CC BY
56
УДК б77. 6:602.606:61. б42.8
УТВОРЕННЯ ПОЛІПЛЕКСІВ НОВИМИ ПОВЕРХНЕВО-АКТИВНИМИ ГРЕБЕНЕПОДІБНИМИ ПОЛІАМФОЛІТАМИ І ПЛАЗМІДНОЮ ДНК
1Інститут біології клітини НАН України, Львів 2Національний університет «Львівська нолітехніка» 3Львівський національний університет імені Івана Франка
E-mail: [email protected]
Отримано 31.08.2012
Досліджено утворення інтерноліелектролітних комнлексів (нолінлексів) нлазмідної ДНК з новими новерхнево-активними гребененодібними ноліамфолітними носіями із застосуванням методу визначення затримки ДНК нід час електрофорезу в гелі агарози. Встановлено онтимальні умови для утворення таких нолінлексів: концентрація ноліамфолітних носіїв 0,1-0,003%, рН 7,4, 20 хв, 24 °С. Показано, що ноліамфоліт із кватернізованими аміновмісними бічними ланцюгами утворює найбільш стабільні нолінлекси з нлазмідною ДНК. Асоціація та вивільнення ДНК із комнлексу з ноліамфолітними носіями не снричинює її структурних змін, натомість ці носії захищають ДНК від розщенлення нуклеазами. Отже, нові новерхнево-активні гребененодібні ноліамфоліти є нерснективними носіями для доставлення ДНК у рецинієнтні клітини.
Ключові слова: нлазмідна ДНК, ноліамфолітні носії, стабільність нолінлексів, електрофорез ДНК.
Н. C. Фінюк1, 3
Т. Я. Вітак3 Н. Є. Мітіна2 Є. З. Філяк1 О. С. Заіченко2 Р. С. Стойка1, 3
До систем доставлення нуклеїнових кислот, використовуваних у генній терапії, існує низка вимог, зокрема вони мають проникати через плазматичну мембрану реци-пієнтних клітин, зберігати свої структурно-функціональні властивості всередині клітини після ендоцитозу, а також потрапляти в ядро, де нуклеїнова кислота повинна інтегруватись у хроматин і транскрибуватися в інформаційну РНК [1]. Описано кілька таких систем, зокрема поліетиленімін [2-4], полі^-лізин [5, 6], дендримери [7], хітозан [8], ліпосоми [9], металовмісні наноматеріа-ли [10]. Встановлено, що нанорозмірні полімерні носії мають суттєві переваги під час здійснення генетичної трансформації, а саме: підвищення ефективності доставлен-ня нуклеїнової кислоти в реципієнтні клітини, захист її від розщеплення позаклітинними і внутрішньоклітинними нуклеазами, а також можливість здійснення адресного доставлення генетичного матеріалу до клітин. Особливо перспективними у цьому сенсі для потреб сучасної біотехнології та фармакології є поліелектролітні носії, здатні утворювати нанорозмірні поліплекси, стабільні у водних розчинах [5].
Метою роботи було дослідити утворення комплексів новими поліамфолітними гребенеподібними носіями з плазмідною ДНК і вивчити деякі властивості утворених нано-розмірних поліплексів як зручних векторів для доставлення генів у реципієнтні клітини.
Матеріали і методи
У роботі використано нові поверхнево-активні поліамфолітні носії (ПН) гребенеподібної будови, синтезовані на кафедрі органічної хімії Національного університету «Львівська політехніка» за описаною методикою [11]. Ці ПН складаються з аніонного карбоксилвмісного основного ланцюга з молекулярною масою 2000 г/моль та прищеплених до нього 1-3 аміновмісних бічних ланцюгів (рис. 1).
Основний ланцюг — олігопероксидний металокомплекс (ОМК), до якого прищеплені ланцюги кополімеру диметиламіноетил-метакрилату (ДМАЕМ) та 5-(трет-бутилпе-рокси)-5-метил-1-гексен-3-іну (ВЕП). Характеристику синтезованих кополімерів наведено в таблиці.
