбора оптимального способа лечения пациентов, так и для эпидемиологического контроля за распространением данного типа антибиотико-
резистентности. В настоящее время для этих целей в основном используются микробиологические тесты [6, 12, 13]. Однако они длительны и часто малоэффективны при определении типа карбапенемаз. Трактовка их результатов не всегда однозначна, особенно в случаях, когда наблюдается продукция нескольких типов Р-лактамаз одновременно. Определение ферментов ОХА-типа с помощью фенотипических тестов практически невозможно [14].
Предложено несколько методов на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) для идентификации генов металло-Р-лактамаз, принадлежащих к наиболее распространенным группам - VIM и IMP [15, 16], основных подгрупп карбапенемаз ОХА-типа [17]. Разработан метод мультиплексной ПЦР в режиме реального времени с последующим анализом кривых плавления полученных ампликонов для идентификации генов 5 групп металло-Р-лактамаз [18]. Однако мультиплексная способность метода ПЦР, как правило, ограничена, что не позволяет одновременно детектировать большое количество генов.
Перспективным методом идентификации как с точки зрения времени получения результата анализа, так и его информативности является метод гибридизационного анализа на ДНК-микрочипах. Данная технология имеет значительные преимущества перед традиционными методами, так как позволяет проводить многопараметрический анализ, а также миниатюризировать исследуемый образец, что значительно снижает стоимость анализа и время его проведения [19, 20].
Целью данной работы являлась разработка метода гибридизационного анализа на мембранных ДНК-микрочипах с колориметрической детекцией для определения генов карбапенемаз, относящихся к молекулярным классам A, B и D.
экспериментальная часть
Набор праймеров для амплификации генов карба-пенемаз и аминомодифицированные олигонуклео-тидные зонды были синтезированы фирмой «Син-тол» (Москва, Россия). Образцы бактериальной ДНК, выделенные из контрольных штаммов A. baumanii, Ps. aeruginosa, Escherichia coli и Klebsiella pneumonia, продуцирующих карбапенемазы VIM-1, VIM-2, VIM-4, VIM-7, IMP-1, IMP-2, SPM-1, OXA-23, 0XA-40, OXA-51, OXA-58, KPC-3, предоставлены сотрудниками НИИ антимикробной химиотерапии Смоленской государственной медицинской академии. Культуры клеток микроорганизмов семейства Еп-terobacteriaceae, A. baumanii и Ps. aeruginosa, чувствительные и устойчивые к действию карбапенемов по данным фенотипического определения на автоматическом анализаторе VITEK (BioMerieux, Фран-
ция), предоставлены сотрудниками НИИ нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко.
Выделение бактериальной ДНК
Выделение бактериальной ДНК из суспензии культуры исследуемого микроорганизма, содержащей не менее 105 КОЕ/мл, проводили с помощью температурного лизиса в буфере. Для этого 500 мкл суспензии помещали в центрифужные пробирки и осаждали микробные клетки центрифугированием в течение
1 мин при 10000 g. Супернатант удаляли, добавляли 100 мкл буфера (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7.5) и ресуспендировали осадок с помощью шейкера. Пробирки инкубировали в твердотельном термостате в течение 20 мин при 990С. После термостатиро-вания образцы центрифугировали в течение 1 мин при 10000 g. Для ПЦР использовали 1 мкл супернатанта.
Амплификация генов карбапенемаз методом мультиплексной ПЦР с одновременным введением биотина в качестве метки
Амплификацию фрагментов генов карбапенемаз молекулярных классов A, B и D с одновременным включением биотина в качестве метки проводили в процессе двух мультиплексных ПЦР (в одной реакции амплифицировались гены всех групп металло-Р-лактамаз, а в другой - гены Р-лактамаз ОХА- и КРС-типов). Каждая мультиплексная ПЦР проводилась в объеме 25 мкл, содержащем 10 мМ Трис-НС1-буфер с 2.5 мМ ацетата магния, 50 мМ КС1, рН 8.3, 2.5 ед. Taq-ДНК-полимеразы, 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, 60 мкМ dTTP, 40 мкМ dUTP-11-биотин (Fer-mentas, Германия), по 0.4 мкМ прямого и обратного праймеров для каждой группы карбапенемаз и 1 мкл раствора матрицы ДНК. Амплификацию проводили в амплификаторе Mastercycler gradient (Eppendorf, Германия) по следующему протоколу: начальная денатурация при 94°С (2 мин), 25 циклов амплификации (20 с - денатурация при 94°С, 30 с - отжиг праймеров при 65°С, 1 мин - элонгация при 72°С), завершающий этап элонгации при 72 °С (6 мин). Горизонтальный электрофорез продуктов ПЦР проводили в геле 1% агарозы с использованием ТАЕ-буфера (40 мМ Трис, 20 мМ уксусной кислоты, 1 мМ ЭДТА, рН 8.5) и с добавлением бромистого этидия до конечной концентрации 1.6 мкг/мл. Визуализацию проводили на УФ-трансиллюминаторе при длине волны 260 нм.
