CC BY
315
УДК 57.083.1+57.083.223+57.083.362.09.39+76.31.35+579.574
Д.И. Стом1, В.А. Быбин1, О.Ф. Вятчина1. А.В. Кононова2
О ВОЗМОЖНОСТИ УСИЛЕНИЯ ИММУННЫХ СВОЙСТВ ДОЖДЕВЫХ ЧЕРВЕЙ
1 Иркутский государственный университет (Иркутск) 2 Иркутский государственный педагогический университет (Иркутск)
С помощью метода дисков оценивали бактериостатическое действие целомической жидкости красного калифорнийского гибрида (Eisenia fetida Andrei Bouche) на микроорганизмы, разных групп. Показано, что целомическая, жидкость подавляет, рост. Pseudomonas аeruginosa, Bacillus thuringiеnsis, Staphylococcus sp. — условно патогенных штаммов — и. не влияет, на рост. и. развитие Yarrowia lipolytica и Rhodococcus erythropolis.
При. инокуляции червя, per os суспензией B. thuringiensis и. Staphylococcus sp. отмечали, активацию антимикробных свойств целомической жидкости в отношении B. thuringiensis. Максимальное снижение обсемененности кишечника дождевых червей фиксировали, при. 3-часовой экспозиции дождевых червей, инокулированныхперорально 0,03 мл 1,5% перекиси, водорода.
Ключевые слова: целомическая жидкость, дождевые черви, иммунитет
ABOUT THE OPPORTUNITY OF STRENGTHENING OF IMMUNE BEHAVIOUR OF EARTH WARMS
D.I. Stom1, V.A. Bibin1, O.F. Viatchina', A.V. Kononova2
11rkutsk State University, Irkutsk
2 Irkutsk State Pedagogic University, Irkutsk
The bacteriostatic influence of coelomic liquid, of Red. Californian, hybrid, on microorganisms of different groups (Eisenia fetida Andrei Bouche) was estimated, by disk method. It is shown, that coelomic liquid, suppresses the growth of Pseudomonas aeruginosa, Bacillus thuringiеnsis, Staphylococcus sp., which are conditionally pathogenic and doesn't affect on growth, and. development of Yarrowia lipolytica and. Rhodococcus erythropolis.
Under per os inoculating of earthworms by B. thuringiensis and. Staphylococcus sp suspension, the activation of antimicrobial characteristics of coelomic liquid, to B. thuringiensis was marked. The maximal decrease of contamination of earthworms' intestines was fixed after 3 hour expositions of earthworms per os inoculated, by 0, 03 ml of 1, 5 % hydrogen peroxides.
Key words: coelomic liquid, earthworms, immunity
Дождевые черви обладают уникальным природным иммунитетом, что позволяет им выживать при серьезном микробиологическом загрязнении среды обитания [6]. Из дождевых червей получают эффективные фармацевтические препараты [3 — 5]. Иммунная система дождевых червей подвержена значительным флюктуациям под влиянием различных факторов, в результате которых наблюдаются изменения концентраций биологически активных веществ целомической жидкости [6]. В связи с этим цель данного сообщения — изучение возможностей повышения антимикробных свойств дождевых червей для получения более эффективных фармацевтических препаратов на основе дождевых червей и снижение обсемененности кишечника дождевых червей.
МЕТОДИКА
Объектами исследования служили половозрелые особи красного калифорнийского гибрида (Eisenia fetida Andrei Bouche) и штаммы микроорганизмов, входящие в состав нефтеразрушающего препарата «Деворойл»: Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas aeruginosa, Yarrowia lipolityca (штаммы предоставлены И.А. Борзенковым), а также
энтомопатогенные штаммы Bacillus thuringiеnsis ssp. Alesti 6—12kc и Staphylococcus sp., выделенных
О.Ф. Вятчиной [2].
Бактериостатическое действие целомической жидкости дождевых червей и препаратов на их основе оценивали с помощью диско-диффузионно-го метода [1]. Целомической жидкостью пропитывали стерильные бумажные диски диаметром 6 мм. Препараты изготавливали по традиционным китайским рецептам: очищали кишечник и покровы дождевых червей многочисленными промываниями подкисленной водой. Затем живых червей разрезали на кусочки длинной 2 — 3 см с последующей сушкой при температуре 50 °С в течение 10 часов. Полученную массу перетирали в ступке до порошкообразного состояния. Данный порошок смешивали со стерильным физиологическим раствором в пропорции 1:7. Изготовленной суспензией порошка дождевых червей так же пропитывали стерильные бумажные диски.