омк
Чл/чЛсНі-СНІ ІСН,-
:нгсн+ існ2-сн|
''' ^ ‘ Мг*' №Г^1в5'
он он
ос
І Н,С-Ч^-СН, СН,
0=С І
І н,с-с-сн, СН, он
і Vе1" і і он он
Рис. 1. Схематичне зображення структури гребенеподібного поліамфолітного носія
Характеристика синтезованих поліамфолітних носіїв (процентне співвідношення основного та прищеплених ланцюгів 5:95)
Основний ланцюг
# Вміст мономер-них ланок в ПН, % Характеристика мікроструктури* [Си2+], % на основний ланцюг Вміст мономер-них ланок в ПН, % Характеристика мікроструктури Мп, г/моль с, мН/ м (1% р-н)
ВА k ВЕП і МА т іва івеп 1МА R ВЕП Ь ДМАЕМ а івеп ідмаем R
БГ-2 22,0 34,0 44,0 1,0 1,0 1,0 99,5 1,1 7,5 92,5 1,02 14,8 7,5 3100 43,0
БГ- 2кв** 22,0 34,0 44,0 1,0 1,0 1,0 99,5 1,1 7,5 92,5 1,02 14,8 7,5 3100 52,3
БГ-3 22,0 34,0 44,0 1,0 1,0 1,0 99,5 1,1 15,6 84,4 1,07 4,94 14,6 2300 44,3
БГ-4 22,0 34,0 44,0 1,0 1,0 1,0 99,5 1,1 34,0 66,0 1,22 2,30 27,8 2100 37,3
Прищеплені ланцюги
Примітка: # — скорочена назва поліамфолітного носія, * і — середня довжина блоків із ланок комономера; R — кількість блоків з однакових ланок на 100 ланок кополімеру;
** — кополімер із кватернізованими аміногрупами, одержаний у результаті оброблення йодистим метилом (СНЗІ); Мп — середньочисельна молекулярна маса, а — поверхневий натяг.
ПН розчинні у широкому діапазоні рН і здатні утворювати міжмолекулярні комплекси сольового типу між позитивно зарядженими бічними ланцюгами і негативно зарядженою молекулою ДНК. Наявність у структурі поліамфоліту гідрофобних фрагментів не лише забезпечує їхню поверхневу
активність, але й сприяє взаємодії комплексу ПН/ДНК із плазматичною мембраною реципієнтних клітин.
У роботі використовували плазміду pGLG578 завдовжки 6,5 тис. пар нуклеоти-дів [12, 13]. Плазмідну ДНК із трансформованої бактеріальної культури E. coli штаму
DH5 виділяли за класичною методикою [14]. Ізольовану плазмідну ДНК зберігали при температурі -20 °С. Робоча концентрація ДНК становила 1 мкг/мкл.
Утворення комплексів ДНК із ПН досліджували за допомогою електрофорезу в гелі агарози. До розчинів з різною концентрацією ПН додавали 1 мкг плазмідної ДНК в об’ємі 9 мкл трис-НСІ (Medicago АВ, Швеція), 20 мМ, рН 7,4. Отриману суміш інкубували протягом 20 хв за кімнатної температури для утворення комплексу ПН/ДНК [15]. Реакційну суміш переносили в лунки 1%-го гелю агарози ^АСНЕМА, Чехія) і піддавали електрофорезу в буфері ТАЕ (40 мМ трис-НСІ, 40 мМ оцтова кислота, 1 мМ ЕДТА, рН 8,5; Medicago АВ) протягом 40-50 хв при 75 В. ДНК в гелі детектували, застосовуючи трансілюмінатор (МасгоУие иУ-20, Ное££ег) і фотографували цифровою камерою фірми Сапоп.
ДНК-протекторні властивості полі-амфолітних носіїв
Комплекси ПН/ДНК готували у 20 мМ трис-НСІ, рН 7,4, із використанням 1 мкг плазмідної ДНК та 1 мкл ПН відповідної концентрації. Аліквоти інкубували за кімнатної температури упродовж 20 хв і піддавали дії ДНКази І ^егше^ав, Німеччина) у буфері (10 мМ трис-НСІ, рН 7,6, і 10 мМ МяСІ2) протягом 30 хв при 37 °С. ДНК (1 мкг) інкубували з ДНКазою І у різних концентраціях: 0,05 и/мкг ДНК, 0,1 и/мкг ДНК і 0,5 и/мкг ДНК. Щоб зупинити дію ДНКази, додавали
5 мкл 0,5 М ЕДТА ^егшепЬав, Німеччина), рН 8,0 [16]. Одержані суміші піддавали електрофорезу при 75 В протягом 40-50 хв. ДНК в гелі детектували, як зазначено вище.
