CC BY
19
УДК 615.244.2.099:543.422.3
ОБНАРУЖЕНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕТАПРОТА В ПЕЧЕНИ И ПОЧКАХ
Вергейчик Т.Х., Линникова В.А., Гуськова Г.Б., Саркисян М.С.
Пятигорский медико-фармацевтический институт, г. Пятигорск, Российская Федерация.
Аннотация. Показана возможность использования метода А.А. Васильевой для извлечения метапрота из биологических объектов - печени, почек. Для обнаружения метапрота предложены ТСХ в скрининговой (общей) и в 2-х частных системах растворителей, а также методы УФ-спектрофотометрии и ВЭЖХ, для количественного определения - УФ-спектрофотометрия и ВЭЖХ. Установлено, что в разработанных условиях из биологических объектов можно выделить 61-69% метапрота с относительной ошибкой не более 8,1%.
Ключевые слова: метапрот, печень, почки, экстракция, тонкослойная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография, УФ-спектрофотометрия.
Лекарственный препарат метапрот находит применение как адаптогенное средство. Его используют с целью повышения работоспособности организма, особенно в экстремальных условиях, в спорте, при отравлении некоторыми токсическими веществами [1,2].
Метапрот назначают в дозе 0,5-0,75-1 г в сутки. В процессе лечения пациенты отмечают появление неприятных ощущений в области внутренних органов (желудка, печени) иногда они сопровождаются рвотой, головной болью и аллергическими реакциями (ринит, гиперемия лица). При передозировке - повышенная возбудимость, нарушение сна [3].
Попадая в организм через желудочно-кишечный тракт, метапрот подвергается метаболизму и выводится через почки в неизменном виде в течение 4-х суток [4] и в виде метаболитов - глюкуронидов этилсуль-финилбензоимидазола и 2 - этилсульфонилбензоили-мидазола [5].
Цель настоящей работы - разработать методики обнаружения и определения метапрота в биологических объектах печени и почках для судебно - химического анализа.
Нами были приготовлены модельные смеси: к 50 г измельченных печени или почек (n=6) добавляли по 5 мг метапрота и оставляли на сутки в темном месте. Одновременно готовили контрольные опыты, в которые метапрот не добавляли (n=3). Через сутки во всех опытах создавали рН=2 с помощью щавелевой кислоты, добавляли по 100 мл воды очищенной, настаивали 2 раза по 2 часа и 1 часу (по методу Васильевой А.А.) [6]. Извлечения объединяли, центрифугировали и метапрот экстрагировали органическим растворителем.
Предварительно нами были изучены условия экстракции метапрота из водных растворов при разных
значениях рН и установлено, что метапрот при значениях рН=6,86 - 9,18 экстрагируется хлороформом в количестве 98,61%, а смесью хлороформа с ацетоном (9:1) при значениях рН=4,01 - 12,75 до 99,79 - 100% [7]. Однако использование в качестве экстрагента смеси хлороформа с ацетоном приводило к получению очень стойкой эмульсии при анализе биологических объектов и переходу в извлечение большого количества эндогенных соединений, что значительно усложняло анализ. Кроме этого хлороформ обычно используется в методах изолирования лекарственных ве-ществпри ненаправленном анализе. Полученные после настаивания извлечения при рН=2 экстрагировали 3 раза по 25 мл хлороформом. Экстракты также объединяли.
Анализ экстракта, полученногопри рН=2. Хлороформный экстракт пропускали через слой натрия сульфата безводногои испаряли в фарфоровых чашках до сухих остатков в темном месте, затем растворяли в 1мл спирта этилового. 0,1 мкл полученного раствора использовали для обнаружения метапрота с помощью ТСХ. Оставшийся раствор переносили в мерную колбу объемом 100 мл с помощью воды очищенной. Общий объем доводили до метки.
Анализ экстракта, полученного при рН=9. С полученным экстрактом поступали также, как в случае экстракта при рН=2, но конечный объем раствора остатка доводили водой очищенной до 200 мл в мерной колбе. Полученные растворы после экстракции при рН=2 и рН=9 анализировали с помощью предложенных ранее методов: ТСХ, УФ-спектрофотометрии и ВЭЖХ [7,8].
