CC BY
22
SUBSTANTIATION OF THE CRITERIA THE SET OF GENOTOXIC AND IMMUNOLOGICAL INDICATORS FOR RAPID ASSESSMENT OF ENVIRONMENTAL CARCINOGENS
CHERNICHENKO I.A., BALENKO N.V., OSTASH O.M.
ОБҐРУНТУВАННЯ КРИТЕРІАЛЬНОЇ ЗНАЧУЩОСТІ КОМПЛЕКСУ ГЕНОТОКСИЧНИХ ТА ІМУНОЛОГІЧНИХ ПОКАЗНИКІВ ДЛЯ ЕКСПРЕС-ОЦІНКИ КАНЦЕРОГЕНІВ НАВКОЛИШНЬОГО СЕРЕДОВИЩА
ервинна профілактика еко- генні безпосередньо для лю-залежних форм злоякісних но- дини, а 267 — канцерогени, що воутворень серед населення, є ймовірно небезпечними для як відомо, передбачає своєча- людини. Між тим контроль і сне виявлення канцерогенних оцінка їх ускладнюється через факторів і розробку заходів з відсутність у вітчизняній базі попередження їхнього шкідли- відповідних гігієнічних стан-
вого впливу на людину. дартів. Донині гігієнічні норма-
За даними Національної ток- тиви затверджено лише для 17 сикологічної програми США, сполук, до того ж тільки для 5 загальна кількість хімічних ре- — з урахуванням канцероген-ЧЕРНИЧЕНКО І.О. човин, з якими людина стика- них критеріїв шкідливості [3]. БАЛЕНКО Н.В. ОСТАШ О.М. ється у побуті, виробничому се- Зазначене свідчить про на-Ду "Інститут гігієни редовищі та довкіллі, переви- гальну необхідність інтенсифі-та медичної екології щує 100 тис., серед яких 5-10% кації цього процесу. У зв'язку з імОМ Марзєєва НАМН складають канцерогени [1, 2]. цим нами пропонується один з
України" Особливу актуальність цієї підходів, що має сприяти вирі-
м. Київ проблеми ілюструє та обстави- шенню питання прискореного на, що з усієї кількості хімічних гігієнічного нормування. З ме-УДК 576.385.5:57.083.3 сполук, які використовуються у тою визначення такого підходу
різних сферах життєдіяльності нами проведено експеримен-людей, досліджено лише тальне дослідження, яке перед-близько 3000. Майже 1000 з бачало вивчення комплексу по-них є канцерогенонебезпечни- єднаних імунологічних реакцій ми, при цьому 166 сполук екс- організму, патоморфологічних і пертами Міжнародного агент- генотоксичних змін в органах ства з вивчення раку на сьогод- експериментальних тварин за ні розцінюються як канцеро- дії канцерогенної та токсичної
ОБОСНОВАНИЕ КРИТЕРИАЛЬНОГО ЗНАЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА ГЕНОТОКСИЧЕСКИХ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ДЛЯ ЭКСПРЕСС-ОЦЕНКИ КАНЦЕРОГЕНОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
Черниченко И.А., Баленко Н.В., Осташ О.М. Цель работы. Проведение комплекса биологических исследований путем изучения и определения спектра иммунологических реакций организма, патоморфологических и генотоксических изменений в органах при воздействии канцерогенного и токсического вещества.
Материалы и методы. Эксперимент проводили на белых беспородных мышах, включавший 2 серии исследований:
1 — накожные аппликации БП в разных дозах (10,5 мкг; 2,1 мкг; 0,21 мкг); 2 — пероральное введение БП и фенола (разовая доза 0,1 мг). Результаты. Установлено параллельность развития и однонаправленность относительно канцерогенеза проявления генотоксических и иммунологических изменений и наличие достоверной корреляционной связи между ними, которая наиболее выражена в первый
месяц эксперимента. Выявлена зависимость этих изменений от дозы и времени действия канцерогена. Полученные результаты стали основанием для рассмотрения генотоксических и иммунологических показателей как возможных ранних прогностических критериев канцерогенности при тестировании и скрининге химических соединений и их доз. Сформулированы основные этапы ускоренного тестирования и гигиенического регламентирования генотоксических канцерогенов, которые включают, в частности, определение дозо-эффектной зависимости ранних генотоксических и иммуносупрессивных изменений (угнетение Т-клеток иммунитета, гуморальной системы); определение минимально эффективных и максимально недействующих доз; расчет ориентировочно безопасных уровней воздействия (ОБУВ), а при наличии данных о канцерогенном потенциале — расчет шкалы показателей канцерогенного риска и определение на его основе ПДК (предельно допустимой концентрации).