Вивільнення ДНК з комплексу ПН/ДНК. До комплексу ПН/ДНК, приготованому, як описано вище, додавали гепарин (5000 МО/мл) (РУП «Бєл мед препарати», Республіка Білорусь) до кінцевої концентрації 0,1%, 1%, 2%, 5%, 10% [17, 18]. Одержану суміш інкубували протягом 3 год при 37 °С. Конформаційний стан ДНК (релаксована чи суперспіралізована) досліджували за допомогою електрофорезу в 1%-му гелі агарози, як описано вище.
Результати та обговорення
Щоб підтвердити утворення комплексу ПН/ДНК і його дисоціацію, визначити співвідношення компонентів (ПН і ДНК) у цьому комплексі, а також перевірити протекторні властивості (захист від нуклеаз) ПН щодо плазмідної ДНК, нами було проведено електрофоретичне дослідження в гелі агаро-
зи. При цьому затримка електрофоретичної рухливості плазмідної ДНК може свідчити про утворення комплексу її з ПН і зменшення сумарного негативного заряду, тоді як поява дифузної плями на електрофореграмі вказує на фрагментацію плазмідної ДНК.
ДНК-зв’язувальні властивості поліамфолітних носіїв
Результати, наведені на рис. 2, демонструють наявність на електрофореграмі двох типів смуг ДНК, причому одна із цих смуг майже не мігрує під час електрофорезу, що свідчить про утворення міжмолекулярного комплексу ПН із плазмідною ДНК. Очевидно, саме зменшення негативного заряду ДНК в результаті утворення поліплексу призводить до затримки її міграції в електричному полі. Водночас дві смуги другого типу належать вільній плазмідній ДНК (релаксована і суперспіралізована форми), що не увійшла до комплексу з ПН і тому добре мігрує під час електрофорезу. Слід зазначити, що кватернізований ПН (БГ-2q), якому притаманний більш позитивний заряд, утворює комплекс із плазмідною ДНК у нижчій концентрації (0,003%), ніж некватернізований ПН (БГ-2), що забезпечує таке комплексоутворення за втричі вищої концентрації (0,01%). Утім, деяка кількість комплексованої ДНК виявляється й за нижчої концентрації ПН (0,003% і 0,001% у разі використання БГ-2 і 0,001% — БГ-2 q).
Висновок, зроблений щодо залежності ефективності комплексоутворення між ПН і плазмідною ДНК від рівня позитивного заряду ПН, узгоджується з результатами, поданими на рис. 3. У цьому досліді для комплексоутворення використовували два інші синтезовані ПН — БГ-3 і БГ-4. За одна-
1 2 3 4 5 6
1 2 3 4 5 6
Релаксована ДНК Суперспіралі-зована ДНК
Б
Рис. 2. Електрофореграма зразків ДНК плазміди pGLG578 та її комплексів із поліамфолітними носіями БГ-2 (А) і БГ-2q (Б):
до 1 мкг плазмідної ДНК додавали 1 мкл полімеру відповідної концентрації в об’ємі 9 мкл трис-НСІ, 20 мМ, рН 7,4. Доріжка 1 — 0,1% полімеру, 2 — 0,03%, 3 — 0,01%, 4 — 0,003%, 5 — 0,001%,
6 — вільна плазмідна ДНК; комплекс поліамфолітний носій/ДНК; ДНК, що не зв’язалася з полімером
1 2 3 4 5
В
■
І
Релаксована ДНК Суперспіралі-зована ДНК
А Б
Рис. 3. Електрофореграма зразків ДНК плазміди pGLG578 за присутності поліамфолітних носіїв БГ-3 (А) і БГ-4 (Б):
до 1 мкг плазмідної ДНК додавали 1 мкл полімеру відповідної концентрації в об’ємі 9 мкл трис-НСІ, 20 мМ, рН 7,4. Доріжка 1 — 0,1% полімеру, 2 — 0,03%, 3 — 0,01%, 4 — 0,003%, 5 — вільна плазмідна ДНК; ДНК, що не зв’язалася з носієм
кової довжини основного ланцюга ОМК у них скорочено довжину бічних аміновміс-них ланцюгів (із 14,8 ланок у БГ-2 до 4,94 у БГ-3 і 2,30 ланок у БГ-4), що містять ланки ДМАЕМ із позитивним зарядом, а також зменшено вміст цих ланок у бічних ланцюгах (із 92,5% у БГ-2 до 84,4% у БГ-3 і 66,0% у БГ-4) (таблиця). Тому є підстави вважати, що позитивний заряд БГ-3 і БГ-4 є недостатнім для утворення стійких комплексів із ДНК порівняно з таким зарядом БГ-2.