Обнаружение метапрота с помощью ТСХ проводили в разработанных ранее условиях. Для этих целей использовали скрининговую систему растворителей
хлороформ - ацетон (9:1) [6] и предложенные нами ранее две частные системы растворителей толуол - ацетон (90:10) и бензол - ацетон (90:5) [9].Камеры насыщали парами растворителей в течение 30 минут. Использовали хроматографические пластины «Сорбфил - 254». После прохождения системы растворителей по пластинке на расстояние 10 см от линии старта, хрома-тограммы вынимали, высушивали без доступа света и просматривали в УФ-лучах. Отмечали местоположение пятен. Затем обрабатывали пластины реактивом Драгендорфа, приготовленным по Мунье. Наблюдали
образование оранжевых пятен с Rf 0,64±0,04 в скри-нинговой системе растворителей и Rf 0,50±0,05, в частных системах в обоих извлечениях (при рН=2 и 9).
Обнаружение метапрота с помощью УФ-спектро-фотометрии. В полученных растворах остатков снимали УФ - спектры поглощения, используя приборы СФ-56 и СФ-20000. На спектрах поглощения извлечений из контрольных опытов максимумов не обнаружено, они представляли собой ниспадающую кривую. В основных опытах обнаружены обоими приборами в извлечениях из печени и почек максимумы при 283 -290 нм, что соответствует спектру поглощения стандартного раствора метапрота (рис. 1).
ПИКОВ НЕ ОБНАРУЖЕНО
Рис. 1. Спектры поглощения контрольных опытов и метапрота, выделенного из модельных смесей с печенью (прибор СФ-2000). а -метапрот-стандарт (0,01мг/мл);
б- метапрот, выделенный из модельной смеси при рН=9; в - контрольный опыт: экстракт при рН= 9.
Обнаружение метапрота с помощью ВЭЖХ. Для этих целей использовали хроматограф « Милихром А-02» производства ЗАО «Эконова», хроматографиче-
скую колонку размером 2*75 мм, заполненную обращено - фазовым сорбентом ProntoSil 120-5С-18АQ. Подвижная фаза: элюентА - 0,1% раствор кислоты три-
в
фторуксусной; элюентБ - ацетонитрил. Скорость подачи подвижной фазы - 100 мкл/мин. Аналитические длины волн 270, 280, 290 нм; температура термостата колонки - 250; время измерения - 0,18 сек; градиентный режим от 10% элюента до 60% за 10 минут; общее время хроматографирования 10 минут; объем вводимой пробы 10 мкл. Обнаружение метапрота прово-
дили, используя раствор стандартного образца. Параметром идентификации было время удерживание и спектральные отношения площадей пиков при различных длинах волн. Во всех случаях на хроматограммах четко обнаруживали пики со временем удерживания 6,27 - 6,62 минуты (рис.2), соответствующие мета-проту - стандарту.
а б
Рис.2.Обнаружение метапрота методом ВЭЖХ визвлечениях из печени (а) и почек (б).
Для количественного определения метапрота, выделенного из модельных смесей использовали метод УФ-спектрофотометрии и метод ВЭЖХ.Расчет выделенного из печени и почек метапрота, при использовании
УФ - спектрофотометрии, проводили по формуле:
_ А исп.хС ст.100
С%=---, где
Астха
С%- концентрация метапрота, выделенного из печени или почек, %;
А исп. -поглощение исследуемого раствора;
С ст. - концентрация метапрота в стандартном растворе 0,01мг/мл или 0,0125 мг/мл;
А ст. - оптическая плотность стандартного раствора метапрота;
а - количество метапрота внесенное в 50 г печени или почек, г.
Фоновое поглощение извлечений из контрольных опытов, не содержащих метапрота, не превышало 0,1 -0,18 в извлечениях из печени и 0,099 - 0,11 в извлечениях из почек.
