CC BY
26
УДК 504.4.054.001.5
Е. А. Тарановская, Н. А. Собгайда, Н. А. Влазнева
ОБЕЗЗАРАЖИВАНИЕ СТОКОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ ХИТОЗАНА
Ключевые слова: хитозан, обеззараживание стоков, антибактериальная активность.
Изучено антимикробное действие хитозана для обеззараживания стоков. Определена минимальная концентрация хитозана, подавляющая рост бактерий вида Escherichia coli- 0,03 %.
Keywords: chitosan, decontamination effluents, antibacterial activity.
Studied antimicrobial effect of chitosan for wastewater disinfection. To determine the minimum concentration of chitosan inhibits the growth of bacteria of the species Escherichia coli - 0,03 %
Хитозан был впервые синтезирован во второй половине XX века из хитиновой оболочки ракообразных. Практически сразу этот проект стал полностью закрытым не только в России, но и во всем мире по линии оборонных ведомств. Хитозану присвоили стратегический статус ввиду его беспрецедентных радиопротекторных свойств. Оказалось, что он полностью способен связывать в организме свободные радикалы, образующиеся под воздействием радиации. В армии солдаты получили в свои индивидуальные аптечки специальные хитозановые таблетки на случай ядерного удара противника. Но самое широкое и выдающееся применение хитозан получил при утилизации отработанного ядерного топлива как в оборонной, так и в других отраслях промышленности. Уникальные свойства хитина и хитозана привлекают внимание большого числа специалистов самых разных специальностей [1-4].
В настоящее время известно более 70 направлений использования хитина и хитозана в различных отраслях промышленности, наиболее важными из которых во всем мире признаны: медицина - в качестве средства борьбы с ожирением; связывания и выведения из организма холестерина, профилактики и лечения сердечнососудистых заболеваний, производства хирургических нитей, искусственной кожи, лекарственных форм антисклеротического, антикоагулянтного и антиартрозного действия, диагностики и лечения злокачественных опухолей и язвы желудка; пищевая промышленность - в качестве загустителя и структуры образования для продуктов диетического питания. Также к неоспоримым достоинствам хитозана относится его совершенная безопасность для человека и окружающей среды [5-7].
В результате многочисленных исследований к настоящему времени выявлены следующие биологические эффекты хитозана:
■ гиполипидемический и гипохолестеринемический (связывает и выводит из организма избыток жиров и холестерина);
■ гепатопротекторный (снижает нагрузку на печень);
■ регулирует кислотность желудочного сока, обладает противоязвенным действием;
■ антитоксический (связывает и выводит из организма токсичные элементы и кишечные токсины);
■ радиопротекторный (связывает и выводит радиоактивные изотопы);
■ иммуностимулирующий (стимулирует ряд функций иммунной системы, повышает устойчивость организма к инфекциям);
■ антиоксидантный (нейтрализует токсичные перекисные соединения);
■ антибактериальный и противовирусный (угнетает активность ряда микроорганизмов, защищает организм от некоторых вирусных инфекций) [8-10].
В лаборатории иммунологии НИИЭМ СО РАМН исследованы антибактериальные и антитоксические свойства хитозана и его производных. Показано, что низкомолекулярные хитозаны, обладают более выраженной антимикробной и антитоксической активностью по сравнению с исходным высокомолекулярным хитозаном [11].
Экспериментальная часть
В связи с тем, что многими исследователями доказано антимикробное и антитоксическое действие хитозана на организм человека, нами была предложена идея использовать данный материал для обеззараживания стоков.
Исследования проводились на базе кафедры «Экология» в Саратовском государственном техническом университете имени Гагарина Ю.А., которая имеет в своем составе учебную и научную биологическую лабораторию. В качестве тест-объекта использовали кишечную палочку (Escherichia coli).
Исследования проводились двумя методами. На первом этапе использовался диско-диффузионный метод (ДДМ).
При определении чувствительности по ДДМ, на поверхность агара в чашке Петри наносят бактериальную суспензию тестируемого
микроорганизма газоном (с помощью шпателя). Не позднее, чем через 15 минут после инокуляции на поверхность питательной среды наносят диски с 4% и 2 %-ными растворами хитозана. Аппликацию дисков проводят с помощью стерильного пинцета или автоматического диспенсера. Расстояние от диска до края чашки и между дисками должно быть
15-20 мм. Таким образом, на одну чашку диаметром 100 мм следует помещать не более 6 дисков с антибактериальным препаратом (АБП). Диски должны равномерно контактировать с поверхностью агара, для чего их следует аккуратно прижать пинцетом.
Непосредственно после аппликации дисков чашки Петри помещают в термостат кверху дном и инкубируют при температуре 35 °С в течение 18 ч.
После окончания инкубации чашки помещают кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет падал на них под углом в 45° (учет в отраженном свете). Диаметр зон задержки роста измеряют с точностью до 1 мм, предпочтительнее пользоваться штангенциркулем или кронциркулем. Данные экспериментов представлены в таблице 1 и на рисунке 1.