Як видно із цього рисунка, за використаних концентрацій (0,003%, 0,01%, 0,03% і 0,1%) ПН БГ-3 і БГ-4 не утворюють комплексів із плазмідною ДНК, оскільки відсутня затримка міграції цієї ДНК під час електрофорезу.
Отже, серед чотирьох досліджуваних поліамфолітних аміновмісних носіїв — БГ-
2, БГ-2q, БГ-3 і БГ-4 — лише два перші ПН здатні добре зв’язувати плазмідну ДНК, причому БГ-2q із потенційно вищим значенням позитивного заряду молекули перевершує за своєю ДНК-зв’язувальною здатністю БГ-2, який має дещо менший позитивний заряд.
Вивільнення ДНК з комплексу з полі-амфолітним носієм
Наступним кроком нашого дослідження була перевірка цілісності ДНК після її вивільнення з комплексу ПН/ДНК. Для цього використали здатність гепарину спричинювати дисоціацію плазмідної ДНК з її комплексів із ПН [2]. Як видно з рис. 4 (доріж ки 3 і 4), плазмідна ДНК, вивільнена з комплексу ПН/ДНК під впливом гепарину в кінцевій концентрації 1% і 2%, перебуває у двох формах — релаксованій і суперспіра-лізованій. Нижча концентрація гепарину
1 2 3 4 5 6 4 ; Релаксована , ДНК " Суперспіралі-зована ДНК 1 2 3 4 5 6
Ч-> МІ 1 І 1
А Б
Рис. 4. Електрофореграма ДНК плазміди pGLG578, вивільненої з комплексу з БГ-2 (А) і БГ^ (Б):
до 1 мкг плазмідної ДНК додавали 1 мкл 0,1%-го розчину відповідного ПН в об’ємі 9 мкл трис-НСІ, 20 мМ, рН 7,4. До утвореного комплексу ДНК із ПН додавали гепарин у різній кінцевій концентрації: доріжка 1 — 0%, 2 — 0,5%, 3 — 1%, 4 — 2%, 5 — 5%, 6 — вільна плазмідна ДНК; комплекс ПН/ДНК;
плазмідна ДНК, вивільнена з комплексу
ПН/ДНК;
розщеплена ДНК
(0,5 %) не забезпечує вивільнення ДНК з такого комплексу (доріжка 2). Підвищення його концентрації до 5% призводить до порушення цілісності ДНК (доріжка 5), що узгоджується з даними інших дослідників [16, 17]. Тому саме 1%-ну концентрацію гепарину було вибрано для подальшого дослідження вивільнення ДНК із комплексів із ПН.
Наведені результати дають підстави стверджувати, що поліамфолітні носії БГ-2 і БГ-2q не лише найкраще зв’язують плазмід-ну ДНК, але й ефективно захищають її від деградації у разі вивільнення з комплексу ПН/ДНК, не впливаючи на структуру цієї ДНК.