Фрагментация ПЦР-продуктов
Фрагментацию ДНК проводили при комнатной температуре в течение 5 мин. Для этого амплифициро-ванную ДНК растворяли до конечной концентрации 30 нг/мкл в реакционном буфере (40 мМ Трис-HCl,
10 мМ MgSO4, 1 мМ CaCl2, pH 8.0) и добавляли ДНКазу I (Promega, Германия). Реакцию останавливали, добавляя 3 мМ ЭДТА и инкубируя 10 мин при 65° С.
Иммобилизация олигонуклеотидных зондов на мембранном ДНК-микрочипе
В качестве мембранного носителя для ДНК-микрочипов использовали нитроцеллюлозу BioTrace NT (Pall Corporation, США). Модификация мембран осуществлялась с помощью 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (Sigma, США) по методике, описанной в [21]. Для иммобилизации олигонуклеотиды растворяли в солевом буфере (160 мМ Na2SO4, 130 мМ Na2HPO4) до концентрации 20 мкМ и наносили роботом XactIITM Arrayer (LabN-EXT Inc., США) с иглами диаметром 300 мкм на мембраны, после чего мембраны инкубировали в термостате при 60°С в течение 30 мин.
Гибридизация на ДНК-микрочипе
Перед проведением гибридизации микрочипы отмывали буфером ФСБТ (0.01 М К2НРО4, 0.15 М NaCl, 0.05% Твин-20, рН 7.0) 2 раза по 10 мин при комнатной температуре и блокировали в растворе 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 1% казеина (Sigma, США) в буфере ФСБ (0.01 М К2НРО4, 0.15 М NaCl, рН 7.0) при 37 °С в течение 30 мин. 500 нг фрагментированной меченой ДНК растворяли в гибридизаци-онном буфере 2х SSPE (0.3 М NaCl, 0.02 М NaH2PO4,
2 мМ ЭДТА, рН 7.4), содержащем 1.6 пмоль/мл контрольного олигонуклеотида, меченного биотином (положительный контроль гибридизации). Микрочип помещали в гибридизационную смесь (300 мкл на 1 микрочип) и инкубировали в течение 1 ч при 45°С в термомиксере Thermomixer comfort (Eppendorf, Германия). После гибридизации проводили отмывку мембран ФСБТ - 2 раза по 15 мин при комнатной температуре.
Детекция и обработка результатов гибридизации
Для детекции результатов гибридизации микрочипы инкубировали в ФСБТ, содержащем конъюгат стрептавидин-пероксидаза хрена (Имтек, Россия) в концентрации 0.2 мкг/мл в ФСБТ, в течение 30 мин при 37 °С. Далее микрочипы отмывали ФСБТ 10 мин, ФСБ 10 мин при комнатной температуре при перемешивании и помещали на 10 мин в субстратный раствор на основе 3,3 ',5,5 '-тетраметилбензидина (ТМБ) и Н2О2 (НВО Иммунотех, Россия) с добавлением дек-странсульфата натрия (M = 8000, Pharmacia, Швеция) до конечной концентрации 0.5% (по массе), после чего их промывали дистиллированной водой и сушили на воздухе. Мембранные микрочипы сканировали на сканере Perfection V750 Pro (Epson, Германия)
при разрешении 4800 dpi. Полученные изображения (в TIFF-формате) анализировали с использованием программы Scan Array Express (PerkinElmer, version 3.0, Германия) и определяли значения интенсивностей аналитических сигналов в различных участках микрочипа. Далее значения абсолютных интенсивностей сигналов переводили в относительные нормированием на усредненную интенсивность положительного контроля гибридизации на данном микрочипе.