Содержание препарата методом ВЭЖХ рассчитывали по площади пика раствора стандартного образца метапрота. Линейная зависимость наблюдалась в пределах концентраций метапрота 0,003-15 мкг/мкл при коэффициенте корреляции 0,999.
Расчеты проводили по формуле:
_ Б исп.хС ст.хЮО
Сх =--—--, где
ь ст.х а
С х - концентрацияметапрота, выделенного из печени или почек, %;
S исп. - площадь пика метапрота на хромато-грамме анализируемого раствора;
С ст. - концентрация стандартного раствора мета-прота, мг/мл;
S ст. - площадь пика метапрота на хроматограмме стандартного раствора;
а - количество метапрота, внесенного в 50 г печени или почек в г.
Полученные результаты представлены в таблицах1 и 2.
Таблица 1.
Результаты количественного определения метапрота в печени.
Экстракт при рН=2 Экстракт при рН=9
Найдено метапрота, % Метрологические Найдено мета- Метрологические
характеристики прота, % характеристики
Метод УФ-спектрофотометрии
1,30 57,54
1,54 X = 1,35% 61,86 X =62,69%
1,46 63,59
1,21 Sx = 0,051 ДХ= 0,132 8отн= ±9,8% 70,80 Sx= 1,97 ДХ= 5,07 8отн= ±8,08%
1,26 64,17
1,32 58,16
Метод ВЭЖХ
1,49 X = 1,33% Sx= 0,0469 ДХ= 0,12 8отн= ±9,05% 62,33 X =61,07% Sx= 2,43 ДХ= 3,68 6отн= ±6,02%
1,32 54,39
1,20 58,34
1,28 58,37
1,45 71,82
1,25 61,17
Таблица 2.
Результаты количественного определения метапрота в почках
Экстракт при рН=2 Экстракт при рН=9
Найдено метапрота, % Метрологические характеристики Найденометапрота,% Метрологические характеристики
Метод УФ-спектрофотометрии
1,48 X = 1,36% Sx= 0,049 ДХ= 0,13 ботн= ±9,34% 65,19 X = 69,74% Sx= 1,87 ДХ= 4,81 ботн= ±6,89%
1,50 73,53
1,23 70,34
1,34 75,45
1,22 68,11
1,41 63,84
Метод ВЭЖХ
1,35 X = 1,22% Sx= 0,0399 ДХ= 0,103 8отн= ±8,44% 63,37 X = 69,85% Sx= 1.34 ДХ= 3,45 8отн= ±4,93%
1,13 71,81
1,16 71,29
1,19 69,91
1,21 69,20
1,25 73,11
Полученные данные свидетельствуют, что при использовании общего для лекарственных препаратов метода изолирования (А.А. Васильевой) метапрот можно выделить из биологических объектов при рН=9 в пределах 61-69% с относительной ошибкой не более 8,08%, что отвечает требованиям, предъявляемым к методикам судебно-химического анализа.
Выводы: Показана возможность использования для изолирования метапрота из биологических объектов (печени, почек) метода А.А. Васильевой.Для обнаружения метапрота в полученных экстрактах рекомендованы методы ТСХ, УФ-спекктрофотометрии и ВЭЖХ; для количественного определения - методы ВЭЖХ и УФ-спектрофотометрии. Данные методики предложены для целей судебно - химического анализа.
ЛИТЕРАТУРА
1. Воробъева В.В., Зарубина И.В., Шабанов П.Д. Защитные эффекты метапрота и этомерзола в экстремальный моделях отравлений бытовыми ядами // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. 2012. Т.10, № 11. С 3-21.
2. Шабанов П.Д. Нейропротекторметапрот: механизм действия и новые клинические направления использования // Consilimmedicum. - 2010. - №2. - С. 140-144.
3. Энциклопедия лекарств. Регистр лекарственных средств России. Под ред. Г.Л. Вышковского. - М.: ЛИБРО-ФАРМ, 2012. выт. 20. - 1368 с.
6. 4. Бойко С.С., Бобков Ю.Г., Незнамов Г.Г. Фармако-кинетика и клинический эффект бемитила после однократного применения //Фармакология и токсикология. - 1986. -49., №5. - С. 17-20.