ДНК-протекторні властивості полі-амфолітного носія БГ-2
Конформація ДНК є визначальною у забезпеченні її стійкості до розщеплення нук-леазами [10]. Відомо, що дезоксирибонуклеаза І (ДНКаза І) відіграє основну роль у розщепленні ДНК [1, 19]. Здатність полі-амфолітних носіїв захищати ДНК від дії нуклеаз має першорядне значення у підвищенні ефективності експресії доставлених генів [16]. Ми дослідили, чи захищає полі-амфолітний носій БГ-2 плазмідну ДНК від її розщеплення ДНКазою I. Для цього утворені комплекси ПН/ДНК обробляли цією нук-леазою у різній концентрації. Як випливає з рис. 5, вільна плазмідна ДНК суттєво ушкоджується ДНКазою I вже в концентрації
0,05 и/мкг ДНК, а подальше підвищення концентрації ДНКази I до 0,1 і 0,5 и/мкг
Рис. 5. Електрофореграма ДНК плазміди pGLG578, розщепленої ДНКазою І:
доріжка 1 — нативна ДНК;
2 — ДНК після оброблення ДНКазою І
у концентрації 0,05 и/мкг ДНК;
3 — ДНК після оброблення ДНКазою І
у концентрації 0,1 и/мкг ДНК;
4 — ДНК після оброблення ДНКазою І
у концентрації 0,5 и/мкг ДНК;
{ доріжки із розщепленою ДНК
Б
ДНК призводить до ще суттєвішої деградації плазмідної ДНК.
Враховуючи наведені вище дані про захист поліамфолітним носієм БГ-2 плазмідної ДНК від руйнування, що відбувається за присутності гепарину (рис. 4), ми дослідили протекторні властивості БГ-2 щодо плазмідної ДНК, на яку діяли ДНКазою І. Як видно
з рис. 6 (доріжки 2 і 3) плазмідна ДНК, що перебуває у комплексі з ПН, нечутлива до цього ензиму в концентрації 0,05
і 0,1 U/1 мкг ДНК. При цьому зберігаються без помітних змін як релаксована, так і су-перспіралізована форми плазмідної ДНК. Лише за дії ДНКази І у високій концентрації (0,5 U/1 мкг ДНК) виявлено часткове руйнування плазмідної ДНК (рис. 6, доріжка 4).
Отже, результати наших досліджень свідчать про те, що поліамфолітні носії типу БГ-2 захищають плазмідну ДНК від руйнування ДНКазою І, що є важливим під час доставлення генів у реципієнтні клітини in vitro та in vivo.
Механізми захисної дії поліамфолітних носіїв від нуклеазного (ДНКаза І) розщеплення асоційованої з ними плазмідної ДНК до кінця не з’ясовано. Вважають, що аміногрупи відштовхують катіони Mg2+, необхідні для активності цього ензиму, або можуть просторово перешкоджати його доступу до ДНК, іммобілізованої в комплексі [20]. Тому поліамфолітні носії ДНК можна розглядати як своєрідні інгібітори активності ДНКази I [21].
Рис. 6. Електрофоретична оцінка ДНК-протекторної здатності поліамфолітних носіїв БГ-2 (А) і БГ^ (Б):
до 1 мкг плазмідної ДНК pGLG578 додавали
1 мкл 0,1%-го розчину ПН в об’ємі 9 мкл трис-НСІ, 20 мМ. Утворений комплекс піддавали
впливу ДНКази І у різних концентраціях: доріжка 1 — нативна ДНК;
2 — комплекс ПН/ДНК, оброблений ДНКазою І
в концентрації 0,05 и/мкг ДНК;
3 — комплекс ПН/ДНК, оброблений ДНКазою І
в концентрації 0,1 и/мкг ДНК;
4 — комплекс ПН/ДНК, оброблений ДНКазою І
в концентрації 0,5 и/мкг ДНК; плазмідна ДНК, вивільнена з комплексу ПН/ДНК;
розщеплена плазмідна ДНК
Таким чином, продемонстровано ефективну іммобілізацію плазмідної ДНК новими поліамфолітними аміновмісними носіями типу БГ-2. Як асоціація, так і вивільнення ДНК з комплексу із цими носіями не спричинює структурних змін ДНК. Виявлено здатність носіїв БГ-2 захищати плазмідну ДНК від розщеплення ДНКазою I. Охарактеризовані носії є перспективними для доставлення генів ДНК у реципієнтні клітини.
Роботу виконано за фінансової підтримки гранту, наданого Є. З. Філяку і Н. С. Фінюк Західно-Українським біомедичним дослідницьким центром (2011-2012 рр.), а також проекту за договором № 46 цільової комп -лексної програми фундаментальних досліджень НАН України «Фундаментальні основи молекулярних та клітинних біотехнологій». Автори вдячні к. б. н. Стасику О. В. за надану плазміду pGLG578.