© Черниченко І.О., Баленко Н.В., Осташ О.М. СТАТТЯ, 2013.
№ 2 2013 Environment & Health 4
речовин з різними шляхами надходження (нашкірні аплікації та пероральне введення).
Матеріали та методи дослідження. Експеримент складався з двох серій досліджень: 1 — нашкірних аплікацій бенз/а/пірену (БП); 2 — перо-рального введення БП.
Для нашкірних аплікацій було взято 160 мишей, розподілених на 5 груп. БП наносили у вигляді ацетонового розчину в об'ємі 0,1 мл на попередньо вистрижену шкіру міжлопатко-вої ділянки спини. Разові дози БП складали 0,21 мкг, 2,1 мкг
10,4 мкг Дві групи мишей були контрольними. Мишам однієї групи в аналогічному об'ємі наносили аплікації розчинника (ацетону). Друга група тварини являла собою інтактний контроль. Речовини наносили на шкіру 5 разів на тиждень протягом 11 місяців.
Пероральне введення здійснювали 195 мишам, розподіленим на 4 групи, які включали інтактний контроль, контроль розчинника — триетиленглі-коль (ТЕГ) і 2 групи тварин, що отримували БП і фенол ізольовано у разових дозах 0,1 мг. Речовини вводили натщесерце внутрішньошлунково через зонд 1 раз на тиждень в об'ємі
0,2 мл до кінця досліду, який тривав 14 місяців.
Періодично мишей умертвляли шляхом зміщення хребців шийного відділу хребта і відбирали біоматеріал для
ФУНДАМЕНТАЛЬНІ ДОСЛІДЖЕННЯ =
досліджень у різні терміни від початку досліду — 8, 22, 90 день та 6 і 11 місяців при нашкірних аплікаціях, 9, 31, 95 день та 6, 11, 14 місяців при перо-ральному введенні.
Генотоксичність визначали з застосуванням мікроядерного (МЯ) тесту [4, 5], враховуючи дані літератури про його переваги [6]. Метод є цінним та достатньо інформативним короткостроковим тестом (КСТ) для визначення генотоксичності, до того ж порівняно простим, доступним, економічним, що дозволяє за короткий час дослідити значну кількість хімічних речовин. З урахуванням збігу органоспецифічності МЯ-тесту з локалізацією канцерогенного ефекту [7], з одного боку, і переважно місцевого характеру дії БП — з другого, для вивчення генотоксичних та морфологічних змін брали шкіру та передшлунок мишей.
Дослідження імунологічних порушень проводили одночас-
но за допомогою аналізу вмісту лейкоцитів у периферичній крові та їхнього клітинного складу; числа Т- та В-лімфоци-тів, природних клітин-кілерів, а також реакцій дегрануляції базофілів (за Шеллі), гальмування розпластування макрофагів, фагоцитозу, преципітації циркулюючих імунних комплексів розчином поліетиленгліколю.
Патоморфологічні дослідження шкіри і передшлунка проводили з застосуванням патогістологічної техніки виготовлення гістологічних препаратів шляхом заливання органів парафіном після фіксації їх у 10% забуференому розчині нейтрального формаліну. Для фарбування гістологічних препаратів використовували гема-токсилін-еозин.
Оцінку отриманих даних проводили з використанням загальноприйнятих методів статистичної обробки медико-біо-логічних досліджень та ^крите-рію Ст'юдента. Наявність зв'яз-
Таблиця 1
Порівняльна характеристика дії БП і токсичних сполук (ацетону, фенолу) за даними генотоксичних та імунологічних досліджень
Шляхи введення Речовина Разова доза Ефект
Генотоксичний Імуносупресивний
8; 9 день 22; 31 день 90; 95 день 8; 9 день 22; 31 день 90; 95 день
Нашкірні аплікації БП 0,21 мкг - - - - Т-ланка Т-ланка
БП 2,1 мкг + +++ ++ - Т-ланка Т-ланка; В-ланка
БП 10,5 мкг + +++ ++ - Т-ланка Т-ланка; В-ланка
Ацетон 0,2 мл - - - - Т-ланка; В-ланка Нормалізація порушень
Перо- рально БП 0,1 мг + +++ ++ - Т-ланка Т-ланка; В-ланка
Фенол 0,1 мг - - - - Т-ланка; пригн. ф-рів несп. резист. Нормалізація
ТЕГ 0,2 мл - - - - Ф-ри несп. резист. Т-ланка; В-ланка
Примітки: "-" — ефект не спостерігався;
"+" — 1-2 клітини з МЯ на 1000 досліджених клітин;
"++" — 2-4 клітини з МЯ на 1000 досліджених клітин;
"+++" — 2-7 клітин з МЯ на 1000 дослідж. клітин.
