CC BY
66
конфликт [3]. Во-вторых, хрящевая ткань тел позвонков на 70% представлена низкодифференцированными хондробластами с высоким пролиферативным потенциалом. Можно полагать, что трансплантация клеток в составе тканеинженерной конструкции в дефект суставного хряща не будет провоцировать развитие иммунного воспаления, а пролиферация и синтез хондробластами основных биополимеров хряща позволит заполнить дефект.
Использование в клеточных технологиях хрящевой ткани пластинки роста плодов 76-100-суточного возраста менее оправдано. Это объясняется тем, что в данные периоды фетальная хрящевая ткань обладает более низким пролиферативным потенциалом, а дифференцированные клетки экспрессируют белки, провоцирующие иммунный конфликт между клетками тканей реципиента и донора.
Выводы
1. Ядерно-цитоплазматическое отношение и форма ядра клетки являются морфологическими признаками дифференцировки клеток хондрогенного дифферона.
2. Хрящевая ткань зоны роста тела позвонка плода свиньи 45-суточного возраста является оптимальным источником клеточного материала для тканеинженерных конструкций.
Литература
1. Дедух, Н.В. Гормональная регуляция процессов развития / Н.В. Дедух, Е.Я. Панков // Успехи совр. биологии. - 1988. - № 6. - С. 454-469.
2. Принципы поляризационно-оптического анализа в изучении соединительной ткани / М. Керн [и др.] // Архив анатомии. - l985. - Т. 88. - Вып. 6. - С. 5 -12.
3. Сухих, Г.Т. Трансплантация эмбриональных гепатоцитов: экспериментальное обоснование нового подхода к лечению недостаточности печени / Г.Т. Сухих, А.А. Штиль // Бюл. экспер. биологии и медицины. - 2002. - Т. 134. - № 12. - С. 604-609.
4. Шумаков, В.И. Трансплантология / В.И. Шумаков. - М.: Медицина, 1995. - 575 с.
5. Ксенотрансплантация эмбриональных предшественников миогенеза человека для коррекции дистро-финопатии у мышей с наследственной миодистрофией / В.Н. Ярыгин [и др.] // Бюл. экспер. биол. и медицины. - 2003. - Т. 136. - № 7. - С. 100-105.
6. Cai, D.Z. Biodegradable chitosan scaffolds containing microspheres as carriers for controlled transforming growth factor-beta1 delivery for cartilage tissue engineering / D.Z. Cai, C. Zeng, D.P. Quan // Chin Med J (Engl). - 2007. - Vol. 120. - № 3. - P. 197-203.
7. Cozzi, E. An update on xenotransplantation / E. Cozzi, M. Seveso, S. Hutabba //.Vet Res Commun. - 2007.
- Vol. 11. - P. 15-25.
8. Guilak, F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics in articular cartilage repair / F. Guilak, DL Butler, SA Goldstein // Clin Orthop. - 2001. - Vol. 391. - P. 295-305.
УДК 619:616-092.19+636.4:611.018.4
А.В. Сахаров, А.А. Макеев, Е.И. Рябчикова
ОБЩИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ РАЗВИТИЯ ПОЗВОНОЧНИКА ЧЕЛОВЕКА И СВИНЬИ В ОНТОГЕНЕЗЕ
Изучена структурно-функциональная организация хрящевой пластинки роста тела позвонка человека и свиньи в пренатальном и постнатальном периодах онтогенеза. Используя методы морфогистохимического анализа, определены общие закономерности развития пластинки роста тела позвонка человека и свиньи, а также впервые установлены структурно-временные параллели. Полученные результаты позволяют рекомендовать хрящевую ткань тел позвонков плодов человека на сроке 12 недель, а свиньи 6 недель гестации в качестве оптимального источника клеточного материала для тканеинженерных конструкций.
Ключевые слова: пластинка роста, морфогистохимия, разрастание, дифференциация, онтогенез.