Взятые штаммы использовали в качестве тест-культур для диско-диффузионного метода. Для усиления иммунных свойств, дождевых червей E. fetida инокулировали суспензиями B. thu-ringiеnsis или Staphylococcus sp., помещали в воду
охлажденную до +5 “С или нагретую до +38 “С на 5 минут, или наносили на кожные покровы червей суспензию 1-суточной культуры Staphylococcus sp. Введение штаммов микроорганизмов в кишечник дождевых червей осуществляли per os микроинъ-ектором в объеме 0,03 мл. Время инкубации культур в пищеварительном тракте дождевых червей варьировали от 30 минут до 5 часов. В качестве микроинъектора использовали инсулиновый шприц со спиленным острием иглы.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Целомическая жидкость дождевых червей в контроле проявляла ярко выраженную бактерио-статическую активность в отношении P. aeruginosa, Staphylococcus sp., B. thuringiensis. Значительно слабее целомическая жидкость подавляла рост Y. lipolityca, R. erythropolis (табл. 1).
При введении дождевым червям per os штаммов Staphylococcus sp., B. thuringiensis 6—I2 kc на-
блюдали усиление антимикробных свойств дождевых червей по отношению к инокулированным штаммам. Отмечаемый эффект зависел от длительности нахождения бактериальных культур Staphylococcus sp. или B. thuringiensis в кишечном тракте дождевого червя. Наибольший диаметр зоны угнетения роста газона (то есть максимальное антимикробное действие) наблюдали при часовой инкубации B. thuringiensis в черве. В наибольшей степени антимикробное действие целомической жидкости при инъекции в целомическую полость E. fetida суспензии Staphylococcus sp. фиксировали через 2 часа, а при введении бактерий per os микроинъектором через 3 часа (табл. 2, 3).
Препараты, активированные с помощью предварительного охлаждения, нагревания или конта-минирования дождевых червей со Staphylococcus sp., обнаруживали более высокие антибактериальные свойства, чем препараты, изготовленные из дождевых червей по традиционным прописям.
Таблица 1
Бактериостатическое действие целомической жидкости по отношению к различным штаммам
микроорганизмов
Тест-культура Диаметр зоны подавления роста, мм
P. aeruginosa 50 і 7,4
Staphylococcus sp 46 і 5,2
B. thuringiensis 12 і 1,В
Y. lipolityca 7 і 1,0
R. erythropolis -
Таблица 2
Бактериостатическое действие целомической жидкости по отношению к B. thuringiensis 6-12 ko
Длительность инкубации B. thuringiensis 6-12 kc в дождевом черве E. fetida, час Диаметр зоны подавления роста (целомическая жидкость на газонах с B. thuringiensis 6-12 kc), мм
0 (контроль) 10± 1,4
0,5 28 ± 4,2
1 40 ± 6,0
2 8 ± 1,2
3 20 ± 3,0
Таблица 3
Радиусы подавления роста Staphylococcus sp. на 2-е сутки культивирования газонов
Время инкубации Staphylococcus sp. в дождевом черве, час Инъекция Инокуляция
Диаметры зон подавления роста, мм
0 (контроль) 12 і 1,В 53 і 7,6
0,5 27 і 4,0 71 і 9,В
1 12 і 2,4 4В і 7,2
2 44 і 6,6 4В і 9,3
3 20 і 4,4 74 і 11,0
4 29 і 4,В 25 і 2,6
5 24 і 3,5 3В і 5,2
164
Экcпepиraeнтaльныe иccлeдoвaния в мєднцннє н бію^™»!
Таблица 4
Влияние различных концентраций перекиси водорода на количество гетеротрофных бактерий
в кишечнике дождевого червя
Отдел кишечника Концентрации перекиси водорода, %
титр, КОЕ/г
2 1 0 (контроль)
Передний 1,15 і 0,6 х 108 2,54 і 0,7 х 109 3,54 і 0,8 х 109
Средний 2,84 і 0,7 х 109 2,77 і 0,7 х 109 3,17 і 0,8 х 109
Задний 2,18 і 0,5 х 109 2,07 і 0,5 х 109 2,14 і 0,5 х 109
Таблица 5
Влияние 1,5% перекиси водорода и разного времени экспозиции на количество гетеротрофных
бактерий в кишечнике дождевого червя
Отдел кишечника Время экспозиции, час
титр, КОЕ/г
0,5 1 3 0 (контроль)
Передний 2,75 і 0,7 х 109 7,41 і 0,8 х 108 7,54 і 0,8 х 108 3,54 і 0,8 х 109
Средний 2,95 і 0,7 х 109 6,14 і 0,5 х 108 3,73 і 0,9 х 108 3,17 і 0,8 х 109
Задний 1,68 і 0,4 х 109 2,09 і 0,5 х 109 1,27 і 0,3 х 108 2,14 і 0,5 х 109
Образцы, полученные с помощью активации Staphylococcus sp., проявляли повышенное антимикробное действие по отношению к Staphylococcus sp. и к другим тест-культурам. Препараты, полученные после активации нагреванием, эффективнее контрольных препаратов, но в ряду активированных препаратов оказались самыми слабыми. Нелетальное охлаждение дождевых червей для получения препаратов является одним из самых эффективных и безопасных (с микробиологической точки зрения) способов усиления иммунных свойств дождевых червей.