ків між показниками частоти клітин з МЯ та імуносупресії визначали за допомогою коефіцієнта асоціації Пірсона.
Результати досліджень та їх обговорення. У результаті аналізу всіх досліджуваних реакцій організму нами виявлено найбільш інформативні показники, характер і рівень яких за дії канцерогенної (БП) та токсичних сполук (фенолу, ацетону) в узагальненому вигляді наведено у таблиці 1.
При цьому за обох шляхів введення БП встановлено спільні закономірності: гено-токсичний ефект в усіх експериментальних тварин реєструється вже у перші дні експерименту (8 день) і зростає у подальшому протягом місяця; встановлено залежність числа клітин з МЯ від разової дози: максимальний ефект спостерігався за дії найбільшої дози
10,5 мкг, у той час як мінімальна доза 0,21 мкг ефекту не ви-
кликала; у подальшому між першим та третім місяцями спостерігалася стабілізація числа клітин з МЯ, навіть на дещо нижчому рівні.
Подібна динаміка прояву ге-нотоксичної дії залежно від сумарної дози, часу та тривалості впливу мала місце також за перорального введення БП.
Якщо розглядати імунологічні показники, то можна бачити, що у ранній період дії канцерогену (на кінець першого місяця) найбільш чутливим раннім показником імуносупресії, яка притаманна хімічним канцерогенам, є Т-клітинна ланка імунітету. Зі збільшенням тривалості дії БП до трьох місяців, крім того, приєднується супре-сія В-ланки імунітету (зменшення числа В-лімфоцитів).
Порівнюючи виявлені показники, можна побачити, що зростання генотоксичного ефекту (числа клітин з МЯ) протягом першого місяця супроводжувалося паралельним розвитком імуносупресії (зменшенням відносної кількості Т-лімфоци-тів) (табл. 1). Тобто ці два явища, які властиві дії хімічних канцерогенів, взаємопов'язані і мають односпрямований характер відносно канцерогенезу. Це підтверджують і результати кореляційного аналізу з використанням методу Пірсо-на, які свідчать про наявність достовірного зворотного кореляційного зв'язку між ними.
При цьому коефіцієнти кореляції становили для БП 10,5 мкг г=(-0,87) р<0,01; 2,1 мкг,
г=(-0,89) р<0,01 (нашкірні аплікації); для 0,1 мг, г=(-0,80) р<0,05 (пероральне введення).
При порівнянні результатів генотоксичних та патоморфо-логічних досліджень (табл. 2) можна бачити збільшення кількості клітин з МЯ у пізній період (шостий місяць) у тварин після нашкірних аплікацій, в яких патоморфологічно встановлено розвиток пролі-феративно-гіперпластичних змін та пухлин шкіри, тобто у цей час зростання генотоксич-ності було пов'язане не з дозою, а з морфологічними пе-редпухлинними змінами та пухлинами.
Аналогічні закономірності прояву генотоксичного ефекту відзначено також у разі перо-рального введення БП у період виникнення передпухлинних змін і пухлин у передшлунку експериментальних тварин за одинадцять і чотирнадцять місяців від початку досліду.
Водночас гематологічні та імунологічні показники не відрізнялися від виявлених у мишей інтактного контролю.
На відміну від канцерогену, за дії токсичних речовин (зокрема фенолу і ацетону) генотоксич-ний та канцерогенний ефекти не спостерігалися, а пригнічення Т- та В-ланок імунітету, факторів неспецифічної рези-
Таблиця 2
Показники генотоксичних та патоморфологічних змін за нашкірних аплікацій та перорального введення білим аутбредним мишам канцерогену (БП) і токсичних сполук
(ацетону, фенолу)
Шляхи введення Речовина Разова доза Ефект
Генотоксичний Канцерогенний
8, 9 день 22, 31 день 90, 95 день 6-14 місяців 6 місяців 11 місяців 14 місяців
Нашкірні аплікації БП 0,21 мкг 0 0 0 0 0 0 -
БП 2,1 мкг + +++ ++ ++++ Папіломи, рак шкіри Рак шкіри -
БП 10,5 мкг + +++ ++ ++++ Папіломи, рак шкіри - -
Ацетон 0,2 мл 0 0 0 0 0 0 -
Перо- рально БП 0,1 мг + +++ ++ ++++ 0 Папіломи передшлунка Папіломи передшлунка
Фенол 0,1 мг 0 0 0 0 0 0 0
ТЕГ 0,2 мл 0 0 0 0 0 0 0
Примітки: "0" — ефект не спостерігався;
"-" — дослідження не проводилися;
"+" — 1-2 клітини з МЯ на 1000 досліджених клітин; "++" — 2-4 клітини з МЯ на 1000досліджених клітин;
"+++" — 2-7 клітин з МЯ на 1000 досліджених клітин;
"++++" — 10-16 клітин з МЯ на 1000 досліджених клітин.