A.V. Sakharov
THE GENERAL DEVELOPMENT LAWS OF A HUMAN BEING AND A PIG BACKBONE IN ONTOGENESIS
The structurally- functional organization of the cartilage growth plate of human being and pig in prenatal and postnatal periods of ontogenesis is studied. Using the methods of a morphohisto-chemical analysis the general laws of evolution of a body growth plate of human being and pig vertebra are defined. The structurally-time parallels are established for the first time . The received results allow to recommend cartilage tissue of vertebras bodies of human being foetus at the 12 week period and pig- at the 6 week period of gestation as the optimum source of cellular material for the tissueengineering constructions.
Key words: growth plate, morphohistochemistry, proliferation, differentiation, ontogenes.
В эмбриогенезе позвоночных всех классов осевой скелет закладывается в принципиально одинаковом виде и сходство его строения сохраняется во взрослом состоянии. Анализ литературных данных свидетельствует, что многие морфогенетические закономерности развития осевого скелета у различных видов млекопитающих, включая человека изучены недостаточно [1, 2]. Следует отметить, что актуальность исследования морфогенеза структурных компонентов позвоночника человека и животных во многом продиктована запросами практической медицины.
В условиях дефицита донорского материала и несовершенной законодательной базы в отношении использования в клеточных технологиях тканей человека [4, 6] осуществляется поиск альтернативных источников клеточного материала, в том числе полученного от сельскохозяйственных животных. Использование тканей и органов свиньи при трансплантации обусловлено большим, чем у других видов млекопитающих, сходством анатомии и физиологии их сердечно-сосудистой, мочевыделительной и пищеварительной систем с человеком [3]. Имеются сведения об успешном использовании в клинической практике для трансплантации человеку клапанов сердца свиньи, кожи и р-клеток поджелудочной железы [5]. Считается, что фетальные клетки донора, интегрируясь с клетками и межклеточным веществом реципиента, позволяют создавать устойчивые ростки новой здоровой ткани в поврежденных зонах [7, 8]. В связи со специфичностью биологии хрящевой ткани - главным образом отсутствием сосудов, использование фетальных хондробла-стов свиньи при разработке тканеинженерных конструкций может иметь ближайшую перспективу при замещении дефектов хрящевой ткани у человека. Вместе с тем, разработки технологий трансплантации фетальных клеток должны основываться на современном представлении о структурно-функциональной организации хрящевой ткани человека и свиньи, а также закономерностях ее развития в онтогенезе.
Целью настоящего исследования являлось изучение общих закономерностей морфогенеза хрящевой пластинки роста тела позвонка человека и свиньи в онтогенезе.
Материал и методы исследования
Материалом исследования служили тела позвонков эмбрионов, плодов, а также поросят пород ландрас и крупная белая в период от новорожденности и до 40-суточного возраста. Материал для морфогистохимического анализа получали во время убоя животных на специализированных предприятиях. Образцы зон роста тел позвонков человека получали из абортивного материала на сроке 8-12 недель гестации, а также от погибших людей от рождения и до 12 лет, не имевших признаков патологии опорно-двигательного аппа-
рата в лицензированных учреждений МЗ РФ, действующих в рамках законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан и в соответствии с современными этическими нормами.
Фрагменты тел позвонков грудного отдела человека и свиньи фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и декальцинировали в забуференном растворе Трилона Б. Исследуемые образцы обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле, заливали в целлоидин-парафин. На санном микротоме готовили серийные срезы толщиной 3-5 мкм и монтировали на предметные стекла.