результаты и обсуждение
Молекулярный дизайн олигонуклеотидных зондов
На настоящий момент в Международном банке данных GenBank имеется информация о 10 ферментах KPC-типа, 52 металло-Р-лактамазах (23 фермента из группы IMP, 26 - из группы VIM и по одному представителю из групп SPM, SIM и GIM), а также 70 карбапенемазах из группы ОХА. Выравнивание аминокислотных и кодирующих последовательностей данных ферментов показало, что лишь ферменты группы KPc имеют высокую степень гомологии внутри группы (отличаются друг от друга наличием 1-2 аминокислотных замен), тогда как многочисленные представители групп IMP, VIM и OXA отличаются друг от друга по своим последовательностям достаточно сильно. В связи с этим каждую из этих групп дополнительно разделили на подгруппы, внутри которых гены ферментов по своим нуклеотидным последовательностям имели высокую степень гомологии. Так, в группе VIM было выделено 3 подгруппы
ферментов (VIM-1, VIM-2 и VIM-7), в группе IMP -
6 подгрупп (IMP-1, IMP-2, IMP-5, IMP-11, IMP-12 и IMP-14), а карбапенемазы группы OXA были разделены на 4 подгруппы - ОХА-23, OXA-40, OXA-51 и OXA-58. Разделение карбапенемаз на группы и подгруппы на основании выравнивания аминокислотных последовательностей и их соответствие молекулярным классам Р-лактамаз приведены на рис. 2.
Основным этапом разработки ДНК-микрочипа являлся выбор последовательностей олигонуклео-тидных зондов для определения генов карбапенемаз различных групп. Выбор последовательностей олигонуклеотидов для идентификации группы ферментов осуществлялся на основе выравнивания кодирующих последовательностей генов всех карбапенемаз, принадлежащих к данной группе. Для этого находили достаточно протяженный участок гена, последовательность которого была консервативна для всех представителей группы и содержала не менее 18 нуклеотидов. Для них рассчитывали температуру плавления, G/C-состав и свободную энергию образования димеров и вторичных структур. Для гибри-дизационного анализа на микрочипах отбирали олигонуклеотиды, для которых вероятность образования вторичных структур была минимальна и температуры плавления различались не более чем на 10°С. На основе выбранных последовательностей синтезировали по два олигонуклеотидных зонда, последовательность которых была комплементарна прямой и обратной цепи гена. Для дополнительного типиро-вания генов IMP, VIM и ОХА карбапенемаз на уров-
Сериновые
~тг
м
А
I '
KPC
OXA
Бета-лактамазы
Молекулярные классы ферментов
Металлоферменты (Zn2+)
~т
Группы
карбапенемаз
IMP
SPM
гг
OXA-23 Подгруппы IMP-1
OXA-40 карбапенемаз IMP-2
OXA-51 IMP-5
OXA-58 IMP-11
IMP-12
IMP-14
VIM-1
VIM-2
VIM-7
vim
■I
SIM
GIM
Рис. 2. Разделение карбапенемаз на группы и подгруппы на основании выравнивания аминокислотных последовательностей и их соответствие молекулярным классам р-лактамаз.
В
D
не подгрупп последовательности олигонуклеотидных зондов выбирали на основе гомологичных участков генов, не содержащих мутаций внутри данной подгруппы и не имеющих гомологии с генами других подгрупп. Чтобы повысить специфичность анализа, для идентификации каждой подгруппы ферментов выбирали по два варианта олигонуклеотидных зондов, соответствующих разным участкам гена. В этом случае синтезировали зонды, последовательность которых была комплементарна обратной цепи гена.
Последовательности выбранных олигонуклеотидов и их основные характеристики представлены в табл. 1. Длина зондов варьировала от 18 до 27 нуклеотидов, G/C-состав - от 30 до 60%, температура плавления - в диапазоне 63-72°С. Во все зонды были введены дополнительные спейсеры на 5’-кон-це, удаляющие зонд от поверхности носителя, что позволило снизить стерические затруднения при гибридизации и повысить доступность зонда для ДНК-мишени. Было установлено, что оптимальным является использование спейсера из 13 тимидиновых остатков, добавление дополнительных остатков тимидина не оказало существенного влияния на величину получаемых абсолютных гибридиза-ционных сигналов и специфичность гибридизации (данные не приводятся).
Амплификация генов карбапенемаз различных молекулярных классов с одновременным включением метки
Для амплификации генов карбапенемаз, относящихся к молекулярным классам A, B и D, разрабатывали метод мультиплексной ПЦР с одновременным введением метки - биотина. Для введения метки использовали меченный биотином дезоксирибоури-динтрифосфат (dUTP), который включался в цепь ДНК одновременно с немеченым дезоксириботи-мидинтрифосфатом (dTTP). В качестве матрицы для ПЦР использовали бактериальную ДНК, выделенную из контрольных штаммов микроорганизмов-продуцентов Р-лактамаз VIM-1, VIM-2, VIM-7, IMP-1, IMP-2, SPM-1, OXA-23, 0XA-40, OXA-51, OXA-58 и KPC-3.