І
2
З
4
ЛІТЕРАТУРА
1. Barry M. E., Pinto-Gonzalez D., Orson F. M., McKenzie G. J. Role of endogenous endonucleases and tissue site in transfection and CpG-mediated immune activation after naked DNA injection // Hum. Gene Ther. 1999. — V. 10. — P. 2461-2480.
2. Lungwitz U.,BreunigM, Blunk T., GopferichA. Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems // Europ. J. Pharmac. Biopharmac. — 2005. — V. 60, N 2. — P. 247-266.
3. Rudolph C., Ortiz A., Schillinger U. et al. Methodological optimization of polyethylen-imine (PEI)-based gene delivery to the lungs of mice via aerosol application // J. Gene Med. — 2005. — V. 7, N 1. — P. 59-66.
4. Wang Y., Chen P., Shen J. The development and characterization of a glutathione-sensitive cross-linked polyethylenimine gene vector // Biomaterials. — 2006. — V. 27, N 30. — P. 5292-5298.
5. Liu G., Swierczewskaa M., Leea S., Chen X. Functional nanoparticles for molecular imaging guided gene delivery // Nano Today. — 2010. — V. 5. — P. 524-539.
6. Sun X., Zhang N. Cationic polymer optimization for efficient gene delivery // Mini Rev. Med. Chem. — 2010. — V. 10, N 2. — P. 108-125.
7. Marvaniya H. M., Parikh P. K., Patel V. R. et al. Dendrimer nanocarriers as versatile vectors in gene delivery //J. Chem. Pharm. Res. — 2010. — V. 2, N 3. — P. 97-108.
8. Strand S. P., Lelu S., Reitan N. K. et al. Molecular design of chitosan gene delivery systems with an optimized balance between polyplex stability and polyplex unpacking // Biomaterials. — 2010. — V. 31, N 5. — P. 975-987.
9. Tros de Larduya C., Sun Y., Duzguns N. Gene delivery by lipoplexes and polyplexes // Eur. J. Pharm. Sci. — 2010. — V. 40, N 3. — P.159-170.
10. Hu J., Kovtun A., Tomaszewski A. et al. A new tool for the transfection of corneal endothelial cells: Calcium phosphate nanoparticles // Acta Biomaterialia. — 2012. — V. 8. — P. 1156-1163.
11. Zaichenko A. S., Voronov S. A., Shevchuk O. M. et al. Kinetic features and molecular weight characteristics of terpolymeriza-tion products of the systems based on vinyl acetate and 5-tert-butyl-peroxy-5-methyl -1-
hexene-3-yne // J. Appl. Polymer Science. — 1997. — V. 67. — P. 1061-1066.
12. Sohn J. H., Choi E. S., Kang H. A. et al. A dominant selection system designed for copy-number-controlled gene integration in Hansenula polymorpha DL-1 // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 1999. — V. 51. — P.800-807.
13. Stasyk O. G., Maidan M. M., Stasyk O. V. et al. Identi cation of hexose transporter-like sensor HXS1 and functional hexose transporter HXT1 in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha // Eucar. Cell. — 2008. — V. 7, N 4. — P. 735-746.
14. Lee S. Y., Rasheed S. A simple procedure for maximum yield of high-quality plasmid DNA // Biotechniques. — 1990. — V. 9, N 6. — P.676-679.
15. Zou W., Liu C., Chen Z., Zhang N. Preparation and characterization of cationic PLA-PEG nanoparticles for delivery of plasmid DNA // Nanoscale Res. Lett. — 2009. — V. 4, N 9. — P. 982-992.
16. Fu C., Sun X., Liu D. et al. Biodegradable triblock copolymer poly(lactic acid)-poly(ethyl-ene glycol)-poly(L-lysine)(PLA-PEG-PLL) as a non-viral vector to enhance gene transfection // Int. J. Mol. Sci. — 2011. — V. 12, N 2. — P. 1371-1388.