Для изучения общей морфологической картины срезы окрашивали гематоксилином Бёмера и эозином. Коллаген выявляли по Маллори в модификации Б. Ромейса [7]. Гликоген и гликопротеиды определяли в реакции с реактивом Шиффа по Мак-Манусу. Реакцию на суммарные кислые гликозаминогликаны (ГАГ) ставили с альциановым синим по С. Стидмену. Локализацию кератансульфата (КС), хондроитинсульфата (ХС), гиалуроновой кислоты в клетках и межклеточном веществе, а также их пространственно-упорядоченную организацию в межклеточном веществе хрящевой ткани пластинки роста изучали в реакции с толуидиновым синим при рН 1,5; 2,5 и 5,0 [8]. Пространственно-упорядоченную организацию коллагена в межклеточном веществе определяли по Эбнеру и в реакции с пикросириусом красным. Срезы изучали в поляризованном свете и оценивали интенсивность рефракции.
Измерение морфометрических характеристик проводили с помощью комплекса программ АхюМвюп. Статистическую обработку данных проводили по общепринятым методикам с использованием 1-критерия Стьюдента и считали достоверным при Р < 0,05.
Исследования проводились на базе лаборатории морфологии НГПУ, лаборатории микроскопических исследований ГНЦ ВБ «Вектор».
Результаты исследования
Позвоночный столб эмбриона человека на сроке восьми недель, а свиньи на сроке четырех недель гестации представлен мезенхимными телами позвонков, которые имеют полигональную форму. При реакции на суммарные ГАГ последние выявляются в цитоплазме клеток в следовых количествах. Реакция с толуиди-новым синим на гиалуроновую кислоту слабо выражена, а на ХС и КС - отрицательная.
Хрящевая модель тела позвонка у плода человека на 12-й неделе и плода свиньи на 6-й неделе гестации представлена мелкими клетками округлой формы, в цитоплазме которых выявляется невысокое содержание кислых ГАГ. Межклеточное вещество слабо развито и бледно окашивается на коллаген по Маллори. Совокупность указанных признаков характеризует клетки как низкодифференцированные. Для хондроб-ластов низкой степени дифференцировки характерно мелкое, интенсивно базофильное ядро округлой формы, расположенное в центре клетки, и низкое ядерно-цитоплазматическое отношение.
Исследование зон роста тел позвонков человека и свиньи в поляризованном свете позволило выявить следовую рефракцию макромолекул гиалуроновой кислоты, ХС, КС и коллагена только вокруг клеточных лакун. Указанные признаки свидетельствуют, что на сроке 12 недель гестации у человека и 6 недель у свиньи в хрящевой ткани зоны роста тела позвонка впервые регистрируется синтез клетками всех биополимеров, характерных для хряща, и происходит начальный этап формирования их пространственноупорядоченной организации. Это позволяет рассматривать периоды 12 недель гестации у человека и 6 недель у свиньи в качестве оптимальных для получения донорской хрящевой ткани с целью создания тканеинженерных конструкций.
У человека в возрасте одного года, а у плода свиньи на сроке восьми недель гестации ПР роста сформирована и представлена гиалиновым хрящом, в котором отчетливо идентифицируются резервная зона, зона пролиферации, созревания, гипертрофии и зона остеогенеза.
В данный возрастной период в зоне энхондрального остеогенеза сосуды инвазируют лишь матрикс, прилежащий к гипертрофическим клеткам, что является отражением интенсивного роста тела позвонка и проявлением динамичного единства процессов хондрогенеза и адекватного остеогенеза.
Следует отметить, что увеличение линейных размеров тела позвонка в период его формирования не всегда обеспечивается сопряжением хондро- и остеогенеза. У человека в возрасте 3-7 лет, а свиньи на сроке 12 недель гестации в базальной зоне ПР происходит глубокая инвазия кровеносными сосудами матрикса хряща. Кальцификация осуществляется вплоть до клеток зоны созревания, в отличие от предыдущего возрастного периода. Это приводит к исчезновению гипертрофических клеток и интенсивному замещению хряща в зоне созревания и гипертрофии первичной грубоволокнистой костной тканью.