Выбор праймеров для амплификации генов кар-бапенемаз различных групп осуществлялся на основе ранее выполненного выравнивания кодирующих последовательностей генов ферментов данных групп. В качестве праймеров для амплификации полноразмерных генов карбапенемаз группы KPc и металло-Р-лактамаз групп SPM, SIM и GIM выбирались консервативные для группы участки последовательностей, расположенные на концах генов. Для металло-Р-лактамаз групп IMP, VIM и карбапенемаз OXA-типа консервативные участки на концах
генов длиной более 20 п.н. найти не удалось в связи с низкой гомологией ферментов внутри данных групп, поэтому праймеры были выбраны отдельно для каждой подгруппы.
Длина праймеров (20 - 28 нуклеотидов) подбиралась таким образом, чтобы температура плавления была в диапазоне 62 - 680С, что позволяло бы одновременно амплифицировать все типы генов с одинаковой эффективностью. При выборе структур праймеров учитывали G/C-состав и отбирали структуры, для которых содержание G/c находилось в диапазоне 30 - 60%. Также оценивали вероятность образования праймер-димеров и вторичных структур и выбирали те последовательности, для которых такая вероятность была минимальна. В результате, для каждой группы ферментов было выбрано по нескольку прямых и обратных праймеров, различающихся по своим параметрам. Их различные комбинации были проверены в ПЦР в условиях амплификации специфических для них генов, и пара праймеров, позволяющая получить наиболее специфические ПЦР-продукты с хорошим выходом реакции, была использована в дальнейшем для мультиплексной ПЦР. Последовательности данных праймеров представлены в табл. 2.
Для выбора температуры отжига праймеров для мультиплексной амплификации всех типов генов карбапенемаз сначала определяли оптимальные температуры отжига (Т ) для каждой пары праймеров отдельно в условиях специфических реакций, затем для мультиплексной ПЦР в качестве Та выбирали наименьшую. Диапазон значений исследуемых Т праймеров составил 52 - 68оС. Оптимальной Т оказалась температура 60°С, при которой для всех типов генов наблюдался эффективный синтез только специфических ПЦР-продуктов.
После оптимизации условий амплификации генов карбапенемаз с выбранными праймерами была исследована возможность проведения мультиплексной ПЦР с 16 парами праймеров для одновременной амплификации генов карбапенемаз всех рассматриваемых групп. Однако в этих условиях для большинства карбапенемаз специфический продукт амплификации отсутствовал либо выход продукта амплификации был очень низким, что делало невозможным последующее проведение гибридизационного анализа на микрочипах. Поэтому было решено проводить амплификацию генов карбапенемаз в процессе двух мультиплексных ПЦР: одну - со смесью праймеров для металло-Р-лактамаз (11 пар праймеров), а другую - со смесью праймеров для ОХА и КРС карбапе-немаз (5 пар праймеров). Результаты электрофоретического разделения ПЦР-продуктов, полученных при амплификации генов различных карбапенемаз
Таблица 1. Последовательности специфических и контрольных олигонуклеотидных зондов
Название Нуклеотидная последовательность, 5’^3’ Длина, нуклеотиды G/C, % Т , °С пл
Контрольные олигонуклеотиды
Контроль иммобилизации TCTAGACAGCCACTCATA-Биотин 18 44.4 60.4
Положительный контроль гибридизации GATTGGACGAGTCAGGAGC 19 57.9 66.1
Отрицательный контроль гибридизации TCTAGACAGCCACTCATA 18 44.4 60.4
Олигонуклеотидные зонды для определения группы карбапенемаз
KPC прямой GCTTCCCACTGTGCAGCTCATTC 23 56.5 72.0