Физиолого-химические, морфологические и тинкториальные признаки свидетельствуют о том, что доминирующая аутофлора кишечника красного калифорнийского гибрида представлена бактериями группы кишечной палочки. Две культуры относятся к роду Escherichia и две к роду Proteus.
Для снижения общей обсемененности кишечника красного калифорнийского гибрида использовали водные растворы перекиси водорода. В первой серии опытов на аутофлору кишечника
E. fetida воздействовали 0,03 мл 3% перекиси водорода. При пероральном введении 3% перекиси и 5-минутной экспозиции, двигательная активность червей существенно снижалась. При подсчете общего микробного числа в переднем отделе кишечника было выявлено две колонии, в среднем отделе выделено девять колоний микроорганизмов, все колонии относятся к группе кишечных палочек. В заднем отделе кишечника титр клеток прокариот был равен контролю. Вторая серия опытов заключалась в инокулировании червей 2% и 1% перекисью водорода и последующем асептическом вскрытии через пять минут, объем инокулята оставляли прежним. При введении 2% перекиси
водорода в переднем отделе кишечника титр жизнеспособных клеток прокариот уменьшился на порядок, в других отделах произошло незначительное изменение. Двигательная активность червей изменилась незначительно. Воздействие 1% перекиси не оказало сильного влияния на ОМЧ кишечного тракта червя (табл. 4). При введении 2% перекиси водорода поведение червей изменялось незначительно.
В последующих опытах объем инокулята оставляли прежним, а концентрацию перекиси водорода снизили до 1,5 %.
При 30-минутной экспозиции титр гетеротрофных бактерий снизился незначительно (табл. 5). Спустя час титр гетеротрофных бактерий в переднем и среднем отделах кишечника уменьшился на порядок. В заднем отделе кишечника не произошло снижения количества жизнеспособных клеток прокариот (табл. 5). После 3-часовой экспозиции отмечалось снижение титра клеток прокариот на порядок во всех отделах кишечника (табл. 5).
Следует отметить, что при воздействии перекиси водорода наблюдали уменьшение класса разнообразия гетеротрофных бактерий, выявляемых в кишечнике красного калифорнийского гибрида. При микробиологическом анализе кишечника выявлено 20 морфотипов. После введения перекиси водорода количество морфотипов значительно снизилось, так после 30-минутной экспозиции было обнаружено только 6 морфотипов. Таким образом, с помощью инокулирования Н2О2 удается снижать уровень обсеменения дождевых червей, а под влиянием некоторых штаммов микроорганизмов и некоторых других воздействий можно повышать бактериальные свойства препарата дождевых червей.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований № 05-04-97237.
Авторы признательны проф. Z. Sun, И.Н. Титову, И.Н. Жданову, В.В. Батурину за ценные советы и консультации, С.В. Полехиной, Ю.В. Оме-личкиной за помощь в проведении работ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Воробьев А.А. Медицинская и санитарная микробиология / А.А. Воробьев, Ю.С. Кривошеин,
В.П. Широбоков. — М.: Изд. центр «Академия», 2003. - 464 с.
2. Вятчина О.Ф. Штаммы Bacillus thuringiensis, выделенные при эпизоотии лиственничной мухи (Hylemyia laricicola) в Камчатской области / О.Ф. Вятчина // Сибирский экологический журнал. - 2004. - № 4. - С. 501 -506.
3. Вятчина О.Ф. Энтомопатогенные бактерии вида B. thuringiensis, циркулирующие в биоценозах Камчатки / О.Ф. Вятчина, Т.В. Завезенова // Оценка современного состояния микробиологических исследований в Вост.-Сиб. регионе: Материалы Росс. науч.-практ. конф., посвященной 100-летию со дня рождения проф. Е.В. Талалаева. - Иркутск, 2002. -
С. 13-18.
4. Нетрусов А.И. Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусов. - М.: Изд. центр «Академия», 2005. - 604 с.
5. Sun Z. Vermiculture and vermiprotein / Z. Sun // China Agricultural University Press, 2003. - 367 p.
6. Wang C. A Review for Antibacterial Immunity of the Earthworm / C. Wang, D. Zheng, Z. Sun // Дождевые черви и плодородие почвы: Материалы 2-й Международной научно-практической конференции. - Владимир, 2004. - С. 54.