Рис. 1 - Зоны подавления роста кишечной палочки под влиянием 2 и 4 %-ных растворов хитозана
Таблица 1 - Зоны подавления роста кишечной палочки под влиянием 2 и 4 %-ных растворов хитозана, нанесенных дисками и диспенсером
Концентрация исследуемого раствора хитозана Диаметр зоны угнетения роста, мм
Диски Диспенсером
2% 2 1
4% 6 4
Чувствительность бактериальной культуры после измерения диаметров стерильных зон оценивалась согласно общепринятой методике (табл. 2) и показала, что Е. соймалоустойчивы к 2% и 4%-ным растворам хитозана. Данный факт подтверждает возможность использования растворовпоследнего для обеззараживания стоков.
На втором этапе для определения минимальной концентрации необходимого раствора хитозана для обеззараживания стоков использовали метод серийных разведений (макрометод). Тестирование проводили в объеме 1 мл каждого разведения антибактериального препарата АБП с конечной концентрацией исследуемого микроорганизма (Е.
co/i)~ 5-10 КОЕ/мл.
Питательный бульон для определения чувствительности разливают по 0,5 мл в каждую
пробирку. Количество последних определяют необходимым диапазоном разведений АБП и увеличивают на одну для постановки "отрицательного" контроля.
Таблица 2 - Степень чувствительности культуры к препаратам по зонам задержки роста
Диаметр зоны угнетения роста, мм Степень чувствительности •
0 устойчивый
1-15 малоустойчивый
16-25 чувствительный
Более 25 высокочувствительный
Рабочий раствор АБП готовится из основного раствора с использованием жидкой питательной среды. Концентрацию рабочего раствора рассчитывают исходя из необходимой максимальной концентрации в ряду серийных разведений, учитывая фактор разбавления препарата при последующей инокуляции. Затем рабочий раствор в количестве 0,5 мл при помощи микропипетки со стерильным наконечником вносят в первую пробирку, содержащую 0,5 мл бульона. Тщательно перемешивают и новым стерильным наконечником переносят 0,5 мл раствора АБП в бульоне во вторую пробирку, содержавшую первоначально 0,5 мл бульона. Эту процедуру повторяют, пока не будет приготовлен весь необходимый ряд разведений. Из последней пробирки 0,5 мл бульона удаляют.
Максимальная концентрация исследуемого раствора составляет 2 %, минимальная - 0,03 %
Таким образом, получают ряд пробирок с растворами АБП, концентрации которых отличаются в соседних пробирках в 2 раза.
Одновременно готовят дополнительные ряды серийных разведений АБП для тестирования контрольных штаммов. Серия разведений обязательно должна включать в себя пограничные концентрации и допустимые диапазоны МПК для контрольных штаммов.
Для инокуляции используют стандартную микробную суспензию, эквивалентную 0,5 по стандарту МакФарланда, разведенную в 100 раз на питательном бульоне, после чего концентрация микроорганизма^. свИв ней составит примерно
10 КОЕ/мл.
По 0,5 мл инокулюма вносят в каждую пробирку, содержащую по 0,5 мл соответствующего разведения АБП, и в одну пробирку с 0,5 мл питательного бульона без антибиотика ("отрицательный" контроль). Конечная
концентрация микроорганизма в каждой пробирке
достигнет необходимой - примерно 5-10 КОЕ/мл. Инокулюм должен быть внесен в пробирки с разведениями АБП не позднее 15-30 мин с момента приготовления.
Пробирки закрывают стерильными ватно-марлевыми пробками или металлическими колпачками и все пробирки с тестируемыми штаммами, кроме пробирки "отрицательный" контроль, инкубируют в обычной атмосфере при температуре 35°С в течение 16 ч. Пробирку "отрицательный" контроль помещают в холодильник при 4 °С, где хранят до учета результатов.
Для определения наличия роста микроорганизма пробирки с посевами просматривают в проходящем свете. Рост культуры в присутствии АБП сравнивают с референтной пробиркой ("отрицательный" контроль), содержащей исходный инокулюм и хранившейся в холодильнике. МПК определяют по наименьшей концентрации АБП, которая подавляет видимый рост микроорганизма (рис. 2).
Рис. 2 - Сравнение роста культуры в присутствии хитозана с референтной пробой: слева - контроль; справа - проба с содержанием 0,03 % р-ра хитозана
Для контроля качества приготовления суспензий рекомендуется проводить подсчет реальных колониеобразующих единиц путем высева образца приготовленного инокулюма на неселективные питательные среды.
После инокуляции чашки оставляют при комнатной температуре для подсыхания, далее переворачивают и инкубируют при температуре 35°С в течение 18ч. Результат посева представлен на рисунке 3.