KPC обратный GAATGAGCTGCACAGTGGGAAGC 23 56.5 72.0
VIM прямой GGAGATTGAAAAGCAAATTGGACT 24 37.5 66.6
VIM обратный AGTCCAATTTGCTTTTCAATCTCC 24 37.5 66.6
IMP прямой GGAATAGAGTGGCTTAATTCTCG/A 23 41.3 64.7
IMP обратный C/TGAGAATTAAGCCACTCTATTCC 23 41.3 64.7
SPM прямой GATGGGACCGTTGTCATTG 19 52.6 64.9
SPM обратный CAATGACAACGGTCCCATC 19 52.6 64.9
SIM прямой CCTTGGCAATCTAAGTGACGCAA 23 47.8 69.7
SIM обратный TTGCGTCACTTAGATTGCCAAGG 23 47.8 69.7
GIM прямой CACACTGGGAAATGGGCTTATA 22 45.5 66.7
GIM обратный TATAAGCCCATTTCCCAGTGTG 22 45.5 66.7
OXA прямой CCACAA/GGTG/AGGC/TTGGTTG/AAC 20 55.0 67.0
OXA обратный GTC /AAACCAG/ACCC/TACT/CTGTGG 20 55.0 67.0
Олигонуклеотидные зонды для определения подгруппы карбапенемаз
VIM-1_568 TCAGCGAACGTGCTATACGG 20 55.0 68.3
VIM-1_590 GTTGTGCCGTTCATGAGTTGT 21 47.6 67.9
VIM-2_568 TCTGCGAGTGTGCTCTATGG 20 55.0 67.9
VIM-2_590 GTTGTGCGATTTATGAGTTGT 21 38.1 63.7
VIM-7_127 GTTCGGCTGTACAAGATTGGCG 22 54.5 70.0
VIM-7_181 CTCGGTGACACGGTGTAC 18 61.1 65.8
IMP-1_135 GTGGGGCGTTGTTCCTAAACATG 23 52.2 70.2
IMP-1_387 GGTTCAAGCCACAAATTCATTTAGC 25 40.0 67.8
IMP-2_264 TCAAAGGCACTATTTCCTCACATTTC 26 38.5 68.2
IMP-2_497 TACCTGAAAAGAAAATTTTATTCGGTG 27 29.6 65.7
IMP-5_506 AATAGAGTTTTGTTCGGTGGTT 22 36.4 65.0
IMP-5_459 TGGTCCAGGGCACACTCC 18 66.7 70.4
IMP-11_570 TGTTGAAGCATGGCCACATT 20 45.0 67.6
IMP-11_621 TGCAAAACTGGTTGTTCCAAGCC 23 47.8 70.9
IMP-12_226 AAATTAGTTGCTTGGTTTGTAGGG 24 37.5 66.4
IMP-12_495 GCTACCTGAAAACAAAATTTTATTCG 26 30.8 64.8
IMP-14_292 GGTGACAGTACGGCTGGAATAG 22 54.5 68.4
IMP-14_374 AAAAAGACAATAAGGTACAAGCTA 24 29.2 63.4
OXA-23_225 AAATACAGAATATGTGCCAGCCTCT 25 40.0 68.8
0XA-23_309 GAAGGGCGAGAAAAGGTCATTTAC 24 45.8 68.0
0XA-40_225 AAATAAAGAATATGTCCCTGCATCA 25 32.0 65.6
0XA-40_329 GAACTTATCCTATGTGGGAGAAAG 24 41.7 64.8
OXA-51_225 TTCGACCGAGTATGTACCTGCTTCG 25 52.0 71.7
OXA-51_578 GCCCAAAAGTCCAAGATGAAG 21 47.6 65.8
OXA-58_225 AAAAACAGCTTATATTCCTGCATCT 25 32.0 66.0
0XA-58_206 GCACGCATTTAGACCGAGC 19 57.9 67.7
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Таблица 2. Последовательности праймеров для мультиплексных ПЦР-амплификаций генов карбапенемаз
Тип Последовательность 5’^3’ Длина, нуклеотид G/C, % Т , °С пл’ Размер ПЦР-продукта, п.н.
KPC прямой TTCTGCTGTCTTGTCTCTCATGG 23 47.8 64.7 801
обратный CCTCGCTGTGCTTGTCATCC 20 60.0 65.7
IMP-1 прямой GGCGTTTATGTTCATACTTCGTTTG 25 40.0 64.4 584
обратный GTAAGTTTCAAGAGTGATGCGTCTCC 26 46.2 65.6
IMP-2 прямой GGTGTTTATGTTCATACATCGTTCG 25 40.0 63.8 584
обратный GTACGTTTCAAGAGTGATGCGTCCCC 26 53.8 67.8
IMP-5 прямой GGTGTTTATGTTCATACTTCGTTTG 25 36.0 62.5 584
обратный GTACGTTTCAAGAGTGATACATCTCC 26 42.3 63.4
IMP-11 прямой GGTGTTTATGTTCATACATCGTTTG 25 36.0 62.6 584
обратный GTAAGCTTCAAGAGCGACGCATCTCC 26 53.8 67.8
IMP-12 прямой GGTGTTTATCTTCATACATCTTTTG 25 32.0 60.5 584
обратный GTAAGTTTCAAGAGTGATGCGTTCCC 26 46.2 66.0
VIM-1 прямой GTAGTTTATTGGTCTACATGACCGCGTC 28 46.4 66.9 743
обратный CGCTGTGTGCTGGAGCAAGTC 21 61.9 68.1
VIM-2 прямой GTAAGTTATTGGTCTATTTGACCGCGTC 28 42.9 65.9 743
обратный CGTTGTGTGCTTGAGCAAGTC 21 52.4 64.7
VIM-7 прямой AGCATATTCCGCACAGCCTGG 21 57.1 67.5 685
обратный CCGGGCGGTCTGGAATTGCTC 21 66.7 67.7
SPM прямой CGTTTTGTTTGTTGCTCGTTGCGGG 25 52.0 67.4 648
обратный CCTTCACATTGGCATCTCCCAGATAAC 27 48.1 67.2
SIM прямой GTTTGCGGAAGAAGCCCAGCC 21 61.9 68.6 613
обратный CTCCGATTTCACTGTGGCTTGGG 23 56.5 67.6
GIM прямой CTTGTAGCGTTGCCAGCTTTAGCTC 25 52.0 67.8 638
обратный CTGAACTTCCAACTTTGCCATGCC 24 50.0 66.9
OXA-23 прямой GAAACCCCGAGTCAGATTGTTCAAG 25 48.0 65.8 686