У детей в возрасте 11 лет, а у свиньи в период от 7 и до 20 суток постнатального онтогенеза ПР пре-
терпевает существенные изменения, которые связаны с ее структуризацией. Зона гипертрофического хряща ПР перекрыта пластинчатой костной тканью. В данный возрастной период вновь происходит разобщение хондро- и остеогенеза, а рост тела позвонка обеспечивается за счет преобладания пролиферации хрящевых клеток ПР над остеогенезом в отличие от предыдущего возрастного периода. Важным событием в данный возрастной период является формирование в толще зоны пролиферирующего хряща сосудистых каналов, которые приводят к деструкции хрящевого матрикса ПР. К ЗО суткам у свиньи, и к 12 годам у человека дистрофия хрящевых клеток и матрикса вокруг сосудистых каналов в толще зоны пролиферации ПР приводит к оссификации и остеогенезу.
Развивающийся процесс структуризации приводит к формированию двух структур - ЗП и ПР у человека в 14 лет, а у свиньи в возрасте 40 суток. Полученные сведения об особенностях структурнофункциональной организации ПР тела позвонка человека и свиньи в онтогенезе позволили провести параллели и выделить общие закономерности ее гистогенеза в возрастном аспекте.
Выводы
1. Структурная организация зоны роста тела позвонка человека на 12-й неделе гестации аналогична таковой предплода свиньи на 6-й неделе гестации.
2. Пластинка роста человека в период новорожденности и до одного года имеет схожие морфологические характеристики с пластинкой роста плода свиньи на 8-й неделе гестации.
3. Пластинка роста человека в возрасте З-7 лет, а у плода свиньи от 12 недель гестации и до периода новорожденности имеет схожие морфологические признаки.
4. Пластинка роста тела позвонка человека в возрасте 11 лет сходна с таковой у свиньи в возрасте 7-20 суток.
5. Пластинка роста тела позвонка человека в возрасте 12 лет имеет схожие морфофункциональные признаки с пластинкой роста свиньи в возрасте З0 суток.
6. Пластинка роста тела позвонка человека в возрасте 14 лет сходна с таковой у свиньи в возрасте 40 суток.
7. Хрящевая ткань тел позвонков человека на сроке 12 недель, а свиньи 6 недель гестации является оптимальной для получения донорской хрящевой ткани при разработке тканеинженерных конструкций.
Литература
1. Михайловский, М.В. Хирургия деформаций позвоночника I М.В. Михайловский, Н.Г. Фомичев. - Новосибирск: Сиб. гос. изд-во, 2002. - 4З1 с.
2. Орел, А.М. Развитие и изменение позвоночника I А.М. Орел II Бюл. Московского профессионального объединения мануальных терапевтов. - 2003. - №5. - C. 99-101.
3. Понд, У.Дж. Биология свиньи I У.Дж. Понд, К.А. Хаупт. - М.: Колос. - 19B3. - 159 с.
4. Сухих, Г.Т. Трансплантация эмбриональных гепатоцитов: экспериментальное обоснование нового подхода к лечению недостаточности печени I Г.Т. Сухих, А.А. Штиль II Бюл. экспер. биол. и медицины.
- 2002. - Т. 1З4. - № 12. - С. 604-609.
5. Шумаков, В.И. Трансплантология I В.И. Шумаков. - М.: Медицина, 1995. - 575 с.
6. Ярыгин, В.Н. Ксенотрансплантация эмбриональных предшественников миогенеза человека для коррекции дистрофинопатии у мышей с наследственной миодистрофией I В.Н. Ярыгин [и др.] II Бюл. экспер. биол. и медицины. - 2003. - Т. 1З6. - № 7. - С. 100-105.
7. Nakamura, Y. Xenotransplantation of long-term-cultured swine bone marrow-derived mesenchymal stem cells / Y. Nakamura, X. Wang, C. Xu // Stem Cells. - 2007. - Vol. 25. - № З. - P. 612-620.
B. Cozzi, E. An update on xenotransplantation / E. Cozzi, M. Seveso, S. Hutabba // Vet Res Commun. - 2007. -
Vol. 11. - P. 15-25.
'--------♦------------
12B