№ 2 2013 ЕотШОШШІ & ІІІ ЛІ ПІ 6
SUBSTANTIATION OF THE CRITERIA THE SET OF GENOTOXIC AND IMMUNOLOGICAL INDICATORS FOR RAPID ASSESSMENT OF ENVIRONMENTAL CARCINOGENS
Chernichenko I.A., Balenko N.V., Ostash O.M. The objective of the work. Performance of the complex of biological investigations by means of the study and determination of the spectrum of immunological reactions of the organism, pathomorphological and genotoxic changes in organs under the influence of carcinogens and toxic substances.
Materials and methods. The experiment were performed on white outbred mice. It included
2 series of investigation: I — dermal applications in various doses of benz/a/pyrene (BP) (0,21; 2,1;
10,5 mg); II — peroral administration of BP and phenol (a single dose of 0,1 mg).
Results. Parallel development and one-directed manifestation of genotoxic and immunological changes concerning carcinogenesis has been
determined. Presence of valid correlative connection between them is most expressed in the first month of the experiment. A dependence of these changes from a dose and time of carcinogene has been revealed. The obtained data were a base to consider genotoxic and immunological indices as possible early prognostic criteria for carcinogenesis at testing and screening of the chemical compounds and their doses. The main stages of the accelerated testing and hygienic regulation of the genotoxic carcino-genes have been formulated. They include the establishment of dose-effect dependence of the early genotoxic and immunosuppressive changes (suppression of the T-cell immunity, humoral system); determination of minimum effective and maximum uneffective doses; calculation of tentative safe exposure levels (TSEL) have been formulated. At the presence of carcinogenic potential data a scale for carcinogenic risk indices and determination of the PAC (permittable allowable concentration) on its base may be calculated.
стентності, які відзначалися у ранній період, мали транзитор-ний характер і вже наприкінці 3 місяця не проявлялися.
Отже, отримані результати — паралелізм розвитку та одно-спрямованість змін відносно канцерогенезу показників генотоксичного ефекту та імунологічних реакцій, наявність кореляційного зв'язку між ними у ранній період (протягом 1 місяця) лише за дії доз БП, що індукували пухлини шкіри та передшлунка, свідчать, на нашу думку, про можливість використання комплексу цих показників за дії досліджуваної речовини як ранніх критеріїв канцеро-генності генотоксичних хімічних сполук. При цьому експеримент доцільно проводити протягом 3-х місяців, що забезпечує, з одного боку, визначення характерних для хімічного канцерогенезу змін генотоксичного ефекту та імунних реакцій, а з іншого — диференціювання з токсичними речовинами.
Матеріали проведених досліджень стали підґрунтям для розробки методичних схем прискореного тестування вперше досліджуваних хімічних речовин на канцерогенність (рис. 1 ) та регламентації хімічних генотоксичних канцерогенів за наявності даних про канцерогенний потенціал (рис. 2).
Розроблені схеми передбачають проведення експерименту з метою виявлення до-зо-ефектних залежностей прояву комплексу ранніх геноток-сичних та супресивних змін імунної системи з наступною
оцінкою канцерогенних властивостей речовин та їхніх доз.
Використання зазначеного комплексу, на нашу думку, дозволяє перейти на новий рівень якості даних експериментальних досліджень як з точки зору прискорення та підвищення надійності тестування та скринінгу канцерогенних хімічних сполук з генотоксичним механізмом дії, так і прискореної оцінки канцерогенної активності їхніх доз. Запропоно-
вані системи оцінки можуть бути покладені в основу розробки методичних рекомендацій щодо прискореного нормування канцерогенонебезпечних речовин у різних елементах навколишнього середовища.