обратный GGCATTTCTGACCGCATTTCC 21 52.4 64.8
0XA-40 прямой GTTTCTCTCAGTGCATGTTCATC 23 43.5 62.3 714
обратный CATTTCTAAGTTGAGCGAAAAGGGG 25 44.0 64.6
OXA-51 прямой CGAAGCACACACTACGGGTG 20 60.0 65.4 649
обратный CTCTTTTCGAACAGAGCTAGGTATTC 26 42.3 63.4
OXA-58 прямой CTTGTGCTGAGCATAGTATGAGTC 24 45.8 63.3 684
обратный CCACTTGCCCATCTGCCTTTTC 22 54.5 66.5
из контрольных штаммов микроорганизмов, представлены на рис. 3.
Выход меченых специфических продуктов мультиплексных ПЦР для всех типов исследуемых карбапенемаз составил 40-50 нг/мкл, что являлось достаточным для дальнейшего проведения гибриди-зационного анализа на микрочипах. Амплификация неспецифических продуктов наблюдалась только для генов подгрупп VIM-1 и VIM-2, однако выход их был небольшим, и, как показали последующие экс-
перименты, их наличие не влияло на специфичность гибридизационного анализа.
Олигонуклеотидный микрочип для определения генов карбапенемаз молекулярных классов А, B и D
ДНК-микрочип для идентификации основных типов карбапенемаз представлял собой нитроцеллюлозную подложку размером 6.0 х 9.5 мм, на которой в определенном порядке были иммобилизованы 40 олигонукле-отидных зондов (14 зондов для идентификации генов
а KPC-3 OXA-23 0XA-40 OXA-51 OXA-58 Маркеры б VIM-1 VIM-2 VIM-7 IMP-1 IMP-2 SPM-1 Маркеры
1 |^м| 2000 1500 1000
750 500 250
1500
1000
750
500
250
Рис. З. Электрофореграммы продуктов мультиплексных ПЦР для амплификации генов карбапенемаз OXA-и КРС-типов (а) и металло-Р-лактамаз (б).
7 различных групп карбапенемаз и 26 зондов для дополнительного типирования генов на подгруппы). Также каждый микрочип содержал 3 типа контрольных олигонуклеотидов: контроль иммобилизации (олигонуклеотид, меченный биотином), положительный контроль гибридизации (олигонуклеотид, нуклеотидная последовательность которого комплементарна меченному биотином олигонуклеотиду, добавляемому к гибридизационной смеси), отрицательный контроль гибридизации (олигонуклеотид со случайной последовательностью оснований). Для повышения воспроизводимости анализа каждый олигонуклеотидный зонд наносился на микрочип в трех повторах. Схема расположения специфических и контрольных олигону-
клеотидных зондов на поверхности ДНК-микрочипа изображена на рис. 4.
Процесс идентификации генов карбапенемаз методом гибридизационного анализа на ДНК-микрочипе состоял из следующих этапов: 1) амплификации гена Р-лактамазы из клинического материала ДНК в процессе двух мультиплексных ПЦР; 2) гибридизации меченной биотином ДНК с олигонуклеотидными зондами на поверхности микрочипа; 3) детекции результатов гибридизации с использованием конъюгата стрептавидин-пероксидаза с последующей колориметрической детекцией фермента.
Нами была проведена оптимизация условий гибридизации. Диапазон исследованных температур
а
® ID—MP 9 9 9 ID VIM • • • ID OXA
:• • 1 » Ш 9 ;o о о;
IMP-1 і*-*" . VIM-1.... \]9 9 9 ,. OXA-23. , :0 О 0:
• • :9 9 9 !0. 0 ..O.i
imp-2 :• • VIM-2.... ■ 19 9 9
і І9...9..9 LO О Oi
IMP-5 ....VIM-7.... OXA-51
;• • і :• • • ГО О Oi
,9.9... IMR-J.1. і 19..9..9 id-spm iO...Q...Qi [®OXA^i
[9 9 ![•••![©• O:
IMP-12 :#-#• ID-SIM ID KPC jUT-T"#;
і'• • І9.9 9 19.. •...•]
IMP-14 ID GIM
: 9 9
9 9 • • • • • •
б
Рис. 4. а - Схема расположения специфических и контрольных олигонуклеотидных зондов на поверхности ДНК-микрочипа для определения генов карба-пенемаз классов A, В и D. б -Результат гибридизационного анализа на ДНК-микрочипе контрольного образца Ps. aeruginosa, продуцирующего карбапенемазу VIM-1.