Учет результатов проводят, поместив чашку на темную, не отражающую свет поверхность. За минимальную подавляющую концентрацию принимают таковую, вызвавшую полное ингибирование видимого роста. Для дифференцирования нежного роста от налета, оставшегося после инокулята, в ряде случаев целесообразно использовать увеличение. Появление единственной колонии на чашке с концентрацией на 1 разведение выше, чем явная МПК, можно не учитывать. Результат оценки антимикробной чувствительности имеет смысл учитывать только при подтверждении чистоты культуры.
Рис. 3 - Высев образца в концентрациях от 2 до 0,03 % в сравнении с «отрицательным» контролем: а) 2 %, б) 1 %, в) 0,5 %, г) 0,25 %, д) 0,125 %, е) 0,06 %, ж) 0,03 %, з) контроль
При постановке методов серийных разведений в агаре, необходимо проводить контроль роста культуры на чашке Петри с питательной средой, не содержащей АБП. Важнейшим требованием контроля качества является высев использованной для инокуляции суспензии на плотную неселективную среду для подтверждения чистоты культуры. Каждая партия тестируемых штаммов сопровождается внутренним контролем качества исследования с использованием соответствующих контрольных (референтных) штаммов.
В результате сравнения полученных высевов с «отрицательным» контролем видно, что
минимальной концентрацией, подавляющей видимый рост исследуемого микроорганизма, является концентрация, равная 0,03 %.
Для установления срока годности приготовленного раствора колбу, с содержащимся в ней 2 %-ным раствором хитозана выдерживали в течение 2 недель при температуре 18 оС. Дальнейший анализ проводился методом серийных разведений, описанным ранее. В результате сравнения полученных образцов с «отрицательной» пробой, можно сделать вывод, что антимикробная эффективность хитозанового раствора по
истечении двух недель не изменилась.
В результате проделанной работы подтверждена антибактериальная активность хитозанового раствора в отношении патогенных
микроорганизмов, определена минимальная концентрация хитозана, подавляющая рост микроорганизмов (0,03 %). В более ранних работах [12] было показано, что хитозан способен очищать стоки от взвешенных вещества, нефтепродуктов и
ионов тяжелых металлов. Если на предприятии используется целый комплекс, предназначенный отдельно для очистки стоков от каждого загрязняющего вещества, (нефтеловушки от нефтепродуктов, фильтры для взвешенных веществ, нейтрализация для ИТМ и хлорирование, озонирование, УФ обеззараживания для обеззараживания стоков), то использование хитозана может заменить несколько стадий процесса очистки одной технологическойоперацией.
Литература
1. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова, Хитин и хитозан: Получение, свойства и применение, Наука, Москва, 2002. 368 с.
2. В.Ф. Абдуллин, С.Е. Артёменко, Г.П. Овчинникова, Вестник СГТУ, 4(16), 1, 18-24 (2006).
3. В.Ф. Абдуллин, С.Е. Артеменко, О.С. Арзамасцев, Химические волокна, 6, 21-24 (2008).
4. Российское хитиновое общество - [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.chitin.ru/about.htm.
5. Л.С. Гальбрайх, Соросовский образовательный журнал, 7, 1, 51-56 (2001).
6. С.В.Немцев, Комплексная технология хитина и хитозана из панциря ракообразных, ВНИРО, Москва, 2006. 134 с.
7. Е.А. Плиско, Л.А. Нудьга, С.Н. Данилов, Высокомолекулярные соединения, 3,70-87 (2001).
8. S. Roller, N. Covill, Int. J. Food. Microbiol, 47, 1-2, 67-77 (1999).
9. А.Б.У. Kumar, M.C. Varadaraj, R.G. Lalitha, R.N. Thar-anathan, Biochim. Biophys. Acta, 1670, 1,137-146 (2004).
10. B.- K. Choi, K.-Y. Kim, Y.-J. Yoo,S.-J. Oh, Int. J.
Antimicrob, 18, 6, 553-557 (2001).
11. Л.А. Иванушко, Т.Ф. Соловьева , Т.С. Запорожец, Л.М. Сомова , В.И. Горбач, Тихоокеанский медицинский журнал, 1, 18-25 (2009).
12. Н.А. Собгайда,, В.Ф. Абдуллин, Н.А. Влазнева,Д.А. Лавренов, К.И. Шайхиева, Вестник Казанского технологического университета, 17, 14, 397-400 (2014).
© Е. А. Тарановская - соискатель каф. экологии и дизайна Энгельского технологического университета (филиал) Саратовского госуд. технол. ун-та; Н. А. Собгайда - д.т.н., доцент кафедры экологии и дизайна того же вуза, [email protected]; Н. А. Влазнева - студ. той же кафедры.
© E. A. Taranovskaya - Competitor of the Department of Ecology and Design Engels Technological University (branch) of Saratov State Technical University; N. A. Sobgayda - Ph.D., assistant professor of ecology and design of the same University, [email protected]; N. A. Vlazneva - student of the Department of ecology and design of the same University.