17. Oster C. G., Wittmar M., Bakowsky U., Kissel T. DNA nano-carriers from biodegradable cationic branched polyesters are formed by a modified solvent displacement method // J. Contr. Release. — 2006. — V. 111. — P. 371-381.
18. Park M. R., Han K. O., Han I. K. et al. Degradable polyethylenimine-alt-poly(ethyl-ene glycol) copolymers as novel gene carriers // Ibid. — 2005. — V. 105. — P. 367-380.
19. Pollard H., Toumaniantz G., Amos J. L. et al. Ca2+-sensitive cytosolic nucleases prevent efficient delivery to the nucleus of injected plasmids // J. Gene Med. — 2001. — V. 3. — P. 153-164.
20. He X. X., Wang K., Tan W. et al. Bio -conjugated nanoparticles for DNA protection from cleavage // J. Am. Chem. Soc. — 2003. — V. 125, N 24. — P. 7168-7169.
21. Roy I., Ohulchanskyy T. Y., Bharali D. J. et al. Optical tracking of organically modified silica nanoparticles as DNA carriers: a nonviral, nanomedicine approach for gene delivery // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2005. — V. 102, N 2. — P. 279-284.
ОБРАЗОВАНИЕ ПОЛИПЛЕКСОВ НОВЫМИ ПОВЕРХНОСТНОАКТИВНЫМИ ГРЕБНЕПОДОБНЫМИ ПОЛИАМФОЛИТАМИ И ПЛАЗМИДНОЙ ДНК
Н. C. Финюк1 3 Т. Я. Витак3 Н. Е. Митина2 Е. З. Пиляк1 О. С. Заиченко2 Р. С. Стойка1, 3
1 Институт биологии клетки НАН Украины, Львов
2Национальный университет «Львовская политехника»
3Львовский национальный университет имени Ивана Франко
Е -mail: [email protected]
Изучено образование интерполиэлектро-литных комплексов (полиплексов) плазмид-ной ДНК с новыми поверхностно-активными гребнеподобными полиамфолитными носителями с использованием метода определения задержки движения ДНК во время электрофореза в геле агарозы. Установлены оптимальные условия для образования полиплексов, а именно: концентрация полиамфолитных носителей 0,01-0,003%, рН 7,4, 20 мин и 24 °С. Показано, что полиамфолит с кватер-низованными боковыми аминосодержащими цепями образует наиболее стабильные поли-плексы с плазмидной ДНК. Ассоциация и высвобождение ДНК из комплекса с поли-амфолитными носителями не вызывает ее структурных изменений, более того, эти носители защищают ДНК от расщепления нуклеа-зами. Следовательно, новые поверхностноактивные гребнеподобные полиамфолиты могут быть перспективными носителями для доставки ДНК в реципиентные клетки.
Ключевые слова: плазмидная ДНК, полиам-фолитные носители, стабильность полиплек-сов, электрофорез ДНК.
POLYPLEX FORMATION BY NOVEL SURFACE ACTIVE COMB-LIKE POLYAMFOLYTES AND PLASMID DNA
N. S. Finiuk1, 3 T. Y. Vitak3 N. Y. Mitina2 Y. Z. Filyak3 O. S. Zaichenko2 R. S. Stoika1, 3
1Institute of Cell Biology of National Academy of Sciences of Ukraine, Lviv
2Lviv National Polytechnic University
3Ivan Franko National University of Lviv
E -mail: [email protected]
Formation of the interpolyelectrolytic complexes (polyplexes) of plasmid DNA and novel surface active comb-like polyampholytic carriers was studied. To do that, the method of determining DNA retardation during its electrophoresis in the agarose gel was used. Optimal conditions for the formation of such polylexes were defined: PC concentration 0.1-0.003 %, pH 7.4, 20 min, 24 °C. It was found that polyampholyte possessing quaternized amino-containing side chains is capable to form the most stable polyplexes with plasmid DNA. The association of DNA with polyampholytic carriers and its release from such complex do not cause changes in DNA structure. Therefor, the polyampholytic carriers under study protected DNA from its nuclease cleavage. Thus, novel surface active comb-like polyampholytes are perspective carriers for delivering DNA to the recipient cells.
Key words: plasmid DNA, polyampholytic carriers, stability of polyplexes, DNA electrophoresis.