5. Курлякова А.Ф., Гейбо Д.С., Быков В.Н., Никифоров А.С. Особенности фармакокинетикибеметила при ингаляционном введении. Экспериментальная и клиническая фармакология 2014. - т 77. №4. - С.25-28.
6. Вергейчик Т.Х. Токсикологическая химия: учебник / Т.Х. Вергейчик; под ред. проф. Е.Н. Вергейчика, - 4-е изд., перераб. и доп. - М.: МЕД пресс - информ, 2013. - 432 с.
7. Вергейчик Т.Х., Линникова В.А., Гуськова Г.Б. Использование
8. УФ-спектрофотометрии для выявления условий экстракции метапрота из водных растворов.// Фармация и фармакология. - 2014. - №5. - С. 11-16.
9. Вергейчик Т.Х., Линникова В.А., Гуськова Г.Б., Саркисян М.С. Идентификация метапрота с использованием
хроматографии в тонком слое сорбента и высокоэффективной жидкостной хроматографии. //Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции. Сборник научных трудов, вып. 69, Пятигорск: РИА-КМВ, 2014. - С. 194-197.
DETECTION AND IDENTIFICATION METAPROT IN THE LIVER AND KIDNEYS
Vergeichik, T.H., Linnikova V.A., Guskova, G.B., Sarkisyan M.S.
Pyatigorsk medical-pharmaceutical Institute, Pyatigorsk, Russian Federation.
Annotation. The possibility of using the method of A. A. Vasilyeva metaprot for extraction of biological objects - of the liver, kidneys. For detection proposed in metaprot TLC screening (common) and 2 private systems, solvents, and methods UV-spectropho-tometry and HPLC for the quantitative determination of UV-spectrophotometry and HPLC. It is established that in developed conditions of biological objects can be identified 61-69% metaprot with relative error not more than 8.1%.
Key words: metaprot, liver, kidneys, extraction, thin layer chromatography, high performance liquid chromatography, UV-spectro-photometry.
REFERENCES
1. Vorobyeva V. V., Zarabina I. V., Shabanov P. D. Protective effects metaplot and ethomersol in extreme models of household poisonings poisons // Reviews on clinical pharmacology and drug therapy. 2012. Vol. 10, No. 11. With 3-21.
2. Shabanov P. D. Neuroprotectantmetaplot: mechanism of action and new clinical directions for use // Consilim]. - 2010. -No. 2. - P. 140-144.
3. Encyclopedia of medicines. Register of medicines of Russia. Ed. by G. L. Vyshkovsky. - M.: LIBROFARM, 2012. vol. 20. - 1368 S.
4. Boiko, S. S., Bobkov, Y. G., Neznamov G. G. Pharmaco-kinetics and clinical effect bemitil after a single use of //Pharma-cology and toxicology. - 1986. - 49., №5. - S. 17-20.
5. Kulakova A. F., Geibo D. S., Bykov V. N., Nikiforov A. S. the Peculiarities of pharmacokinetics has bemitil in inhalation introduction. Experimental and clinical pharmacology 2014. - t 77. No. 4. - P. 25-28.
6. Vergeichik, T. H. Toxicological chemistry: textbook / T. H. Vergeichik; under the editorship of Professor E. N. Vergeichik, 4th ed., Rev. and extra - M.: MED press - inform, 2013.
- 432 p.
7. Vergeichik, T. H., Linnikova V. A., Guskova, G. B. The Use Of
1. UV spectrophotometry to identify extraction conditions metadata from aqueous solutions.// Pharmacy and pharmacology.
- 2014. - No. 5. - P. 11-16.
8. Vergeichik, T. H., Linnikova V. A., Guskova, G. B., Sarkisyan M. S. the Identification metadata using chromatography in a thin layer of sorbent and high performance liquid chromatography. //Development, research and marketing of new pharmaceutical products. Collection of scientific works, vol. 69, Pyatigorsk: RIA-KMV, 2014. - S. 194-197.