Висновки
1. У досліді на мишах за обох шляхів введення (нашкірних аплікацій та перорального введення) бенз/а/пірену та токсичних сполук (ацетону, фенолу) виявлено певні закономір-
-е
Рисунок 1
Етапи прискореного тестування генотоксичних канцерогенів
Вибір адекватного шляху впливу доз (концентрацій) та експериментальних тварин
Експериментальні дослідження тривалістю до трьох місяців
Визначення тропних органів шляхом застосування поліорганічного МЯ-тесту у разі відсутності таких даних
Визначення дозо-ефектних залежностей прояву ранніх генотоксичних та супресивних змін імунної системи (пригнічення Т-ланки імунітету, гуморальної тощо)
Оцінка речовин за комплексом критеріїв генотоксичності та імуносупресії
ності змін генотоксичних та імунологічних показників, прояв яких залежить від дози, тривалості спостереження і характеру діючих речовин.
2. За дії канцерогену встановлено зростання генотоксичного ефекту і супресію Т-ланки імунної системи протягом першого місяця, які характеризуються паралелізмом розвитку, односпрямованістю відносно канцерогенезу та наявністю достовірного зворотного кореляційного зв'язку між ними. У період між 1 та 3 місяцями спостерігалася стабілізація числа клітин з мікроядрами та поглиблення імуносупресії за рахунок пригнічення гуморальної ланки імунітету.
3. Динаміка виявлених змін за дії токсичних сполук (ацетону, фенолу) має інші закономірності проявів генотоксичності та імунологічних реакцій. Гено-
токсичний ефект був відсутнім, і кількість клітин з мікроядрами не відрізнялася від величин спонтанного рівня в інтактних тварин, а показники супресії Т-ланки та неспецифічної резистентності організму, що спостерігалися протягом першого місяця, мали транзиторний характер і за 3 місяці відновлювалися до рівнів, відзначених в інтактних тварин.
4. Виявлені відмінності у дії канцерогену та токсичних речовин дозволяють розглядати комплекс показників геното-ксичності та імуносупресії як можливі ранні критерії канце-рогенності хімічних речовин. Використання цього комплексу забезпечує можливість визначення канцерогенних властивостей хімічних сполук і диференціювання їх від токсичних сполук в експерименті протягом 3 місяців.
5. Отримані дані стали підґрунтям для розробки методичних схем прискореного тестування досліджуваних хімічних речовин на канцероген-ність та регламентації генотоксичних канцерогенів.
ЛІТЕРАТУРА
1. National Toxicology Program (NTP). Technical Report Series 1-567, 1976-2011. — http: // nttp.niehs.nih.gov.
2. Сычева Л.П. Оценка мутагенных факторов окружающей
среды полиорганным микроя-дерным тестом / Л.П. Сычева // Вестник Российской АМН. — 2006. — № 7. — С. 27-32.
3. Перелік речовин, продуктів, виробничих процесів, побутових та природних факторів, канцерогенних для людини / Гн 1.1.2.123. — К., 2006. — 16 с.
4. Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих микроя-дерным методом: метод. рек. / Межведомственный науч. совет по экологии человека и гигиене окружающей среды РФ.
— М., 2001. — 21 с.
5. Патент 54040 України, МПК G01N 1/28. Спосіб отримання ізольованих клітин з мікрояд-рами із епітелію шкіри / І.О. Черниченко, Н.В. Баленко, О.М. Осташ, Л.С. Соверткова.
— Заявл. 22.04.2010; опубл. 25.10.2010. — Бюл. № 20.
6. Рахманин Ю.А. Полиорган-ный микроядерный тест в эко-лого-гигиенических исследованиях / Под ред. Л.П. Сычевой, Ю.А. Рахманина. — М.: Гениус, 2007. — 150 с.
7. Новый подход к диагностике мутагенных и канцерогенных свойств окружающей среды / Л.П. Сычева, В.С. Журков, Ю.А. Рахманин [и др.] // Гиг и сан. — 2003. — № 6. — С. 87-91.
Надійшла до редакції 12.11.2012.
Рисунок 2
Основні етапи прискореного гігієнічного регламентування генотоксичних канцерогенів
Вибір адекватного шляху впливу доз концентрацій та експериментальних тварин
Експериментальні дослідження тривалістю до трьох місяців
Визначення дозо-ефектних залежностей прояву ранніх генотоксичних та супресивних змін імунної системи (пригнічення Т-ланки імунітету, гуморальної тощо)
Визначення мінімально ефективних доз та максимально недіючих доз
Розрахунок оперативно безпечних рівнів впливу (ОБРВ)
За наявності даних про канцерогенний потенціал проводити розрахунок шкали показників
канцерогенного ризику
Визначення ГДК (гранично допустимої концентрації) за показником допустимого
(прийнятного) ризику