ф Контроль иммобилизации ф Положительный контроль гибридизации Отрицательный контроль гибридизации Зонды для идентификации генов металло-Р-лактамаз Зонды для идентификации генов карбапенемаз ОХА-типа Ф Зонды для идентификации генов карбапенемаз КРС-типа
а
Рис. 5. Результаты гибридизационного анализа на ДНК-микрочипе контрольных образцов Ps. aeruginosa (а, б) и A. baumanii (в), продуцирующих карбапенемазы VIM-1 (а), IMP-1 (б), OXA-51 и OXA-40 (в).
гибридизации составил от 40 до 50°С: он не превышал температуру плавления (Т ) отдельных олигону-клеотидных зондов и ограничивался температурой, при которой наблюдали высокий уровень неспецифической гибридизации. При проведении гибридизации при температуре 40°С интенсивность сигналов была достаточно высокой, однако при этом для большинства зондов наблюдали перекрестную гибридизацию с фрагментами генов других карбапенемаз. При проведении гибридизации при 50°С интенсивность ги-бридизационных сигналов была низкой для многих
зондов. Поэтому в качестве оптимальной температуры для проведения гибридизации была выбрана температура, равная 45°С. В качестве гибридизационного буфера использовали буфер 2х SSPE с добавлением 0.2 % додецилсульфата натрия для улучшения смачиваемости мембраны.
Критическим параметром, определяющим эффективность гибридизации, оказался размер меченой ДНК-мишени. Гибридизация меченых ПЦР-продуктов, размер которых составлял 580-800 нуклеотидов, с соответствующими олигонуклеотид-ными зондами характеризовалась сигналами небольшой интенсивности. Дополнительная фрагментация с помощью ДНКазы до фрагментов размером 50-150 нуклеотидов приводила к значительному увеличению интенсивности гибридизационных сигналов практически для всех зондов.
Оптимизация времени гибридизации была проведена в диапазоне от 0.5 до 4.0 ч. Было показано, что реакция гибридизации меченной биотином ДНК с иммобилизованными на микрочипе зондами достигает состояния равновесия в течение 2 ч при интенсивном перемешивании. Также было установлено, что при проведении реакции гибридизации в кинетическом режиме (1 ч) интенсивность регистрируемых сигналов незначительно ниже равновесных значений (на 10 - 20% в зависимости от типа зонда), при этом специфичность анализа сохранялась на хорошем уровне, что позволяло достоверно идентифицировать наличие генов всех типов карбапенемаз в гибридиза-ционной смеси.
На рис. 5 приведены результаты тестирования на ДНК-микрочипе контрольных штаммов микроорганизмов, продуцирующих металло-Р-лактамазы VIM-1 и IMP-1 и карбапенемазы OXA-51 и 0ХА-40. Идентификацию группы Р-лактамазы проводили по интенсивности гибридизации с групп-специфическим зондом, дополнительное типирование проводили по интенсивности гибридизации с подгрупп-специфическими зондами. К преимуществам метода гибридизационного анализа на микрочипах можно отнести возможность одновременной детекции нескольких генов, что было продемонстрировано при тестировании карбапенемаз ОХА-типа, продуцируемых контрольным штаммом A. baumanii.
Тестирование клинических штаммов микроорганизмов, устойчивых к действию карбапенемов
Разработанный ДНК-микрочип был апробирован на клинических штаммах грамотрицательных микроорганизмов, устойчивых и чувствительных к действию карбапенемов по данным фенотипирования. В табл. 3 представлены результаты тестирования 28 клинических штаммов Ps. aeruginosa, A. baumanii
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Таблица 3. Результаты тестирования клинических образцов на ДНК-микрочипе
Тип микроорганизма Чувствительность к карбапенемам по данным фенотипирования Число образцов Типы найденных карбапенемаз
OXA-23 OXA-40 OXA-51 OXA-58 VIM-2
A. baumanii Резистентные 10 1 5 10 4 -
Ps. aeruginosa 11 - - - - 11
A. baumanii Чувствительные 2 - - - - -
K. pneumonia 3 - - - - -
E. coli 2 - - - - -
и Enterobacteriaceae spp. с различным уровнем чувствительности к карбапенемам, полученных из НИИ нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко и НИИ антимикробной химиотерапии Смоленской государственной медицинской академии. Все штаммы A. baumanii, резистентные к карбапенемам по данным фенотипических тестов, были продуцентами генов двух ОХА-карбапенемаз (ОХА-51 и ОХА-23 (1 штамм), ОХА-40 (5 штаммов), ОХА-58 (4 штамма)). У всех резистентных к карбапенемам штаммов Ps. aeruginosa был обнаружен ген металло-Р-лактамазы VIM-2-типа. При тестировании штаммов, чувствительных к карбапенемам, гены карбапенемаз не обнаружены. Таким образом, результаты гибридизационного анализа на ДНК-микрочипах хорошо согласуются с данными фенотипирования. Кроме того, для двух образцов -одного A. baumanii и одного Ps. aeruginosa, резистентных к действию карбапенемов, структура обнаруженных карбапенемаз ОХА-40, ОХА-51 и VIM-2 была подтверждена методом секвенирования.
Таким образом, разработанный метод гибриди-
зационного анализа на ДНК-микрочипах для идентификации и типирования генов карбапенемаз характеризуется хорошей точностью и производительностью и может быть использован в клинических микробиологических лабораториях для идентификации и изучения эпидемиологии карбапенемаз. Используемые в настоящее время фенотипические тесты длительны по времени (от 24 до 48 ч) и не всегда эффективны при определении карбапенемаз, особенно карбапенемаз ОХА-типа. Идентификация генов карбапенемаз на ДНК-микрочипах позволяет осуществлять быструю диагностику, весь анализ от выделения культуры клеток до получения конечного результата занимает около 4.5 ч, включая 0.5 ч на выделение бактериальной ДНК, 1.5 ч на амплификацию генов карбапенемаз и фрагментацию полученных ПЦР-продуктов, 1.5 ч на гибридизацию с последующей отмывкой и 1 ч на колориметрическую детекцию результатов гибридизации. Важной особенностью метода является возможность идентификации нескольких генов в одном образце одновременно.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Галкин Д.В. // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2007. Т. 9. С. 133-152.
2. Skleenova Е., Shevchenko O., Edelstein M., et al. // Abstracts of 20th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Vienna, Austria, 2010, 10-13 April. O 562.
3. Livermore D. // J. Antimicrob. Chemother. 2001. V. 47.
P. 247-250.
4. Jacoby G., Mills D.M. // Antimicrob. Agents Chemother. 2004. V. 48. P. 3203-3206.
5. Ziha-Zarifi I., Llanes C. // Antimicrob. Agents Chemother. 1999. V. 43. P. 287-291.
6. Queenan A.M., Bush K. // Clin. Microbiol. Rev. 2007. V. 20.
P. 440-458.
7. Miriagou V., Cornaglia G., Edelstain M. // Clin. Microbiol. Infect. 2010. V. 16. P. 112-122.
8. Bush K., Jacoby G. // Antimicrob. Agents Chemother. 2010.
V. 54. P. 969-976.
9. Rasmussen J.W., Hoiby N. // J. Antimicrob. Chemother. 2007. V. 60. P. 470-482.
10. Walsh T.R., Toleman M.A. // Clin. Microbiol. Rev. 2005. V. 18. P. 306-325.
11. Rasmussen J.W., Hoiby N. // J. Antimicrob. Chemother. 2006. V. 57. P. 373-383.
12. Moland E.S., Hong S.G. // Clin. Microbiol. Newsletter. 2008.
V. 30. P. 79-85.
13. Noval M.J., Menezes G.A., Harish B.N., et al. // Indian. J.
Med. Res. 2009. V. 129. P. 707-712.
14. Poirel L., Naas Т., Nordmann P. // Antimicrob. Agents Chemother. 2010. V. 54. P. 24-38.
15. Шевченко О.В., Эйдельштейн М.В., Степанова М.Н.
// Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2007. Т. 9.
С. 211-218.
16. Pitout J.D., Gregson D.B., Poirel L. // J. Clin. Microbiol. 2005. V. 43. P. 3129-3135.
17. Woodford N., Ellington M. // Int. J. Antimicrobial Agents. 2006. V. 27. P. 351-353.
18. Mendes R.E., Kiyota K.A. // J. Clin. Micribiol. 2007. V. 45.
P. 544-547.
19. Bilitewski U. // Methods Mol. Biol. 2009. V. 509. P. 1-14.
20. Ehrenreich A. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. V. 73.
P. 255-273.
21. Zhang Y., Coyne M.Y., Will S.G., et al. // Nucl. Acids Res. 1991. V. 19. P. 3929-3935.
